JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا البروتوكولات لتجانس خلايا الثدييات مثقف استناداً إلى التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً تنبيذ فائق خالية من المنظفات. هذا الأسلوب مثالي لرصد تقسيم البروتينات الغشاء المحيطي بين الذوبان والغشاء الكسور.

Abstract

الخلايا المستزرعة مفيدة لدراسة توزيع سوبسيلولار من البروتينات، بما في ذلك البروتينات الغشاء المحيطية. وراثيا ترميز فلوريسسينتلي البروتينات المعلمة قد أحدثت ثورة في دراسة توزيع البروتين سوبسيلولار. ومع ذلك، من الصعب قياس التوزيع مع مجهر فلوري، خاصة عندما تكون البروتينات جزئيا سيتوسوليك. وعلاوة على ذلك، من المهم كثيرا ما لدراسة البروتينات الذاتية. فحوصات الكيمياء مثل إيمونوبلوتس يظل المعيار الذهبي للتحديد الكمي لتوزيع البروتين بعد تجزئة سوبسيلولار. على الرغم من أن هناك مجموعات تجارية تهدف إلى عزل سيتوسوليك أو بعض الكسور غشاء، أن معظم هذه مجموعات تستند إلى استخراج مع المنظفات والتي قد تكون غير ملائمة لدراسة البروتينات الغشاء الطرفية التي يتم استخراجها بسهولة من الأغشية. هنا نقدم بروتوكول خالية من المنظفات لتجانس الخلوية التجويف النيتروجين وفصل اللاحقة للبروتينات سيتوسوليك والغشاء زمنياً حسب تنبيذ فائق. علينا تأكيد الفصل بين العضيات سوبسيلولار في الذوبان والكسور بيليه عبر أنواع مختلفة من الخلايا، ومقارنة استخراج البروتين بين عدة أساليب غير المستندة إلى المنظفات الميكانيكية التجانس المشترك. من بين العديد من المزايا للنيتروجين هو التجويف كفاءة متفوقة من انقطاع الهاتف الخلوي مع الحد الأدنى من الأضرار المادية والكيميائية إلى العضيات الدقيقة. جنبا إلى جنب مع تنبيذ فائق، التجويف النيتروجين وسيلة ممتازة لدراسة تحول البروتينات الغشاء المحيطي بين سيتوسوليك والغشاء الكسور.

Introduction

البروتينات الخلوية يمكن أن تقسم إلى فئتين: تلك التي ترتبط بالأغشية وتلك التي لا. تم العثور على عدم غشاء البروتينات المرتبطة بها في سيتوسول ونوكليوبلاسم ولومينا من العضيات مثل هيولى (ER). وهناك فئتان من البروتينات المرتبطة بالغشاء، لا يتجزأ، والأجهزة الطرفية. بروتينات الغشاء لا يتجزأ من المعروف أيضا البروتينات transmembrane لأن الأجزاء واحد أو أكثر في سلسلة ببتيد يمتد الغشاء، عادة α-الحلزون تتألف من الأحماض الأمينية مسعور. يتم إدراج كوترانسلاتيونالي في الأغشية أثناء التركيب الحيوي البروتينات transmembrane وتبقى حتى تم تكوينه حتى أنها هي كاتابوليزيد. بروتينات الغشاء المحيطي ثانوياً مدفوعة للأغشية، وعادة ما تكون نتيجة للتعديل بوستترانسلاشونال مع جزيئات مسعور مثل الدهون. وعلى النقيض من البروتينات الغشاء لا يتجزأ، ورابطة بروتينات الغشاء المحيطي مع الأغشية الخلوية يتم عكسها ويمكن أن تنظم. العديد من وظيفة البروتينات الغشاء المحيطي في مسارات الإشارات، وتنظم رابطة مع الأغشية إليه واحدة لتنشيط أو تثبيط طريقا. مثال واحد من جزيء مما يشير إلى أنه بروتين غشاء المحيطي هو GTPase الصغيرة، RAS. بعد سلسلة من التعديلات بوستترانسلاشونال التي تشمل التعديل مع دهن farnesyl، إدراج تعديل ج-المحطة من البروتين RAS ناضجة في النشرة هيولى من الغشاء الخلوي. على وجه التحديد، غشاء البلازما حيث يشرك RAS به المستجيب المتلقين للمعلومات RAF1. لمنع التنشيط التأسيسي لمسار mitogen تنشيط بروتين كيناز (MAPK)، توجد عدة مستويات للسيطرة على رأس. إلى جانب تقديم رأس نشط بالترشيح أنشئ في الناتج المحلي الإجمالي، RAS نشطة أيضا يمكن أن يفرج عن من غشاء البلازما بالتعديلات أو التفاعلات مع سولوبيليزينج عوامل تحول دون إشارة. على الرغم من أن يتيح تصوير لايف الفلورسنت علماء الأحياء الخلية فرصة مراقبة التعريب سوبسيلولار من البروتينات الفلورية غشاء الطرفية معلم البروتين1، لا تزال هناك حاجة ماسة إلى تقييم رابطة الغشاء البروتينات الذاتية شبه كمي مع النهج البيوكيميائية بسيطة.

