تطبيق الآلي صورة موجهة المشبك التصحيح لدراسة الخلايا العصبية في شرائح الدماغ

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء التلقائية الموجهة تصويرا التصحيح المشبك التجارب باستخدام نظام وضعت مؤخرا للمعايير في المختبر الكهربية المعدات.

Abstract

كله خلية التصحيح المشبك هو طريقة الذهب القياسية لقياس الخصائص الكهربائية للخلايا واحدة. ومع ذلك، يبقى في المختبر التصحيح المشبك تقنية صعبة وانخفاض الإنتاجية بسبب تعقيدها والاعتماد العالي على تشغيل المستخدم والسيطرة عليها. هذه المخطوطة يدل على نظام التوجيه التلقائي المشبك صورة موجهة لفي المختبر خلية كاملة التصحيح المشبك التجارب في شرائح الدماغ الحادة. يقوم نظامنا بتنفيذ خوارزمية تستند إلى رؤية الكمبيوتر للكشف عن الخلايا فلورزنتلي المسمى واستهدافها لتصحيح التلقائي بالكامل باستخدام ميكرومانيبولاتور والسيطرة على ضغط ماصة الداخلية. العملية بأكملها مؤتمتة للغاية، مع الحد الأدنى من متطلبات التدخل البشري. يتم توثيق المعلومات التجريبية في الوقت الحقيقي، بما في ذلك المقاومة الكهربائية والضغط الداخلي ماصة، إلكترونيا للتحليل في المستقبل ولتحسين أنواع الخلايا المختلفة. على الرغم من أن يتم وصف نظامنا في سياق البراي الحادن التسجيلات شريحة، ويمكن أيضا أن تطبق على المشبك التصحيح الآلي الموجهة الصورة من الخلايا العصبية فصلها، والثقافات شريحة عضوي النمط، وغيرها من أنواع الخلايا غير العصبية.

Introduction

وقد وضعت تقنية التصحيح المشبك لأول مرة من قبل نهر وساكمان في 1970s لدراسة القنوات الأيونية من الأغشية المنشطة ¹ . ومنذ ذلك الحين، تم تطبيق لقط التصحيح لدراسة العديد من المواضيع المختلفة على مستوى الخلوية، متشابك، ودائرة، سواء في المختبر وفي الجسم الحي في العديد من أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا العصبية، العضلية، البويضات القيطم، والليبوزومات الاصطناعية ² . هذه العملية تنطوي على تحديد الصحيح واستهداف خلية من الفائدة، والتحكم ميكرومانيبولاتور معقدة لنقل ماصة التصحيح على مقربة من الخلية، وتطبيق الضغط الإيجابي والسلبي إلى ماصة في الوقت المناسب لإنشاء رقعة ضيقة ضيق، وكسر في إنشاء تكوين خلية كاملة التصحيح. وعادة ما يتم إجراء التصحيح اليدوي يدويا ويتطلب تدريبا مكثفا لإتقان. حتى بالنسبة للباحث من ذوي الخبرة مع التصحيحالمشبك، ونسبة نجاح منخفضة نسبيا. في الآونة الأخيرة، وقد بذلت عدة محاولات لأتمتة التجارب التصحيح المشبك. وقد تطورت استراتيجيتان رئيسيتان لتحقيق الأتمتة: زيادة معدات التصحيح القياسية المشبك لتوفير التحكم الآلي لعملية الترقيع وتصميم المعدات والتقنيات الجديدة من الألف إلى الياء. الاستراتيجية السابقة قابلة للتكيف مع الأجهزة الموجودة، ويمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات المشبك التصحيح، بما في ذلك في الجسم الحي التصحيح التصحيح أعمى ^{3 ، 4 ، 5} ، في المختبر التصحيح المشبك من شرائح الدماغ الحادة، الثقافات شريحة عضوي النمط، والخلايا العصبية فصلها المستزرعة ⁶ . فإنه يتيح استجواب الدوائر المحلية المعقدة باستخدام ميكرومانيبولاتورس متعددة في وقت واحد ⁷ . طريقة التصحيح مستو هو مثال على استراتيجية التنمية الجديدة، والتي يمكن تحقيق الإنتاجية العالية في وقت واحد صأتش المشبك من الخلايا في تعليق لأغراض فحص المخدرات ⁸ . ومع ذلك، فإن طريقة التصحيح مستو لا ينطبق على جميع أنواع الخلايا، وخاصة الخلايا العصبية مع عمليات طويلة أو الدوائر سليمة تحتوي على اتصالات واسعة. وهذا يحد من تطبيقه لرسم الخرائط الدوائر المعقدة من الجهاز العصبي، وهو ميزة رئيسية للتكنولوجيا المشبك التصحيح التقليدية.

