脳スライスにおけるニューロン研究のための自動画像誘導パッチクランプの応用

要約

このプロトコルは、標準的なインビトロ電気生理学装置用に最近開発されたシステムを用いて自動画像ガイドパッチクランプ実験を行う方法を説明している。

要約

全細胞パッチクランプは、単細胞の電気的特性を測定する金標準的な方法です。しかし、 インビトロパッチクランプは、その複雑さおよびユーザの操作および制御への高い依存性のために、依然として困難で低スループットの技術である。この原稿は、急性脳スライスにおけるin vitro全細胞パッチクランプ実験のための画像ガイド自動パッチクランプシステムを実証しています。我々のシステムは、蛍光標識された細胞を検出し、マイクロマニピュレーターおよび内部のピペット圧力制御を用いた完全自動パッチングのためにそれらを標的にするコンピュータビジョンベースのアルゴリズムを実施する。プロセス全体は高度に自動化されており、人間の介入に対する必要条件は最小限に抑えられています。電気抵抗および内部ピペット圧力を含むリアルタイムの実験情報は、将来の分析および異なる細胞タイプへの最適化のために電子的に文書化されている。我々のシステムは、急性のbraiの文脈で記述されているn個のスライスレコーディングのために、解離ニューロン、器官型スライス培養物、および他の非ニューロン細胞タイプの自動画像誘導パッチクランプにも適用することができる。

概要

パッチクランプ技術は、興奮性膜のイオンチャンネルを研究するために1970年代にNeherとSakmannによって最初に開発されました¹ 。それ以来、パッチクランプは、ニューロン、心筋細胞、アフリカツメガエル卵母細胞、人工リポソームを含む多くの異なる細胞タイプにおいて、細胞、シナプスおよび回路レベル（ インビトロおよびインビボの両方） で多くの異なる被験者の研究に適用されている² 。このプロセスは、細胞の正確な同定および標的化、細胞に近接してパッチピペットを動かすための複雑なマイクロマニピュレーター制御、適切な時間に陽圧および陰圧をピペットに適用して緊密なギガシールパッチを確立すること、セル全体のパッチ構成を確立するためのブレークインなどがあります。パッチクランプは、通常は手作業で行われ、マスタリングには大規模なトレーニングが必要です。パッチを経験した研究者であってもクランプ、成功率は比較的低いです。より最近では、パッチクランプ実験を自動化するためのいくつかの試みがなされている。自動化を達成するために2つの主要な戦略が進化しました。標準的なパッチクランプ装置を増強して、パッチ適用プロセスの自動制御と、新しい装置と技術の設計を根本から行いました。前者の戦略は、既存のハードウェアに適応可能であり、 インビボブラインドパッチクランプ^3、4、5、急性脳切片のin vitroでのパッチクランプ、器官型スライス培養物を含め、パッチクランプ種々の用途に使用することができ、培養解離ニューロン⁶ 。これは、複数のマイクロマニピュレータを同時に使用することにより、複雑なローカル回路の照会を可能にします⁷ 。平面パッチ法は、新しい開発戦略の一例であり、高スループットの同時p薬物スクリーニング目的のための懸濁液中の細胞のクランプクランプ⁸ 。しかしながら、平面パッチ法は、全ての細胞型、特に、長いプロセスを有するニューロンまたは広範な接続を含むインタクトな回路には適用できない。これは、従来のパッチクランプ技術の重要な利点である、神経系の複雑な回路をマッピングすることへのその適用を制限する。

我々は、標準的なパッチクランプハードウェアを増強することにより、手動パッチクランププロセスをインビトロで自動化するシステムを開発しました。当社のシステムであるオートパックャーIGは、自動ピペット校正、蛍光細胞標的同定、ピペット移動の自動制御、自動全細胞パッチ、およびデータロギングを提供します。このシステムは、異なる深さの脳スライスの複数の画像を自動的に獲得することができる。コンピュータビジョンを使ってそれらを分析する。蛍光標識された細胞の座標を含む情報を抽出する。この情報は、目的の細胞を標的とし、自動的にそれをパッチするために使用される。このソフトウェアは、いくつかのオープンソースライブラリを使用して、無料のオープンソースプログラミング言語であるPythonで書かれています。これにより、他の研究者へのアクセシビリティが確保され、電気生理学実験の再現性と厳しさが向上します。このシステムはモジュラー設計を採用しているため、追加のハードウェアをここで示した現在のシステムと容易にインターフェースすることができます。