التقييم البيوكيميائية السليم للبروتين التقسيم بين الغشاء والكسور القابلة للذوبان يتوقف بصورة حاسمة على عاملين اثنين هما: التجانس الخلوية وكفاءة فصل الغشاء وكسور قابلة للذوبان. على الرغم من أن بعض البروتوكولات، بما في ذلك مجموعات الأكثر استخداماً تجارياً، يعتمد على تجانس الخلية المستندة المنظفات، يمكن أن تعتم هذه الأساليب التحليل باستخراج البروتينات الغشاء في المرحلة القابلة للذوبان2. وبناء على ذلك، غير المنظفات الميكانيكية، واستنادا إلى أساليب تعطيل الخلية توفر نتائج أنظف. هناك عدة طرق لتعطل الخلايا نمت في الثقافة أو حصادها من الدم أو الأجهزة الميكانيكية. هذه تشمل دونس التجانس وتعطل غرامة إبرة وتجانس الحاملة للكرة، sonication والتجويف النيتروجين. هنا نقوم بتقييم التجويف النيتروجين وذلك مقارنة بالأساليب الأخرى. التجويف النيتروجين تعتمد على النيتروجين الذي يذوب في السيتوبلازم للخلايا تحت ضغط عال. تعليق خلية بعد الموازنة، فجأة تتعرض للضغط الجوي أن تتشكل فقاعات النيتروجين في السيتوبلازم التي تمزق فتح الخلية نتيجة على مقوماته. إذا كان الضغط مرتفع بما فيه الكفاية، مقوماته النيتروجين يمكن أن تعطل نواة3 والغشاء ملزمة العضيات مثل ليسوسوميس4. ومع ذلك، إذا كان يتم الاحتفاظ الضغوط منخفضة بما يكفي، سوف تعطيل تخفيف الضغط غشاء البلازما و ER ولكن لا العضيات الأخرى، وبالتالي إراقة سيتوسول والعضيات هيولى سليمة في هوموجيناتي الذي تم تعيينه كافيتاتي5. ولهذا السبب، التجويف النيتروجين هو الأسلوب المفضل لعزل العضيات مثل lysosomes والميتوكوندريا.

ومع ذلك، كما أنها وسيلة ممتازة لإعداد هوموجيناتي التي يمكن فصلها بسهولة في الغشاء وكسور قابلة للذوبان. وعاء الضغط (من الآن فصاعدا باسم "قنبلة") المستخدمة خلال التجويف تتكون من غلاف سميك من الفولاذ المقاوم للصدأ الذي يقاوم الضغط العالي، مع مدخل لتسليم غاز النيتروجين من دبابة ومنفذ مخرج مع صمام تفريغ قابل لتعديل.

وقد استخدمت التجويف النيتروجين لتجانس الخلية منذ الستينات6. في عام 1961، أنشأ صياد وكوميرفولد7 التجويف النيتروجين كبديل ناجع لاضطراب أنسجة الثدييات. ومنذ ذلك الحين، الباحثين قد تكيفت هذه التقنية لمختلف الخلايا والأنسجة بنجاح، والتجويف النيتروجين قد أصبح عنصرا أساسيا في العديد من التطبيقات، بما في ذلك الغشاء إعداد8،9ونوي وعضيه إعداد10،11، واستخراج البيوكيميائية مجا. حاليا، علماء الأحياء الخلية أكثر في كثير من الأحيان يستخدمون أساليب أخرى لتجانس خلية لفوائد النيتروجين التجانس لا يعلن عنها على نطاق واسع، والقنابل النيتروجين غالية الثمن وهناك الاعتقاد خاطئ بأن عدد كبير نسبيا من الخلايا مطلوب. لم يتم نشر بروتوكولات التجويف النيتروجين لتحقيق هوموجيناتيس الخلية خالية مع نويات سليمة، وفي التقييمات الأكثر المنشورة كانت تستخدم وحدات تخزين 20 مل من تعليق خلية. للتكيف مع هذا الأسلوب الكلاسيكي لتتناسب مع الاحتياجات الحالية للعمل مع عينات صغيرة الحجم، نقدم على بروتوكول تعديل التجويف النيتروجين مصممة خصيصا للخلايا المستزرعة. بعد التجويف النيتروجين، هوموجيناتي تنقسم القابلة للذوبان (S) والكسور غشاء (P) بالطرد المركزي التفاضلي، أولاً مع تدور السرعة المنخفضة لإزالة الأنوية والخلايا غير منقطعة، ثم مع تدور عالية السرعة (> 100,000 x ز) لفصل أغشية من الكسر القابلة للذوبان. نقوم بتحليل كفاءة الفصل مع إيمونوبلوتس وقارن التجويف النيتروجين مع تقنيات التعطيل الميكانيكية الأخرى. ونحن أيضا التحقيق ناضح تأثير تجانس المخزن المؤقت خلال التجويف النيتروجين.

