Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Resumo

Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

Resumo

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.

Introdução

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações^1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos^2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares⁴. O instrumento scans na temperatura, medir a quantidade de calor necessária para desnaturar a biomolécula na presença e na ausência de ligante. As termogramas resultantes são usadas para extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o ligante de ligação e de processos de dobramento. As informações fornecidas pelo DSC ou outras técnicas termodinâmicas são fundamentais para guiar o projeto das drogas segmentação biomoléculas^1,5,6,7,8. No entanto, a digitalização repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) pode ser problemático. Por exemplo, muitos compostos farmaceuticamente importantes sofrem rearranjo ou decomposição após a exposição prolongada a altas temperaturas^9,10,11, ou seja,eles são termolábeis. Análise de ligação interações por DSC normalmente exige várias digitalizações de frente e verso a fim de verificar a reprodutibilidade da termograma para análises termodinâmicas¹². Conversão térmica de um ligante inicial em uma forma secundária com características alteradas vinculação conduz a pronuncia-se diferenças na forma e posição de termogramas sucessivas, desde que a concentração do ligante inicial diminui com cada verificação enquanto o produtos de conversão térmica se acumulam. Esses conjuntos de dados não são passíveis de análises tradicionais.

Recentemente desenvolvemos um método de montagem global para datasets termolábil ligante DSC que produz o conjunto completo de parâmetros termodinâmicos que regem a dobradura biomolecular e vinculação de interações a partir de uma única experiência de ligante-limite referenciado para o termograma necessária para a biomolécula livre⁴. A análise reduz o tempo experimental e amostra exigido por ~ 10-fold em relação ao padrão de DSC de abordagens. Nós temos contabilizados para ligante conversão térmica por supondo que isto acontece durante a parte de alta temperatura de cada verificação onde a termograma não depende de concentração do ligante. Portanto, a concentração de ligante é uma constante dentro da parte da termograma que é usada para extrair os parâmetros termodinâmicos. Demonstrámos, além disso, como a constante de velocidade de conversão térmica de ligante pode ser obtido através da realização de um experimento de complementar com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura. Para sistemas onde a conversão térmica de ligante é menos dependente da temperatura (ou seja, sensivelmente ocorrendo em todas as temperaturas), a análise pode ser modificada para incluir a concentrações variáveis de ligante. Aqui vamos demonstrar este procedimento para o aptamer de DNA MN4 na presença da cocaína ligante termolábeis, que rapidamente se converte em benzoilecgonina em altas temperaturas (> 60 ° C). Quinino é usado como um controle negativo para thermolability de ligante não sofre conversão a estas temperaturas experimentais e também vincula a MN4. Descrevemos a aquisição de ligante termolábil DSC conjuntos de dados e sua análise rendendo parâmetros termodinâmicos e cinéticos da dobradura, ligação e ligante processos de conversão.