プロトコル

1.システムセットアップ

1. 圧力制御ユニットを構成します。
   1. 回路マップに従って圧力制御ユニットを組み立てます（ 図1 ）。電気回路図に従って製造されたプリント回路基板（PCB）に必要な部品を半田付けします （ 図1b ）。標準の抵抗、LED、金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（MOSFET）、コンデンサ、およびコネクタ（ 表の表を参照）を使用してください。ソレノイドバルブをPCBにはんだ付けする。エアーポンプと空気圧センサーを電線でPCBに接続します。
      注記：必要な部品をすべて用意して圧力制御ユニットを構成するには、約2時間かかります。
2. セカンダリデータ集録（DAQ）ボードを接続します。
   1. 表1に従って、プリント基板からDAQボードへのデータ出力を接続します。
      注：DAQボードはl "シングルエンドモード"で動作している。ポートマップはユーザマニュアルにあります（ 材料表を参照）。
   2. "AIn Pr S"をアナログ入力（AI）チャンネルの1つに接続し、 "R-Gr"をセカンダリDAQボードのアナロググランドの1つに接続します。
   3. アンプの1次出力をAIチャンネルの1つに接続し、グランドを2次DAQボードのアナロググランドに接続します。
      注：標準のBNCケーブルを使用して、アンプのプライマリ出力を接続することができます。
   4. 他方の端部を除去してアナロググランドにAIチャンネルと接地（コアの周囲に細線IE）に正のシグナル（ すなわち銅コア）を接続します。複数のパッチチャネルが使用されている場合は、この手順を2番目のチャネルに対して繰り返します。
      注記：DAQボードへのアナログ入力は後の手順で設定します。
   5. セカンダリDAQボードの電源出力に電源を接続します。別途12V電源を使用するポンプのための尿意。
3. チューブを接続します。
   1. エアーポンプと2つのバルブを表2に従って接続します。 3方向コネクタを使用して、最後のステップでバルブ2の上部ポート、圧力センサ、およびピペットホルダから軟質チューブを接続します。
   2. 2つのピペットを使用する場合は、ピペットホルダーに接続されたチューブに別の3方向コネクタを追加します。パッチ適用時にバルブとピペットを手動で切り替えます。
4. Autopatcher IGをインストールします。
   注：システム要件：Autopatcher IGは、Windows 7を実行しているPCでのみテストされました。他のオペレーティングシステムでは検証されていません。上記の手順は、材料表に記載されているハードウェアに特に適用されます。
   1. GitHub（https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG）からAutopatcher-IGをダウンロードしてください。
   2. Pythonをインストールします（バージョンとダウンロードアドレスについては、 表の表を参照してください）。
   3. PyQt4をアンインストールするコマンドラインターミナルで "pip uninstall PyQt4"と入力してください。
      注記：システムは古いバージョンのPyQt4ライブラリを使用して、QwtおよびOpencvライブラリとの互換性を実現しています。
   4. 歴史的なホイールファイル（http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/）からPythonライブラリをインストールしてください。 Numpy（pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl）、Opencv（opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl）、Pyqt（PyQt4-4.11.4-cp27-none）のファイルを探します。 -win32.whl）、およびQwt（PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl）です。
      1. ホイールファイルをインストールするには、ファイルが保存されているディレクトリに移動し、 "pip install *** wheelfilename ***。whl"と入力します。 "*** wheelfilename ***"を実際のファイル名に置き換えてください。
         注：ホイールファイル名の "cp27"はPython 2.7を示し、 "win32"はWindows 32ビットを示しています。 「win32」が動作しない場合は、「win64」を試してください。