Protocol

1-المخزن المؤقت ومعدات الأعمال التحضيرية

  1. البرد 45 مل خلية تعطيل القنابل وأنابيب 15 مل وأنابيب تنبيذ فائق في 4 درجة مئوية.
  2. تحضير والبرد 25 مل من المخزن المؤقت لتجانس كل 2 × 10 7 خلايا في 4 ° C. إضافة حوزتي المانع قرص واحد فقط قبل الاستخدام.
    ملاحظة: مخازن التجانس تحتوي عادة على بوكل بدلاً من كلوريد الصوديوم بشكل أفضل وتعكس تركيبة الملح داخل الخلايا. تجانس المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 ملم حبيس في درجة الحموضة 7.4، بوكل 10 و 1.5 ملم مجكل 2 (يشار إليه فيما يلي تجانس ناقص التوتر المخزن المؤقت). معظم المخازن المؤقتة يمكن تكييفها التجويف النيتروجين (انظر المناقشة)-
  3. تحضير والبرد 6 مل 1 × فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) المخزن المؤقت كل عينة في 4 ° C. إضافة حوزتي المانع أقراص جديدة قبل الاستخدام.
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول يتكون من 10 مم نا 2 هبو 4 على درجة الحموضة 7.4، 1.8 مم خ 2 ص 4، كلوريد الصوديوم 137 و 2.7 مم بوكل.
  4. تحضير والبرد 4 مل من المخزن المؤقت solubilization كل عينة في حوزتي واحدة إضافة درجة مئوية. 4 المانع لوحي فقط قبل الاستخدام.
    ملاحظة: سولوبيليزيشن المخزن المؤقت المستخدم في هذا البروتوكول هو x Radioimmunoprecipitation 1 المقايسة (ريبا) العازلة، التي تتألف من 25 مم تريس في الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم والحزب الديمقراطي الصربي 0.1% ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5% 1% NP-40. انظر الحاشية 4.6.

2. خلية حصاد

  1. ينمو 2 × 10 7-10 × 10 9 زراعة أنسجة خلايا مع الموصى الثقافة الإعلامية لنوع الخلية. عادة، تؤدي صحن واحد 15 سم 2 × 10 7 HEK-293 الخلايا المستزرعة في دميم في كونفلوينسي 90% ( الشكل 1).
  2. إزالة المتوسطة النمو بالفراغ.
  3. للخلايا ملتصقة، ضع الأطباق الثقافة على الجليد وغسل الخلايا مباشرة على أطباق الثقافة بلطف مع المخزن المؤقت التجانس المثلجة مرتين (العازلة 10 مل كل طبق 15 سم في المياه والصرف الصحي) وحصاد الخلايا مع مكشطة خلية كبيرة في زيادة في حجم مناسب المخزن المؤقت للتجانس؛ لتعليق الخلايا، جمع وتغسل بيليه الخلية في تجانس مبردة المخزن المؤقت مرتين (10 مل المخزن الواحد 50 مل الثقافة الواحدة والمياه والصرف الصحي) مع 500 x ز تدور عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وريسوسبيند بيليه خلية غسلها في زيادة حجم المخزن المؤقت التجانس على الجليد مناسبة.
    ملاحظة: الحجم ينبغي أن يستند إلى الاحتياجات اللازمة لتركيز البروتين في التجارب المقصود، فضلا عن حجم الحد الأدنى/الأعلى المسموح بها في خلية تعطيل القنبلة. إرشادات عامة 2-10 × 10 7 خلايا/مل أو بيليه حوالي 10 مجلدات من الخلية. هذا البروتوكول هو الأمثل لثلاثة أطباق 15 سم الخلايا HEK-293 في 2 مل من المخزن المؤقت للتجانس.