Protocolo

1. preparação da amostra

1. Purifica o desejado biomolécula¹³.
   Nota: Este protocolo usa comprada cocaína-ligação DNA aptamer MN4 após a troca contra 2 M NaCl três vezes seguido por três rodadas de água desionizada, utilizando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular 3 kDa.
2. Sintetizar e purificar ou comprar o desejado ligante termolábil¹³.
   Nota: MN4 vincula a cocaína de ligante termolábil. MN4 também vincula o quinino, que é usado como um controle negativo para thermolability de ligante a estas temperaturas experimentais.
3. Prepare amortecedores para diálise da biomolécula purificada e dissolução de ligantes (buffer de NaCl de fosfato de sódio e 140 mM de 20 mM, pH 7,4, para MN4 e ligantes usados aqui).
4. Dialize a biomolécula contra pelo menos 2 L de buffer usando a tubulação da diálise com 0,5 - 1,0 kDa Cut-off.
5. Filtre o buffer final (referido como trabalho buffer) através de um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer.
6. Pesar a massa desejada de ligantes e dissolvê-los no buffer de trabalho filtrados. Se as concentrações de ligante desejado requerem massas que são demasiado pequenas para pesar, fazer uma solução concentrada de ligante (10 x por exemplo).
   Nota: É fundamental que todos os experimentos de DSC utilizam a mesma reserva de trabalho para a amostra e ligante, ou seja, nunca realizar um experimento onde o ligante é dissolvido em um lote diferente de reserva de trabalho que a biomolécula porque isso poderá provocar o tampão artefatos de incompatibilidade nos dados.
7. Filtre a solução estoque biomolécula com um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer de trabalho.
8. Determinar a concentração de biomolécula por medidas de absorvância (260 nm para ácidos nucleicos como MN4 e 280 nm para proteínas).
9. Armazenar a biomolécula preparada e ligante em um frigorífico de 4 ° C (apropriado para MN4 e ligantes usados aqui) ou no -20 ou -80 ° C se a biomolécula e ligantes toleram o congelamento e a longo prazo de armazenamento é necessário. As soluções tampão, biomolécula e ligante em cima duma mesa desgaseificador (ver Tabela de materiais), previamente ao seu embarque para o DSC de Degas.
   Nota: Desgaseificação ajuda a prevenir a formação de bolhas no DSC em temperaturas mais altas. Bolhas de causam artefatos de sinal que obscurecem DSC pico formas e linhas de base.

2. DSC preparação

1. Desenrosque a pega pressão desde o DSC (ver Tabela de materiais).
2. Executar o tubo de silicone de reserva de trabalho e anexá-lo para o flange dianteira (abertura de metal) do capilar referência.
3. Crie uma ponte entre os capilares de referência e exemplo conectando o flange posterior de referência para o flange dianteira amostra.
4. Anexe um pedaço de tubo de silicone para o flange de amostra traseiro que corre para um balão de resíduos com uma linha de vácuo anexado.
5. Liga a linha de vácuo para liberar o DSC com 200 mL de tampão de trabalho.
6. Carrega o capilar de referência do DSC com buffer de trabalho. Anexe aproximadamente seções 3 a 5 cm de tubo de silicone para os flanges de referência capilar.
7. Inserir a ponta da pipeta de 1 mL para tubo de silicone do flange traseiro. 0,8 mL de tampão de trabalho com uma pipeta de desenhar e inserir a ponta da pipeta com tampão para tubo de silicone do flange dianteira de referência.
8. Pressione suavemente o êmbolo de pipeta até o buffer de trabalho através da tubulação de silicone frontal de passagem para o capilar de referência e até do flange traseiro anexado a ponta da pipeta. Pressione o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação de silicone da frente e, em seguida, solte o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação traseira de silício.
   1. Repita passando o buffer de trabalho e para trás para purgar o volume no capilar referência de bolhas.
      Nota: Normalmente, 10 passes da solução e para trás são suficientes para limpar quaisquer bolhas.
9. Tampe a ponta da pipeta traseira com o polegar e gentilmente puxe para cima com a ponta da pipeta traseira e dianteira pipeta para removê-los de flanges a referência com o tubo de silicone anexado.
10. Carrega o capilar de amostra com buffer de trabalho como em passos 2.6-2.9. Coloque uma tampa de plástico preta na traseira referência e flanges, deixando os flanges frontais descobertos da amostra.
11. Anexe o identificador de pressão.
12. Abra o software DSC (ver Tabela de materiais) e pressurizar o instrumento clicando o vermelho cima seta na parte superior da interface, uma vez que a leitura de energia está estabilizado; o poder do DSC é indicado em uma caixa na parte superior direita da interface juntamente com a temperatura do instrumento e a leitura da pressão.
    Nota: Monitor o poder ler como o DSC pressuriza. Mudanças no poder de mais de ~ 10 µW indicam a formação de bolhas nos capilares, que podem causar artefatos nos dados. As soluções devem ser removidas e desgaseificadas mais antes de continuar.
13. Equilibrar o DSC com buffer de trabalho através da realização de uma verificação direta e inversa. Na aba "Método Experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção de "Varredura" é seleccionada para executar o DSC no modo de verificação de temperatura.
    Nota: Parâmetros experimentais são a temperatura de varredura gama, taxa de varredura, tempo da equilibração de baixa e alta temperatura e número de varreduras.
    1. Na inserção de "Parâmetros de temperatura" sob a aba "Método Experimental", clique no botão para "Aquecimento". Digite 1 e 100 ° C para as temperaturas experimentais superiores e inferiores, 1 ° C/min para a taxa de varredura e 60 s para o período de equilíbrio.
    2. Clique no botão "Adicionar séries" sob o campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up (para um aquecimento e uma varredura de refrigeração) e marque a caixa "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "Okey"; os scans adicionados aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros para cada verificação são como desejado.
    3. Inicie o experimento, clicando no botão "jogar" verde na parte superior da interface. Navegue até a pasta desejada e um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up de entrada. Ver o progresso do experimento, clicando na guia "Dados" à direita da guia "Experimentar o método".