قمنا بتطوير نظام بأتمتة عملية التصحيح اليدوي المشبك في المختبر عن طريق زيادة الأجهزة التصحيح القياسية المشبك. نظامنا، أوتوباتشر إيغ، يوفر التلقائي ماصة المعايرة، وتحديد هوية الخلايا الفلورية، والتحكم الآلي للحركة ماصة، التلقائي كامل خلية الترقيع، وتسجيل البيانات. يمكن للنظام تلقائيا الحصول على صور متعددة من شرائح الدماغ في أعماق مختلفة. وتحليلها باستخدام رؤية الكمبيوتر. واستخراج المعلومات، بما في ذلك إحداثيات الخلايا فلورزنتلي المسمى. ويمكن أن تكون هذه المعلومات بعد ذلكتستخدم لاستهداف وتصحيح الخلايا تلقائيا من الفائدة. البرنامج مكتوب بلغة بيثون، وهي لغة برمجة حرة ومفتوحة المصدر، تستخدم عدة مكتبات مفتوحة المصدر. وهذا يضمن إمكانية الوصول إلى الباحثين الآخرين ويحسن استنساخ ودقة التجارب الكهربية. يحتوي النظام على تصميم وحدات، بحيث يمكن بسهولة أن تكون الأجهزة الإضافية متداخلة مع النظام الحالي أظهرت هنا.

