Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Resumen

Presentamos un protocolo para la caracterización rápida de biomolecular plegado y encuadernación interacciones con ligandos termolábiles utilizando calorimetría diferencial.

Resumen

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es una técnica poderosa para la cuantificación de parámetros termodinámicos que rigen biomolecular plegable y las interacciones de los Unión. Esta información es fundamental en el diseño de nuevos compuestos farmacéuticos. Sin embargo, muchos ligandos farmacéuticamente relevantes son químicamente inestables a las altas temperaturas utilizadas en análisis de DSC. Así, las interacciones de los Unión de medición es difícil porque las concentraciones de ligandos y convierte térmicamente los productos cambian constantemente dentro de la célula del calorímetro. Aquí, presentamos un protocolo usando ligandos termolábiles y DSC para obtener rápidamente información termodinámica y cinética de plegamiento, vinculante y ligando procesos de conversión. Hemos aplicado el método al aptámero de ADN MN4 que se une a la cocaína ligando termolábiles. Usando un nuevo análisis del ajuste global que tenga en cuenta para la conversión de ligando termolábiles, el conjunto completo de parámetros vinculantes y plegable se obtienen de un par de experimentos de DSC. Además, nos muestran que la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles puede obtenerse con sólo un conjunto de datos complementario de DSC. Se presentan las directrices para la identificación y análisis de datos de varios escenarios más complicados, incluyendo la agregación irreversible de la biomolécula, plegamiento lento, enlace lento y rápido agotamiento del ligand termolábil.

Introducción

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es un método eficaz para la cuantificación biomolecular vinculante y plegable interacciones^1,2,3. Los puntos fuertes de DSC incluyen su capacidad para aclarar vinculantes y mecanismos de plegamiento y rendir los correspondientes parámetros termodinámicos^2,3. Además, DSC puede realizarse en solución bajo condiciones fisiológicas cerca y no requiere de etiquetado de la biomolécula o ligando, por ejemplo, con fluoróforos, etiquetas de spin o isótopos nucleares⁴. El instrumento escanea en temperatura, midiendo la cantidad de calor necesaria para desnaturalizar las biomoléculas en presencia y en ausencia de ligando. Los termogramas resultantes se utilizan para extraer los parámetros termodinámicos que gobiernan el ligando vinculante y procesos de plegamiento. La información proporcionada por DSC u otras técnicas termodinámicas es fundamental para orientar el diseño de fármacos dirigidos a biomoléculas^1,5,6,7,8. Sin embargo, la exploración repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) puede ser problemático. Por ejemplo, muchos compuestos farmacéuticamente importantes someterse a cambio o descomposición sobre la exposición sostenida a altas temperaturas^9,10,11, es decir, que son termolábiles. Examen de enlace las interacciones por DSC normalmente requiere múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás con el fin de verificar la reproducibilidad de la termografía para el análisis termodinámico¹². Conversión térmica de un ligando inicial a una forma secundaria con características de atascamiento alterado conduce a pronunciadas diferencias en la forma y posición de los termogramas sucesivas, puesto que la concentración del ligando inicial disminuye con cada barrido mientras que la se acumulan productos de conversión térmica. Estos conjuntos de datos no son susceptibles de análisis tradicionales.

Recientemente hemos desarrollado un método de ajuste global para datasets termolábiles ligando DSC que el conjunto completo de parámetros termodinámicos que gobiernan el plegamiento de biomolecular y vinculante de las interacciones de un solo experimento ligando enlazado hace referenciada a la Termograma de necesarias para el libre biomoléculas⁴. El análisis reduce el tiempo experimental y la muestra necesaria por ~ 10 veces en comparación con métodos estándar de DSC. Hemos representaron para ligando conversión térmica asumiendo esto sucede durante la parte de alta temperatura de cada exploración donde el termograma no depende de la concentración de ligando. Por lo tanto, la concentración de ligando es una constante dentro de la porción del termograma que se utiliza para extraer parámetros termodinámicos. Además demostramos cómo puede obtenerse la constante de velocidad para la conversión térmica ligando mediante la realización de un experimento complementario con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura. Para sistemas donde la conversión termal ligando es menos dependiente de la temperatura (es decir, que ocurre apreciable en todas las temperaturas), el análisis puede ser modificado para incluir las concentraciones de ligando variable. Aquí demostramos este procedimiento para el aptámero de ADN MN4 en presencia de la cocaína ligando termolábiles, que rápidamente se convierte en benzoylecgonine a altas temperaturas (> 60 ° C). La quinina se utiliza como un control negativo para thermolability ligando ya que no sufre conversión a estas temperaturas experimentales y también se une a MN4. Describimos la adquisición de ligando termolábiles DSC conjuntos de datos y su análisis, obtención de parámetros termodinámicos y cinéticos de la plegable, vinculante y ligando procesos de conversión.