3. coletando ligante termolábil DSC Datasets

Nota: O procedimento mínimo consiste de cinco experimentos: experimentos de referência com e sem ligante de buffer (usado para subtração da linha de base, ver discussão), experiências com a enciclopédia biomolécula, a ligante-limite biomolécula, da amostra e o ligante-limite biomolécula com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura.

1. Execute experiências de referência para a subtração de linha de base de dados de exemplo. Recarregar o DSC com buffer de trabalho em ambos os capilares e coletar várias digitalizações de frente e verso em uma faixa de temperatura adequada no 1 ° C min^-1 com uma parte superior (alta temperatura) tempo da equilibração de 120 s.
   1. Exclua os scans de equilibração tampão anterior da parte inferior da interface destacando cada um individualmente e clicando no X vermelho no meio certo da interface. Adicione os novos exames, clicando no botão "Adicionar séries", 20 a entrar no campo para "Passos para adicionar" e marcando a caixa de "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique Okey e execute o experimento clicando no botão de play verde como acima.
   2. Repita os passos 3.1 - 3.1.1 com buffer de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter a referência experiências para o ligante (recolher dois experimentos separados usando 120 s e s 600 alta temperatura equilibração vezes respectivamente, para ser usado em adquirir a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis).
      Nota: A taxa de varredura utilizada aqui garante que o biomolécula em experimentos subsequentes em equilíbrio térmico nos scans de frente e verso (ver discussão). Varredura de taxas < 0,1-0,2 ° C min^-1 conduzir a termogramas barulhentas e não são aplicáveis em experimentos de DSC. As temperaturas devem estender do bem abaixo da temperatura de fusão da biomolécula gratuito para bem acima da temperatura de fusão da biomolécula ligand-saturado (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar a reprodutibilidade das varreduras (por exemplo, 10 para a frente e 10 scans reversos para 20 total é suficiente).
   3. Se usando vários ligantes (como cocaína e quinino), irrigue o DSC com 200 mL de tampão de trabalho (repetição da etapa 2.5) entre execuções a fim de remover o ligante de capilares e evitar a contaminação cruzada.
      Nota: É útil executar um experimento de replicar sobre a biomolécula livre depois de uma série de ligante-limite a fim de verificar se o ligante anterior absorve fortemente às paredes do capilares e não é adequadamente removido com tampão de lavagem. Se os termogramas para a enciclopédia biomolécula parecem ser deslocado para uma magnitude maior e a mais alta temperatura de desnaturação, depois de experimentar o ligand-limite, é provável que o ligante anterior ainda está presente no calorímetro após o enxaguamento. Remover o ligante adsorvido incubando os capilares com 20% Contrad-70 para 1 h a 60 ° C, com os tampões plásticos e pega pressão fora. No software DSC, altere o modo experimental para "Isothermal" sob o método Experimental Tab escolher 3.600 s para a duração e a 60 ° C para a temperatura isotérmica, com zero entrada para o tempo da equilibração. Clique em "Adicionar ao método Experimental". O experimento isotérmico aparece na parte inferior da tela. Após a conclusão, liberar o instrumento com água 2 L de água deionizada e repetir da etapa 2.5.
2. Execute experimentos de amostra usando a mesma DSC carregando o procedimento e parâmetros experimentais como a referência de varreduras. Para o conjunto de dados livre biomolécula, certifique-se de que o capilar de referência contém a reserva de trabalho enquanto o capilar amostra contém a biomolécula grátis na concentração desejada no buffer de trabalho.
   1. Para os experimentos de ligante-ligado, certifique-se que o ligante é no buffer no capilar referência de trabalho, e a biomolécula plus ligante é no trabalho buffer no capilar amostra. Limpe o sistema entre adições de ligantes diferentes como na etapa 2.5.
3. Realizar um experimento adicional com a biomolécula vinculado para o ligante termolábil onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 s e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos que passo 3.2.1.
   Nota: A duração do período de equilíbrio de alta temperatura para o experimento segundo ligante-limite é simplesmente escolhida para garantir que o ligante é esgotado mais rapidamente do que a experiência de tempo curto de equilibração. Se os picos de ligante-limite do primeiro experimento deterioração lentamente em função do número de verificação (por exemplo, as diferenças no maxima pico sucessivas são ≤ 0,5 ° C), estimar aumentos de 10 a 20 vezes no período de equilíbrio de alta temperatura para adequadamente, empobrecem o ligante durante o segundo experimento. O cálculo exacto da constante taxa para conversão de ligante requer que a segunda experiência tem mais rápido esgotamento do ligante em relação a primeira. As concentrações de ligante extraídas da análise global dos dois experimentos serão semelhantes e, portanto, inutilizável se a prostração de ligante não é suficientemente acelerada no segundo experimento.