   5. CCDカメラを制御するには、インストーラをダウンロードしてインストールします64ビット版（https://www.qimaging.com/support/software/）。 MicroManager for 64-bit（https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release）をダウンロードし、Pythonでカメラを制御します。
   6. マニピュレータと顕微鏡ステージを制御するには、製造元が提供する制御ソフトウェアをインストールします。
      注：これを行うと、マニピュレータを制御するために必要なドライバもインストールされます。インストールパッケージは、通常、CD-ROMで提供されます。
   7. セカンダリDAQボードを制御するには、DAQボードを購入したCD-ROMからUniversal Libraryをインストールします。
5. Autopatcher IGのハードウェアを設定します。
   1. 顕微鏡ステージとマニピュレータコントローラをUSBポート経由でコンピュータに接続します。
   2. COMポート番号をユニット0：顕微鏡ステージ、ユニット1：左マニピュレータ、ユニット2：右マニピュレータをこの順番で "configuration"フォルダの "ports.csv"設定ファイルに割り当てます。 Lports.csvファイルの他のパラメータ（ つまり、 "SCI"と "1"）を変更しないでください。
      注：COMポート番号の情報は、製造元が提供するマニピュレータ設定ソフトウェアを実行することで確認できます。 [設定]タブで[設定]と[モーション]ページを選択し、上部の各タブのラベルを読みます。または、この情報はPCデバイスマネージャで確認できます。
   3. 圧力センサとパッチチャンネル1と2（ユニット1と2に対応）のDAQボードにアナログ入力チャンネル番号を割り当てます。 "configuration"フォルダ内の "DAQchannels.csv"ファイルにチャンネル番号を入力します。
      注記：変更を保存するときに情報を変更する可能性があるため、スプレッドシートの代わりにメモ帳アプリケーションで.csvファイルを開くことをお勧めします。
6. Autopatcher IGを実行します。
   1. アンプ、顕微鏡コントローラ、マニピュレータコントローラの電源を入れます。エンズアンプのソフトウェアが動作していることを確認してください。
   2. コマンドライン端末からAutopatcher IGをPythonで実行するには、まずAutopatcher IGがインストールされているディレクトリ（ほとんどの一般的な端末では "cd"というコマンド）をコマンドライン端末に "python Autopatcher_IG.pyw"と入力し、 "キーを入力してください。
      注：顕微鏡ステージとマニピュレータを占有するため、オートパッチャーIGを実行する前にマニピュレータ制御ソフトウェアを実行しないでください。これにより、オートパッチャーIGがハードウェアを検出できなくなります。マニピュレータ制御ソフトウェアは、制御すべき追加のモジュール（ 例えば、インラインヒータ）があれば、オートパッカIGが完全に起動した後に実行することができる。
7. 一次ピペットを校正する。
   1. 前に説明したようにパッチピペットを引っ張りなさい⁹ 。引っ張られたガラスピペットを内部溶液で満たし、ヘッドステージにロードする。
      注：空のガラスピペットは、不正確な較正につながる可能性があります。
   2. ピペットチップを顕微鏡の視野に移動し、ピントを合わせます。ダイヤルパッドを使用してマニピュレータおよび/または顕微鏡ステージを移動する場合は、キーボードの "z"を押して座標を更新します。
      注：キーボード（顕微鏡ステージ：A / D-x軸、W / S-y軸、R / F-z軸、マニピュレータ：H / K-x軸、U / J-y軸、O / L-z軸、1/2 - ユニット番号）は、座標がリアルタイムで更新されるため、移動を制御するために使用されます。
   3. ピペットがロードされている対応するユニットのメインGUI（Graphic User Interface）の「Start calibration」ボタンをクリックします（ 図2 ）。
      注記：キャリブレーションが終了すると、ポップアップウィンドウが表示されます。
      注：キャリブレーションは自動的に実行され、約3.5分かかります。同じボタンをクリックすると（「キャリブレーションのキャンセル」に切り替わります。キャリブレーションの開始を中止します）。
   4. メインGUIの下部にある「較正を保存」をクリックして較正を保存します（両方のマニピュレータの現在の較正が保存され、将来ロードできます）。
      注記：低（4倍または10倍）および高倍率（40倍）の視界は、二次キャリブレーションが正しく機能するように調整する必要があります。ご使用の光学系のユーザーマニュアルを参照してください。