Protocolo

1. preparación de la muestra

1. Purificar la biomolécula deseado¹³.
   Nota: Este protocolo usa comprados cocaína vinculante ADN aptámeros MN4 después de intercambiar contra 2 NaCl M tres veces seguido por tres rondas de agua desionizada utilizando un filtro centrífugo con una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa.
2. Sintetizar y purificar o comprar la deseada ligando termolábiles¹³.
   Nota: MN4 se une la cocaína ligando termolábiles. MN4 también se une a la quinina, que se utiliza como un control negativo para thermolability ligando a estas temperaturas experimentales.
3. Preparación de buffers para diálisis de la biomolécula purificada y la disolución de los ligandos (20 mM de fosfato de sodio y 140 mM de tampón NaCl, pH 7,4, MN4 y los ligandos utilizados aquí).
4. Dializan biomoléculas contra al menos 2 L de tampón utilizando tubos de diálisis con 0,5 - 1,0 kDa corte.
5. Filtrar el búfer final (denominado buffer de trabajo) a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón.
6. Pesar las masas deseadas de los ligandos y disolver en buffer de trabajo filtrada. Si las concentraciones de ligando deseado requieren masas que son demasiado pequeñas para pesar exactamente, hacer una solución madre concentrada ligando (10 x por ejemplo).
   Nota: Es fundamental que todos los experimentos de DSC utilizan el mismo buffer de trabajo para la muestra y ligando, es decir, nunca realice un experimento donde el ligando se disuelve en un lote diferente de tampón de trabajo que las biomoléculas ya que esto causará buffer artefactos de desajuste en los datos.
7. Filtrar la solución stock de biomoléculas a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón de trabajo.
8. Determinar la concentración de biomoléculas por medidas de absorbancia (260 nm por ácidos nucleicos como el MN4 y 280 nm para las proteínas).
9. Guarde las biomoléculas preparado y ligando en un refrigerador de 4 ° C (apto para MN4 y los ligandos utilizados aquí), o -20 o -80 ° C si la biomolécula y ligandos soportar almacenamiento de congelación y a largo plazo se requiere. Degas las soluciones tampón, biomoléculas y ligando en una mesa degasser (véase Tabla de materiales) antes de cargar el DSC.
   Nota: Desgasificación ayuda a prevenir la formación de burbujas en el DSC en temperaturas más altas. Las burbujas causan artefactos de señal que las líneas de base y formas de pico de DSC.

2. preparación de DSC

1. Desenrosque el mango de presión de la DSC (véase Tabla de materiales).
2. Ejecutar tubos de silicio desde el buffer de trabajo y fije la brida delantera (abertura de metal) de los capilares de la referencia.
3. Crear un puente entre los capilares mediante la conexión de la brida posterior referencia a la brida frontal muestra y muestra.
4. Coloque un pedazo de tubo de silicon en la brida posterior muestra que va a un frasco de residuos con una línea de vacío conectada.
5. Abra la línea de vacío para eliminar el DSC con 200 mL de buffer de trabajo.
6. Cargar el capilar de la referencia del DSC con buffer de trabajo. Coloque aproximadamente secciones 3-5 cm de tubo de silicon en las pestañas capilar de referencia.
7. Inserte una pipeta de 1 mL en tubos de silicona de la brida posterior. Dibujar 0,8 mL de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con el tampón en tubo de silicio de la brida frontal referencia.
8. Presione suavemente el émbolo de la pipeta hasta pasar el buffer de trabajo a través del tubo frontal del silicio en el capilar de referencia y hacia la brida posterior unida una punta de pipeta. Presione el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona frontal, luego suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona trasera.
   1. Repita el paso el buffer de trabajo hacia adelante y hacia atrás para purgar el volumen en el capilar de referencia de burbujas.
      Nota: Generalmente, 10 pasos de la solución hacia adelante y hacia atrás son suficientes para eliminar cualquier burbuja.
9. La tapa la punta trasera con el pulgar y tire suavemente hacia arriba en la punta trasera y delantera pipeta para sacarlos de las pestañas de referencia con el tubo de silicona Unido.
10. Cargar el capilar de muestras con tampón de trabajo como en los pasos de 2.6-2.9. Coloque un tapón de plástico negro en la referencia posterior y rebordes, dejando las pestañas frente descubiertas de la muestra.
11. Coloque la manija de presión.
12. Abra el software de DSC (véase Tabla de materiales) y Presurice el instrumento haciendo clic en el rojo encima de la flecha en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de la energía se ha estabilizado; el poder de la DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz junto con la temperatura del instrumento y lectura de la presión.
    Nota: Monitor que el poder de la lectura como el DSC se presuriza. Cambios en la alimentación de más de ~ 10 μW indican la formación de burbujas en los tubos capilares, que pueden causar artefactos en los datos. Las soluciones deben ser quitadas y desgasificadas más antes de continuar.
13. Equilibre la DSC con tampón de trabajo mediante la realización de una exploración hacia adelante y hacia atrás. En la pestaña "Método Experimental" en el lado izquierdo de la pantalla, asegúrese de que está seleccionada la opción "Exploración" para ejecutar el DSC de temperatura modo de exploración.
    Nota: Parámetros experimentales son la temperatura, gama, velocidad de lectura, tiempo de equilibrado de baja y alta temperatura y número de análisis de la exploración.
    1. En el recuadro de "Parámetros de temperatura" en la pestaña "Método Experimental", haga clic en el botón para "Calentar". Entre 1 a 100 ° C para las temperaturas experimentales superiores e inferiores, 1 ° C/min para la frecuencia de barrido y 60 s para el período de equilibrio.
    2. Haga clic en el botón "Añadir Series" bajo el campo de entrada para el período de equilibrio. Introduzca 2 en el campo "Los pasos para agregar" en la ventana emergente (para una calefacción y una refrigeración exploración) y marque la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa". Haga clic en "Aceptar"; el análisis agregados aparecen en la parte inferior de la interfaz. Compruebe que los parámetros para cada análisis como deseado.
    3. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón verde de "play" en la parte superior de la interfaz. Desplácese hasta la carpeta deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Ver el progreso del experimento haciendo clic en la ficha "Datos" a la derecha de la pestaña "Método de experimento".