Protocol

1. إعداد النظام

1. إنشاء وحدة التحكم في الضغط.
   1. تجميع وحدة التحكم في الضغط وفقا لخريطة الدائرة ( الشكل 1 ). لحام الأجزاء اللازمة على لوحة الدوائر المطبوعة (بب) المصنعة وفقا لخطط الدوائر الكهربائية ( الشكل 1B ). استخدام المقاومات القياسية، والمصابيح، وأكسيد المعادن أشباه الموصلات الترانزستورات تأثير الحقل (موسيتس)، والمكثفات، وموصلات (انظر جدول المواد ). لحام الملف اللولبي صمامات على ثنائي الفينيل متعدد الكلور. قم بتوصيل مضخة الهواء وأجهزة استشعار ضغط الهواء إلى الكلور مع الأسلاك الكهربائية.
      ملاحظة: يجب أن يستغرق حوالي 2 ساعة لبناء وحدة التحكم في الضغط مع جميع الأجزاء اللازمة المتاحة.
2. ربط الحصول على البيانات الثانوية (داق) المجلس.
   1. توصيل مخرجات البيانات من لوحة الدوائر المطبوعة إلى مجلس داق، الجدول التالي.
      ملاحظة: مجلس داق فيلl تشغيل في "وضع واحد المنتهية." خريطة الميناء يمكن العثور عليها في دليل المستخدم (انظر جدول المواد ).
   2. قم بتوصيل "عين بيأر S" إلى واحدة من قنوات الإدخال التناظرية (أي) و "R-غر" إلى واحدة من الأسباب التناظرية على لوحة داق الثانوية.
   3. توصيل الإخراج الأساسي من مكبر للصوت إلى واحدة من القنوات منظمة العفو الدولية والأرض إلى الأرض التناظرية من مجلس داق الثانوي.
      مالحظة: ميكن استخدام كابل بنك قياسي لتوصيل املخرج األويل من مكبر الصوت.
   4. قطاع الطرف الآخر وربط إشارة إيجابية ( أي النحاس الأساسية) لقناة منظمة العفو الدولية والأرض ( أي سلك رقيقة حول جوهر) إلى الأرض التناظرية. كرر هذه الخطوة لقناة ثانية إذا تم استخدام أكثر من قناة تصحيح واحدة.
      ملاحظة: سيتم تكوين المدخلات التناظرية إلى لوحة داق في الخطوات اللاحقة.
   5. توصيل الطاقة إلى انتاج الطاقة من مجلس داق الثانوي. استخدم طاقة 12 فولت منفصلةيورك للمضخة.
3. ربط الأنابيب.
   1. قم بتوصيل مضخة الهواء والصمامين وفقا للجدول 2 . استخدام موصل 3-واي لتوصيل أنابيب لينة من صمام 2 منفذ أعلى، ومستشعر الضغط، وحامل ماصة في الخطوة الأخيرة.
   2. إضافة آخر موصل 3-الطريق إلى أنابيب متصلة حامل ماصة إذا تم استخدام اثنين من الماصات. التبديل يدويا بين الصمامات والماصات المستخدمة عند الترقيع.
4. تثبيت أوتوباتشر إيغ.
   ملاحظة: متطلبات النظام: تم اختبار إيتوباتشر إيغ فقط على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل ويندوز 7. لم يتم التحقق من صحة لأنظمة التشغيل الأخرى. ينطبق الإجراء الموصوف على وجه التحديد على الأجهزة المدرجة في جدول المواد.
   1. تحميل أوتوباتشر إيغ من جيثب (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. تثبيت بيثون (انظر جدول المواد لعنوان الإصدار وتحميل).
   3. قم بإلغاء تثبيت PyQt4مكتبة عن طريق كتابة "بيب ونينستال PyQt4" في محطة سطر الأوامر.
      ملاحظة: يستخدم النظام نسخة قديمة من مكتبة PyQt4 لتحقيق التوافق مع مكتبات كوت و أوبينسف.
   4. تثبيت مكتبات بايثون من ملفات العجلات التاريخية (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). العثور على الملفات التالية: نومبي (بيمك-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl)، أوبينف (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl)، بيكت (PyQt4-4.11.4-cp27-نون -win32.whl)، و كوت (بيكوت-5.2.1-cp27-نون-win32.whl).
      1. لتثبيت ملفات العجلة، انتقل إلى الدليل حيث يتم حفظ الملفات واكتب "بيب إنستال *** ويلفيلنام ***.". بديل "*** ويلفيلنام ***" مع الاسم الفعلي للملف.
         ملاحظة: "cp27" في اسم ملف عجلة يشير بيثون 2.7 و "win32" أشار ويندوز 32 بت. إذا كان "win32" لا يعمل، حاول "win64."
   5. للسيطرة على كاميرا كسد، تحميل وتثبيت المثبت64 بت (https://www.qimaging.com/support/software/). ثم تحميل ميكروماناجر ل 64 بت (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) للسيطرة على الكاميرا في بيثون.