4. processamento de dados

1. Aberto o DSC experimentar arquivos no software de análise de dados do DSC (ver Tabela de materiais) e exportar os dados de força bruta como planilhas.
2. Importe as planilhas contendo os dados de força bruta no software para montagem de dados.
3. Linha de base subtrair os dados de exemplo, subtraindo-se os dados de energia de reserva de liberdade e as experiências de ligante-limite biomolécula.
   Nota: Para o experimento de ligante termolábil, está diminuindo a concentração de ligante inicial com cada varredura. Portanto, é ideal para subtrair o scan de tampão 1 de varredura da amostra 1 e assim por diante. Nós achamos que os scans de tampão com cocaína não altera sensivelmente como procede a conversão de ligante e, portanto, uma varredura de amortecedor único ligante termolábil pode ser usada para subtrair todos os dados ligados a ligante termolábil.
4. Converta os dados de poder de amostra de base-subtraída a capacidade térmica.
   Nota: A conversão requer volume parcial a biomolécula específico, que pode ser estimado de^14,15,16. A equação para a conversão de energia a capacidade de calor tem sido descrito anteriormente¹⁷.

5. análise de dados

1. Globalmente se encaixam dataset equilibração curto tempo termolábil ligand-limite a capacidade de calor com um único conjunto de linha de base, concentração de ligante, dobramento e ligante vinculando parâmetros conforme descrito anteriormente,⁴.
2. Repita que o global apto para o equilíbrio de longo tempo dataset para calcular a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábil conforme descrito anteriormente,⁴.

Resultados

Dados representativos para o DSC ligante termolábeis são mostrados na Figura 1. A posição e a altura do pico do ligand-limite termolábil sucessivamente se desloca para baixo no sentido da biomolécula desacoplada como o ligante termolábil está esgotado com cada verificação (Figura 1a). O perfil de desnaturação livre é usado como uma referência para o ponto de extremidade de conversão termolábil ligante (

Discussão

Modificações e solução de problemas

Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente⁴. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula datase...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Chem Impex	#00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	71502
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763
Deioinized water for molecular biology	Millipore	H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters	VWR	CA28145-477
3 kDa centrifugal filters	Millipore	UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff	Spectrum Laboratories	131048
Silicon tubing	VWR	89068-474
Plastic DSC flange caps	TA Instruments	6111
DNA aptamer MN4	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine	Sigma Aldrich	C008
Quinine	Sigma Aldrich	22620
NanoDSC-III microcalorimeter	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70	VWR	89233-152