3. recoger datos de DSC ligando termolábil

Nota: El procedimiento mínimo consiste en cinco experimentos: experimentos de referencia con y sin ligand del almacenador intermediario (utilizado para la sustracción de la línea de base, ver discusión), experimentos con las biomoléculas gratis, la biomolécula ligando enlazado, la muestra y el biomoléculas de ligando enlazado con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura.

1. Ejecutar experimentos de referencia para restar en base de los datos de ejemplo. Recargar la DSC con tampón de trabajo en ambos tubos capilares y recoger múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás sobre un rango de temperatura adecuado en 1 ° C min^-1 , con una parte superior (alta temperatura) tiempo de equilibrado de 120 s.
   1. Eliminar los anteriores buffer equilibrado análisis de la parte inferior de la interfaz destacando cada uno individualmente y haciendo clic en la X roja a la mitad derecha de la interfaz. Clic en el botón "Añadir Series", escriba 20 en el campo para "Pasos para añadir" y marcar la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa" para agregar las nuevas exploraciones. Haga clic en aceptar y ejecutar el experimento haciendo clic en el botón de play verde que el anterior.
   2. Repita los pasos 3.1 - 3.1.1 con tampón de trabajo con la concentración de ligando en ambos vasos capilares para obtener la referencia de experimentos para el ligando (recoger dos experimentos separados 120 s y 600 s alta temperatura equilibrado veces respectivamente, para ser utilizado en la adquisición de la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles).
      Nota: El tipo de análisis utilizado aquí garantiza que las biomoléculas en posteriores experimentos en equilibrio térmico en las exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás (ver discusión). Analizar las tasas < 0.1-0.2 ° C min^-1 conducen a termogramas ruidosos y no son aplicables en los experimentos de DSC. Las temperaturas deben extenderse desde bien abajo la temperatura de fusión de la biomolécula gratis a muy superior a la temperatura de fusión de biomoléculas saturado de ligando (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar la reproducibilidad de los análisis (por ejemplo, 10 adelante y exploraciones inversas 10 20 total es suficiente).
   3. Si utiliza múltiples ligandos (como la cocaína y quinina), enjuague la DSC con 200 mL de tampón de trabajo (repetición del paso 2.5) entre tramos para quitar el ligando de los capilares y evitar la contaminación cruzada.
      Nota: Es útil realizar un experimento de replicación en la biomolécula libre después de una carrera de ligando enlazado para comprobar si el ligando anterior adsorbe fuertemente a las paredes capilares y no se elimina adecuadamente con tampón de lavado. Si los termogramas de las biomoléculas libre parecen ser cambiado de puesto a una magnitud mayor y una temperatura de desnaturalización después de experimentar el límite de ligando, es probable que el ligando anterior todavía está presente en el calorímetro después del lavado. Quitar el ligando adsorbido por incubación de los tubos capilares con un 20% Contrad 70 por 1 h a 60 ° C con presión asa de los tapones de plástico. En el software de DSC, cambiar el modo experimental a "Isotérmica" en la ficha método Experimental elegir 3.600 s de duración y 60 ° C para la temperatura ambiente, con cero en el tiempo de equilibrado. Haga clic en "Añadir al método Experimental". El experimento isotermo aparece en la parte inferior de la pantalla. Después de la terminación, lave el instrumento con agua 2 L desionizada y repita desde el paso 2.5.
2. Ejecutar experimentos de muestra utilizando la misma DSC carga procedimiento y parámetros experimentales como la referencia de análisis. Para el conjunto de datos libre de biomoléculas, asegúrese de que el capilar de referencia contiene el buffer de trabajo mientras que el capilar de la muestra contiene la biomolécula libre en la concentración deseada en buffer de trabajo.
   1. Para los experimentos de ligando enlazado, asegúrese de que el ligando se encuentra en el buffer de trabajo en el capilar de referencia y la biomolécula más ligando es en buffer de trabajo en el capilar de la muestra. Limpie el sistema entre adiciones de diferentes ligandos como en el paso 2.5.
3. Realizar un experimento adicional con las biomoléculas ligada al ligando termolábil donde el período de equilibrio de alta temperatura se aumenta a 600 s y todos los otros parámetros experimentales son las mismas que paso 3.2.1.
   Nota: La duración del periodo de equilibrado de alta temperatura para el experimento segundo ligando enlazado es elegida simplemente para asegurarse de que el ligando es agotado más rápidamente que el experimento de equilibrio corto tiempo. Si los picos ligando enlazado desde el primero experimentan decaimiento lentamente en función del número de análisis (por ejemplo, las diferencias en maxima pico sucesivas son ≤ 0,5 ° C), aumenta de 10 a 20 veces en el periodo de equilibrado de alta temperatura a fin de estimar adecuadamente agotan el ligando durante el segundo experimento. El cálculo exacto de la constante de velocidad para la conversión de ligando requiere que el segundo experimento tiene agotamiento más rápido de ligando con respecto a la primera. Las concentraciones de ligando extraídas del análisis global de los dos experimentos serán similares y por lo tanto inutilizable si el agotamiento del ligando no se acelera suficientemente en el segundo experimento.