   6. للسيطرة على المتلاعبين والمرحلة المجهر، تثبيت برامج التحكم المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظة: من خلال القيام بذلك، يتم تثبيت برنامج التشغيل اللازم للسيطرة على المتلاعبين أيضا. عادة ما يتم توفير حزمة التثبيت في قرص مضغوط.
   7. للتحكم في لوحة داق الثانوية، قم بتثبيت المكتبة العامة من القرص المضغوط، شريطة شراء لوحة داق.
5. تكوين الأجهزة ل أوتوباتشر إيغ.
   1. توصيل مرحلة المجهر وأجهزة التحكم مناور إلى الكمبيوتر عن طريق منافذ أوسب.
   2. تعيين أرقام منفذ كوم لوحدة 0: مرحلة المجهر، وحدة 1: مناور اليسار، وحدة 2: مناور الحق، في هذا الترتيب، في "port.csv" ملف التكوين في مجلد "التكوين". Lإيف المعلمات الأخرى في ملف port.csv ( أي "سسي" و "1") دون تغيير.
      ملاحظة: يمكن العثور على معلومات رقم منفذ كوم عن طريق تشغيل برنامج تكوين مناور المقدمة من قبل الشركة المصنعة. انتقل إلى علامة التبويب "الإعدادات"، وحدد "الإعدادات" و "الحركة"، وقراءة التصنيفات لكل علامة تبويب في الجزء العلوي. بدلا من ذلك، يمكن العثور على هذه المعلومات في مدير جهاز الكمبيوتر.
   3. قم بتعيين أرقام قنوات الدخل التناظري على لوحة داق لمستشعر الضغط وقناة التصحيح 1 و 2 (المقابلة للوحدة 1 و 2). أدخل رقم القناة في الملف "DAQchannels.csv" في مجلد "التهيئة".
      ملاحظة: من المستحسن فتح ملفات .csv مع تطبيق المفكرة بدلا من جدول بيانات، لأنه قد يغير المعلومات عند حفظ التغييرات.
6. تشغيل أوتوباتشر إيغ.
   1. بدوره على مكبر للصوت، وحدة تحكم المجهر، ومناور تحكم. Ensuإعادة تشغيل برنامج مكبر للصوت.
   2. تشغيل أوتوباتشر إيغ مع بيثون من محطة سطر الأوامر على النحو التالي: أولا، تغيير الدليل (الأمر "سد" لمعظم المحطات المشتركة) حيث يتم تثبيت أوتوباتشر إيغ، اكتب "بيثون Autopatcher_IG.pyw" في محطة سطر الأوامر، وضرب "مفتاح الادخال.
      ملاحظة: لا تقم بتشغيل برنامج التحكم مناور قبل تشغيل أوتوباتشر إيغ لأنها سوف تحتل مرحلة المجهر ومناور، مما تسبب أوتوباتشر إيغ أن تكون غير قادرة على العثور على الأجهزة. ويمكن تشغيل برنامج التحكم مناور بعد بدء أوتوباتشر إيغ تماما إذا كان هناك وحدات إضافية ليتم التحكم فيها (على سبيل المثال، سخان مضمنة).
7. معايرة ماصة الأولية.
   1. سحب ماصات التصحيح كما هو موضح سابقا ⁹ . ملء ماصة الزجاج سحبت مع الحل الداخلي وتحميله على رأس المرحلة.
      ملاحظة: ماصات الزجاج الفارغة لها تناقضات مختلفة تحتالمجهر ويمكن أن يؤدي إلى المعايرة غير دقيقة.
   2. نقل طرف ماصة إلى المجال البصري المجهر وجلبه إلى التركيز. إذا تم استخدام لوحة الطلب لتحريك المتلاعبين و / أو مرحلة المجهر، تحديث الإحداثيات عن طريق الضغط على "ض" على لوحة المفاتيح.
      ملاحظة: هذا الإجراء ليس ضروريا إذا كان لوحة المفاتيح (المرحلة المجهر: A / D - المحور س، W / S - المحور ص، R / F - المحور Z؛ المتلاعبين: H / K - المحور س، J - المحور الصادي، O / L - المحور Z، 1/2 - رقم الوحدة) يستخدم للسيطرة على الحركة لأن الإحداثيات سيتم تحديثها في الوقت الحقيقي.
   3. انقر على زر "بدء المعايرة" على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية (غوي) للوحدة المقابلة التي يتم تحميل ماصة ( الشكل 2 ).
      ملاحظة: ستظهر نافذة منبثقة عند انتهاء المعايرة.
      ملاحظة: سيتم إجراء المعايرة تلقائيا، والتي سوف يستغرق حوالي 3.5 دقيقة. النقر على نفس الزر (تحول الآن إلى "إلغاء المعايرة" أفتر بدء المعايرة) سيجلب محاولة المعايرة.
   4. حفظ المعايرة عن طريق النقر على "حفظ المعايرة" في الجزء السفلي من واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية (فإنه يحفظ المعايرة الحالية لكل من المتلاعبين ويمكن تحميلها في المستقبل).
      ملاحظة: يجب محاذاة مجال الرؤية تحت انخفاض (4 أو 10X) وارتفاع (40X) التكبير للمعايرة الثانوية لتعمل بشكل صحيح. يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم من النظام البصري في استخدام إجراءات المحاذاة.