2.自動パッチクランプ手順

1. 前に説明したように、急性脳スライスを準備する¹⁰ 。
2. パッチクランプ用のガラスピペットを準備します。
3. 1つの脳スライスを記録チャンバーの中央に置きます。スライスのホールドダウン、つまり「ハープ」でスライスを安定させます。
4. 蛍光細胞を検出する。
   1. 4倍のレンズの下で関心領域を探します。 cliをオンにして顕微鏡ステージを動かすck-to-move（ "CTM"）モードを選択し、関心領域の中心をクリックします。または、キーパッドを使用して顕微鏡ステージ（A / D - x軸、W / S - y軸、R / F - z軸）を移動します。
   2. 高倍率レンズに切り替え、キーパッドのR / Fを使用して、顕微鏡をz軸方向に動かしてフォーカスを調整します。
      注：低倍率および高倍率のレンズの下の焦点面がz軸で同じまたは類似するように水槽の水準を調整することをお勧めします。
   3. メインのGUI列である[ユニット0]の[セルの検出]ボタンをクリックします。セットアップのLEDまたはレーザー光源がTTL信号で制御できない場合は、LED /レーザーを手動でオンにします。セル検出が完了するとポップアップウィンドウが表示されます。
      1. 必要に応じてLED /レーザーをオフにします。セル座標のリストが「メモリ位置」GUIに表示されます。座標の横にある「X」ボタンをクリックして、リストから不要なセルを削除します。
      2. または、ターゲット細胞が蛍光標識されていない場合は、メインGUIで[Mouse mode]をクリックします。興味のあるセルをクリックしてください。数字のある黄色の点がセルに表示され、セルの座標が「メモリ位置」のGUIに表示されます。
5. 二次ピペットを校正する。
   1. ガラスピペットの1/3を内部溶液で満たします。ピペットをヘッドステージに取り付けられたピペットホルダーにロードします。
   2. 低倍率レンズを使用してください。視野にピペットを持ち込み、キーパッド（H / K-x軸、U / J-y軸、O / L-z軸）を使用してピントを調整します。ユニット1とユニット2を切り替えるには、「1」と「2」を使用します。
   3. 「Load calibration」をクリックして、一次キャリブレーションをロードします。使用中のユニットの下にあるメインGUIの "Secondary calibration"ボタンをクリックします。たとえば、ユニット2が使用されている場合は、「ユニット2」の「Secondary calibration」ボタンをクリックします。列。ポップアップウィンドウの指示に従って、高倍率レンズに切り替えます。
6. ターゲットセルにパッチを当てます。
   1. "MultiClamp"（ つまりアンプ）ソフトウェアが動作していることを確認してください。 「パッチコントロール」ボタンをクリックして、「パッチコントロール」GUIを開きます。このGUIを開くには数分かかることがあります。
   2. メインGUIの "Unit 0"カラムで "40X"をチェックして、40倍の倍率のレンズを使用してください。 "Memory position" GUIの座標リスト上の目的のセルの横にある "go to"ボタンをクリックします。顕微鏡は細胞に移動します。
   3. メインGUIで使用中のユニットのCTMボタンをクリックすると、マウスクリック後の移動が可能になります。興味のあるセルをクリックしてください。ピペットチップがセルに移動します。
   4. 「パッチコントロール」GUIの「パッチ」ボタンをクリックします。
      注記：自動パッチングが開始され、圧力と抵抗を「パッチコントロール」GUI
      1. 「Unit 1 selected」ボタンを使用して、2つのユニット間の入力信号を切り替えます。
         注記：システムは、標的細胞に近づき、負圧をかけ、細胞膜電位と一致させ、一連の圧力および抵抗の閾値および論理に基づいてギガイザルの形成を検出する。
      2. 「パッチコントロール」GUI上のそれぞれのボタンをクリックすることで、いつでも自動プロセスを操作できます。たとえば、「パッチ」ボタンをもう一度クリックすると、パッチ試行をキャンセルし、「次の段階」をクリックして、しきい値に関係なく次の手順に進むことができます。
         注記：ギガシァルが形成されたときにポップアップウィンドウが表示され、大きな負圧とともにザップを適用するオプションが表示されます。
   5. 「はい」を選択すると、ザップとサクションを組み合わせて侵入します。または、吸引のみで中断する場合は「いいえ」を選択します。
      注記：正常な全細胞パッチが完了すると、実験パッチログを保存するようにポップアップウィンドウが表示されます。
   6. 実験パッチログを保存します。
      注：パッチ適用の試行に失敗した場合は、ポップアップウィンドウがユーザーに通知され、パッチ処理がリセットされます。
   7. 手順2.4に戻って、別のセルで手順を繰り返します。
7. パッチのしきい値を調整します（オプション）。
   注：初期ピペット抵抗範囲、正および負圧、ギガシアル抵抗などの閾値。構成ファイルから変更できます。
   1. システムがインストールされている宛先の「構成」フォルダにある「PatchControlConfiguration.csv」ファイルを開きます。各しきい値に対応する数字を変更します。値の名前は変更しないでください。これにより、システム内で認識できないエントリが発生します。
   2. 新しいしきい値をすぐに実装するには、 "Ctプログラムを再起動せずにプログラムを再起動すると、ファイルから最新のしきい値が実装されます。