4. procesamiento de datos

1. Abierto el DSC experimentar archivos en el software de análisis de datos de DSC (véase Tabla de materiales) y exportar los datos de potencia bruta como hojas de cálculo.
2. Importar las hojas de cálculo que contiene los datos de potencia en software para ajuste de datos.
3. Línea de base restar los datos de la muestra restando los datos de la potencia de búfer y ligando enlazado biomoléculas experimentos.
   Nota: Para el experimento de ligando termolábiles, la concentración de ligando inicial disminuye con cada barrido. Por lo tanto, es ideal para restar la exploración búfer 1 del análisis de la muestra 1 y así sucesivamente. Hemos encontrado que las exploraciones de búfer con la cocaína no cambian apreciablemente como procede de la conversión de ligando y por lo tanto, una exploración de búfer ligando termolábil solo puede utilizarse para restar todos los datos de ligando enlazado termolábiles.
4. Convertir los datos de potencia muestra resta base para capacidad de calor.
   Nota: La conversión requiere volumen específico parcial de biomoléculas, que puede ser unos^14,15,16. La ecuación para la conversión de energía a la capacidad de calor ha sido descrito previamente¹⁷.

5. Análisis de datos

1. A nivel mundial ajuste equilibrado corto tiempo termolábiles ligando enlazado calor capacidad dataset con un conjunto único de base, la concentración de ligando, plegable y ligando vinculante parámetros tal como se describe anteriormente⁴.
2. Repita el que ajuste global del conjunto de datos de tiempo de mucho equilibrio para calcular la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles como se describió anteriormente⁴.

Resultados

Datos representativos para el DSC ligando termolábiles se muestran en la figura 1. La posición y altura del pico ligando enlazado termolábil sucesivamente cambios hacia la de las biomoléculas como el ligando termolábil se agota con cada exploración (Figura 1a). El perfil de desnaturalización libre se utiliza como referencia para el punto final de conversión ligando termolábiles (Figura 1b). ...

Discusión

Modificaciones y la resolución de problemas

El información de los análisis de montaje global utilizado en la figura 1 y figura 2 ha sido descrito previamente⁴. Aquí, describimos aspectos prácticos de la realización y análisis de experimentos de unión de DSC con ligandos termolábiles. Tenga en cuenta que una base de DSC obtenidos para el ligando termolábil solo se resta del ligando + co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Chem Impex	#00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma Aldrich	71502
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9763
Deioinized water for molecular biology	Millipore	H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters	VWR	CA28145-477
3 kDa centrifugal filters	Millipore	UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff	Spectrum Laboratories	131048
Silicon tubing	VWR	89068-474
Plastic DSC flange caps	TA Instruments	6111
DNA aptamer MN4	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine	Sigma Aldrich	C008
Quinine	Sigma Aldrich	22620
NanoDSC-III microcalorimeter	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software	TA Instruments	http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70	VWR	89233-152