2. التلقائي التصحيح المشبك الإجراء

1. إعداد شرائح الدماغ الحادة، كما هو موضح سابقا ¹⁰ .
2. إعداد ماصات الزجاج لالمشبك التصحيح.
3. وضع شريحة الدماغ واحدة في وسط غرفة التسجيل. استقرار شريحة مع شريحة عقد لأسفل، أو "القيثارة".
4. كشف الخلايا الفلورية.
   1. العثور على مجال الاهتمام تحت عدسة 4X. حرك مرحلة المجهر عن طريق تشغيل كليسك-تو-موف ("كتم") واضغط على مركز المنطقة ذات الاهتمام. بدلا من ذلك، استخدم لوحة المفاتيح لتحريك مرحلة المجهر (A / D - المحور س، W / S - المحور ص، R / F - المحور Z).
   2. التبديل إلى عدسة التكبير عالية وضبط التركيز عن طريق تحريك المجهر في محور Z، وذلك باستخدام R / F على لوحة المفاتيح.
      ملاحظة: فمن المستحسن لضبط مستوى حمام الماء بحيث الطائرة البؤرية تحت العدسات منخفضة وعالية التكبير هي نفسها أو ما شابه ذلك في محور Z.
   3. انقر فوق الزر "كشف الخلية" على عمود واجهة المستخدم الرسومية الرئيسي، "الوحدة 0." إذا كان ليد أو مصدر ضوء الليزر من الإعداد لا يمكن السيطرة عليها من قبل إشارة تل، يدويا تشغيل ليد / الليزر؛ ستظهر نافذة منبثقة عند الانتهاء من اكتشاف الخلية.
      1. إيقاف الصمام / الليزر إذا لزم الأمر؛ ستظهر قائمة إحداثيات الخلية في واجهة المستخدم الرسومية "مواضع الذاكرة". أزل الخلايا غير المرغوب فيها من القائمة بالنقر على الزر "X" بجوار الإحداثيات.
      2. بدلا من ذلك، إذا لم يتم تسمية الخلايا المستهدفة فلوريسنتلي، انقر فوق "وضع الماوس" على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية. انقر على الخلية من الفائدة. سوف تظهر نقطة صفراء مع عدد على الخلية، وسوف تظهر إحداثيات الخلية في "مواضع الذاكرة" واجهة المستخدم الرسومية.
5. معايرة ماصة الثانوية.
   1. ملء 1/3 من ماصة الزجاج مع الحل الداخلي. تحميل ماصة على حامل ماصة تعلق على مرحلة الرأس.
   2. استخدام عدسة التكبير المنخفض. جلب ماصة في المجال البصري وضبط التركيز باستخدام لوحة المفاتيح (H / K - المحور س، U / J - المحور ص، O / L - المحور Z). استخدم "1" و "2" للتبديل بين الوحدة 1 والوحدة 2.
   3. تحميل المعايرة الأولية عن طريق النقر على "تحميل المعايرة". انقر على زر "المعايرة الثانوية" على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية تحت الوحدة المستخدمة. على سبيل المثال، إذا كانت الوحدة 2 قيد الاستخدام، انقر فوق الزر "معايرة ثانوية" في "الوحدة 2" كوlumn. اتبع التعليمات نافذة المنبثقة للتبديل إلى عدسة التكبير عالية.
6. تصحيح خلية الهدف.
   1. تأكد من تشغيل برنامج "مولتيكلامب" ( أي مكبر للصوت). انقر على زر "مراقبة التصحيح" لفتح "مراقبة التصحيح" واجهة المستخدم الرسومية. قد يستغرق ما يصل إلى بضع دقائق لفتح واجهة المستخدم الرسومية هذه.