3.レコーディングの実行

注記：コンピュータ制御マイクロ電極増幅器のモードは、パッチが正常に達成されると、オートパッチャーソフトウェアによって自動的に電流クランプ（ "IC"）に設定されます。全細胞パッチクランプ記録は、選択した記録ソフトウェア（このシステムは記録機能を含まない）を用いて行うことができる。複数の標的細胞が同定された場合、記録を終えた後、ステップ2.4に戻り、別の細胞を試してみる。

1. ピコスプライザー（オプション）を使用して、局所的な薬物塗布実験を自動実行します。
   注：ここでは、追加の「コマンドシーケンス」機能を使用してTTL信号を介して外部ハードウェアを制御する方法を説明するための例として、ローカルドラッグアプリケーションの実験が使用されています。
   1. ポートAチャの接続ストップされたBNCケーブルを使用してデジタイザのスタートトリガ入力に接続します（ステップ1.2.3を参照）。デジタイザの1つのデジタル出力チャネルをピコスプライザの外部トリガに接続します。
   2. ピコスプライザーはユーザーマニュアルに従って準備してください。マイクロマニピュレーターに取り付けられた薬物パフピペットホルダーにピコスプライザー空気出力を接続します。
   3. 選択した薬剤で満たされたピペットをロードします。ピペットホルダーに取り付けます。手順1.7で説明したように、ピペットを校正してください。
   4. ステップ2.6で説明したように細胞にパッチを当てた後、「マウスモード」（メインGUIから切り替え）の下でカメラビューGUIでマウスをクリックすることにより、薬物送達のための所望の場所を選択する。または、「グリッド」GUIを使用してグリッドを設計し、グリッド内の各ピクセルをターゲット位置の1つとして使用します。
      注：グリッドは、マウスでドラッグすることでカメラビューのGUIで操作できます。
   5. 「コマンドシーケンスドラッグポイントをロードする "または"グリッドポイントをロードする "をクリックしてドラッグデリバリーのすべての座標をインポートします。
      1. 右の列の特定のコマンドTTL信号を編集するには、各座標エントリをクリックします。最初のコマンド入力で、右端の桁をクリックして "0"から "1"にし、+ 5V TTL信号を送信します。時間（T）を希望のTTL信号の持続時間（ms）に設定します。
      2. 2番目のコマンド入力では、すべての数字を「0」に設定し、試行の録音時間の長さにTを設定します。すべての座標エントリのコマンドを編集します。複数のTTL信号が必要な場合は、「+」をクリックしてコマンド入力を追加します。
         注：8桁のビットは、必要に応じて、セカンダリDAQ（ポート1〜3はポンプと2つのバルブが占有しています）のポートAチャネル0〜7を表します。
   6. データ取得モジュールで記録プロトコルを作成する掃引の開始が外部開始トリガによってトリガされることを示します。薬物を所望の時間に送達するようにプロトコールを編集する。
   7. [コマンドシーケンス] GUIで、左の[実行]をクリックしてすべての座標を実行します。または、右側の[実行]をクリックすると、選択したシーケンスのみが実行されます。
      注：ピペットは各座標に移動し、記録スイープを開始するために定義されたTTL信号を実行します。

結果

我々のシステムは、急性脳スライス、ニューロンに分化したマウス誘発多能性幹細胞（iPSC）、および関心のあるチャネルを人工的に発現するHEK293細胞に細胞をパッチする能力に関して試験されている。 図3は、視覚野における蛍光標識層5ピラミッドニューロンを標的とするThy1-ChR2-YFPトランスジェニックマウス（B6.Cg-Tg（Thy1-COP4 / EYFP）18Gfng /...

ディスカッション

ここでは、インビトロで自動画像ガイドパッチクランプ記録のための方法を説明する。このプロセスの主要なステップを以下に要約します。まず、コンピュータビジョンを使用して、顕微鏡で取得した一連の画像を使用してピペットチップを自動的に認識させます。この情報は、次に、顕微鏡とマニピュレータ座標系との間の座標変換関数を計算するために使用される。コンピュータ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II