   2. استخدام عدسة التكبير 40X عن طريق التحقق من "40X" على واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية "وحدة 0" العمود. انقر على زر "الذهاب إلى" بجوار الخلية ذات الاهتمام على قائمة الإحداثيات في "موقف الذاكرة" واجهة المستخدم الرسومية. فإن المجهر الانتقال إلى الخلية.
   3. انقر على زر كتم للوحدة المستخدمة في واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية لتمكين الحركة بعد النقر بالماوس. انقر على الخلية من الفائدة. فإن طرف ماصة تتحرك إلى الخلية.
   4. انقر على زر "تصحيح" على واجهة المستخدم الرسومية "التحكم التصحيح".
      ملاحظة: وسوف يبدأ الترقيع التلقائي، ويمكن رصد الضغط والمقاومة علىواجهة المستخدم الرسومية "رقعة التصحيح".
      1. استخدم زر "الوحدة 1 المحدد" للتبديل بين إشارة الدخل بين الوحدتين.
         ملاحظة: سيقوم النظام الاقتراب من الخلية المستهدفة، وتطبيق الضغط السلبي، وتتناسب مع إمكانات غشاء الخلية، والكشف عن تشكيل القحز على أساس سلسلة من الضغط ومقاومة العتبات والمنطق.
      2. التلاعب العملية التلقائية في أي لحظة عن طريق النقر على الأزرار المعنية على "التحكم التصحيح" واجهة المستخدم الرسومية. على سبيل المثال، انقر على الزر "تصحيح" مرة أخرى لإلغاء التجربة التصحيح وانقر على "المرحلة التالية" لدفع عملية الترقيع إلى الخطوة التالية، بغض النظر عن عتبة.
         ملاحظة: نافذة المنبثقة سوف يخطر المستخدم عندما شكلت جيغاسيال، وسيتم تقديم خيار لتطبيق انطلق جنبا إلى جنب مع ضغط سلبي كبير.
   5. حدد "نعم" لكسر في جنبا إلى جنب انقطاع والشفط. بدلا من ذلك، حدد "لا" لكسر في مع شفط فقط.
      ملاحظة: عند اكتمال تصحيح خلية كاملة ناجحة، سوف نافذة منبثقة تذكير المستخدم لحفظ سجل التصحيح التجربة.
   6. حفظ سجل التصحيح التجريبي.
      ملاحظة: إذا لم تنجح تجربة الترقيع، فستقوم نافذة منبثقة بإخطار المستخدم، وستتم إعادة تعيين عملية التصحيح.
   7. ارجع إلى الخطوة 2.4 وكرر الخطوات باستخدام خلية مختلفة.
7. قم بتحسين عتبات الترقيع (اختياري).
   ملاحظة: عتبات لمدى المقاومة ماصة الأولي، الضغط الإيجابي والسلبي، مقاومة القذف، الخ . يمكن تعديلها من ملف التكوين.
   1. افتح الملف "PatchControlConfiguration.csv" في مجلد "التكوين" في الوجهة التي يتم فيها تثبيت النظام. تغيير الأرقام المقابلة لكل قيمة العتبة. لا تغير أسماء القيم؛ وهذا يؤدي إلى إدخالات غير يمكن التعرف عليها في النظام.
   2. قم بتنفيذ قيم العتبة الجديدة فورا بالضغط على "كترل + L "دون إعادة تشغيل البرنامج؛ إعادة تشغيل البرنامج سيتم تنفيذ أحدث قيمة عتبة من الملف.

3. أداء التسجيلات

ملاحظة: سيتم تعيين الوضع في مكبر للصوت ميكرولكترود الكمبيوتر التي تسيطر عليها تلقائيا إلى المشبك الحالي ("إيك") من قبل برنامج أوتوباتشر مرة واحدة وقد تحقق التصحيح الناجح. كامل خلية التصحيح المشبك التسجيلات يمكن القيام به باستخدام برنامج تسجيل الاختيار (هذا النظام لا يتضمن وظيفة تسجيل). إذا تم تحديد العديد من الخلايا المستهدفة، بعد الانتهاء من تسجيل، والعودة إلى الخطوة 2.4 ومحاولة خلية أخرى.

1. إجراء التجارب المحلية تطبيق المخدرات المحلية باستخدام بيكوسبريتزر (اختياري).
   ملاحظة: هنا، يتم استخدام تجربة تطبيق المخدرات المحلية كمثال لوصف كيفية استخدام وظيفة "تسلسل الأوامر" إضافية للسيطرة على الأجهزة الخارجية من خلال إشارات تل.
   1. توصيل المنفذ A تشانيل 0 والأرض على لوحة داق الثانوية إلى بدء تشغيل الزناد المدخلات على محول الأرقام باستخدام كابل بنك تجرد (كما هو موضح في الخطوة 1.2.3). ربط واحد قناة الإخراج الرقمي على التحويل الرقمي إلى الزناد الخارجي على بيكوسبريتزر.
   2. إعداد بيكوسبريتزر وفقا لدليل المستخدم. توصيل إخراج الهواء بيكوسبريتزر إلى حامل ماصة المخدرات نفخة تعلق على ميكرومانيبولاتور.
   3. تحميل ماصة مليئة دواء في الاختيار. إرفاقه إلى حامل ماصة. معايرة ماصة، كما هو موضح في الخطوة 1.7.
   4. بعد تصحيح خلية كما هو موضح في الخطوة 2.6، حدد الموقع المطلوب لتسليم الدواء عن طريق النقر بالماوس في واجهة المستخدم الرسومية عرض الكاميرا تحت "وضع الماوس" (تحول من واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية). بدلا من ذلك، استخدم "الشبكة" واجهة المستخدم الرسومية لتصميم شبكة، مع كل بكسل في الشبكة باعتبارها واحدة من المواقع المستهدفة.
      ملاحظة: الشبكة يمكن التلاعب بها في واجهة المستخدم الرسومية عرض الكاميرا عن طريق سحب مع الماوس.
   5. في "القيادة سيكوإين "واجهة المستخدم الرسومية، حدد وحدة مناور أن ماصة المخدرات هي التي شنت على انقر فوق" تحميل نقاط الماوس "أو" تحميل نقاط الشبكة "لاستيراد جميع الإحداثيات لتسليم المخدرات.
      1. انقر على كل إدخال إحداثي لتحرير إشارة تل محددة الأمر في العمود الأيمن. في إدخال الأوامر الأول، انقر على الرقم الأيسر الأيمن لتحويله من "0" إلى "1"، بإرسال إشارة تل + 5-V تل. اضبط الوقت (T) على مدة إشارة تل المطلوبة في مس.
      2. في إدخال الأمر الثاني، قم بتعيين جميع الأرقام إلى "0" وقم بتعيين T لمدة مدة التسجيل للمحاكمة. تحرير الأوامر لجميع إدخالات الإحداثيات. أضف إدخالات الأوامر بالنقر على "+" إذا كانت هناك حاجة إلى إشارات تل متعددة.
         ملاحظة: البتات المكونة من 8 أرقام تمثل المنفذ يمكن تبديل القنوات 0-7 على داق الثانوي (المنافذ 1 - 3 التي تشغلها المضخة وصمامان)، إذا لزم الأمر.
   6. إنشاء بروتوكول تسجيل في وحدة الحصول على البيانات لذلكأن بدء عملية المسح يتم تشغيلها بواسطة مشغل بدء التشغيل الخارجي. تحرير بروتوكول لتسليم الدواء في الوقت المطلوب.
   7. في واجهة المستخدم الرسومية "تسلسل الأوامر"، انقر فوق "تشغيل" على اليسار لتشغيل كافة الإحداثيات. بدلا من ذلك، انقر فوق "تشغيل" على اليمين لتشغيل تسلسل المحدد فقط.
      ملاحظة: سوف ماصة تتحرك إلى كل تنسيق وتنفيذ إشارة تل كما هو محدد لبدء اكتساح التسجيل.

النتائج

وقد تم اختبار نظامنا على قدرته على التصحيح الخلايا في شرائح الدماغ الحادة، والماوس الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (إيبسس) متباينة في الخلايا العصبية، و هيك 293 خلايا تعبير مصطنع القنوات ذات الاهتمام. ويبين الشكل 3 تجربة باستخدا...

Discussion

هنا، نحن تصف طريقة لتسجيل الصور التلقائي المشبك التصحيح الموجهة في المختبر . وتتلخص الخطوات الرئيسية في هذه العملية على النحو التالي. أولا، يتم استخدام رؤية الكمبيوتر لتعترف تلقائيا طرف ماصة باستخدام سلسلة من الصور المكتسبة عن طريق المجهر. ثم يتم استخدام هذه ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II