3. التجويف النتروجين

لوحة
  1. نقل تعليق خلية لقنبلة مبردة ونظيفة في حمام الثلج في ضجة.
    تنبيه: أن القنبلة قد ضغط عالية، ودرجة حرارة منخفضة، غاز النيتروجين – ملابس الحماية الشخصية المناسبة .
  2. وضع شريط إثارة مغناطيسية دقيقة داخل القنبلة وقم بتشغيل لوحة إثارة للحفاظ على التجانس تعليق.
  3. إضافة حبة واحدة من مثبطات البروتياز للوقف وإغلاق القنبلة الواحدة الشركة المصنعة ' تعليمة s-
  4. الضغط تدريجيا القنبلة مع خزان غاز نيتروجين في الشركة المصنعة ' يقرأ التعليمات s حتى قياس الضغط قنبلة 300 إلى 600 رطل/بوصة مربعة. إغلاق جميع الصمامات وقطع خزان النتروجين.
    ملاحظة: قد تختلف الضغط اللازم مع نوع الخلية. هنا أجرينا التجويف في 350 إلى 400 psi للخلايا HEK-293، والمعاهد الوطنية للصحة-3T3 وجوركات-
  5. الانتظار لمدة 20 دقيقة للسماح للنيتروجين بحل والتوصل إلى التوازن داخل الخلايا.
  6. إزالة المياه الزائدة حول صمام التصريف باستخدام منشفة من قماش. فتح صمام التصريف برفق تحقيق الإفراج عن دروبويسي هوموجيناتي، وجمع في أنبوب مبردة قبل 15 مل.
    ملاحظة: قرب نهاية مجموعة سيكون هناك طفرة هوموجيناتي والغاز سوف تظهر مع صوت الهسهسة. تأكد من أن الغاز لا قضية سبق تجميعها تكهفا لإطلاق النار خارج الأنبوب (ومن ثم استخدام 15 مل أنابيب بدلاً من أنابيب 1.5 مل). بمجرد بدء طفرة، إغلاق صمام التصريف وفتح صمام مدخل النيتروجين فجأة ديبريسوريزي القنبلة وتحقيق التجويف الخلايا المتبقية في القنبلة. فتح تكهفا القنبلة للانتعاش وتنظيف شامل.
    ملاحظة: كافيتاتي النهائي ينبغي أن يكون مظهر حليبي مع الرغوة في الأعلى. يحرك برفق مع تلميح ماصة للسماح بالرغوة لتهدأ قبل الطرد المركزي-
    ملاحظة: دراسة في كافيتاتي بالتباين مرحلة الفحص المجهري لتحديد كفاءة التجانس. إضافة قطره 15 ميليلتر من تكهفا على سطح شريحة مجهرية والغطاء مع ساترة. كرر الخطوة يتم الكشف عن 3.4-3.6 فقط إذا كان عدد كبير جداً من الخلايا دون انقطاع مع هدف X 20-
    ملاحظة: إذا كان لا يحتوي على المخزن المؤقت لتجانس يدتا أو عطا، إضافة إلى جمع تكهفا بتركيز 1 مم داخل 5 دقيقة نهائي بعد التفريغ.

4. الفصل بين سيتوسوليك والكسور غشاء

ز
  1. الطرد المركزي كافيتاتي في 500 x لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الخلايا غير منقطعة ونوى-
    ملاحظة: كرر الخطوة الطرد المركزي حتى يتم إنتاج لا بيليه مرئية وجمع وظيفة النووية طافية (السندات الإذنية) مع تجنب الرغوة الطافية على أعلى. إعادة الطرد المركزي الرغوة لمواصلة جمع والجمع بين السندات الإذنية، إذا لزم الأمر ( الشكل 1).
  2. عملية السندات الإذنية كما هو مطلوب للحصول على كسور للفائدة. لغرض فصل سيتوسوليك والغشاء الكسور، نقل السندات الإذنية لأنبوب ultracentrifuge وأداء تنبيذ فائق كما هو مطلوب. هذا البروتوكول هو الأمثل < 3.5 مل العينة في أنبوب أولتراسينتريفوجي البولي وتنبيذ فائق في 350,000 س ز ح 1 في 4 ° C.
  3. جمع المادة طافية (الكسر S) باستخدام ماصة 1 مل.
  4. بعناية شطف بيليه مع 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة دون تحريكه. إزالة برنامج تلفزيوني بالفراغ.
    ملاحظة: إذا كان تلوث كسر غشاء من البروتينات سيتوسوليك أكثر أهمية من فقدان عينة، ريسوسبيند بيليه في 3 مل الباردة برنامج تلفزيوني وإعادة-أولتراسينتريفوجي كما في الخطوة 4، 2. إزالة برنامج تلفزيوني بالفراغ.
  5. ريسوسبيند بيليه تماما في وحدة تخزين مناسبة المحتوية على مواد تنظيف المخزن المؤقت سولوبيليزيشن الاختيار. لتحقيق التعادل الخلية، استخدم نفس حجم المخزن المؤقت سولوبيليزيشن ككسر سيتوسوليك.
    ملاحظة: نحن نقترح استخدام المخزن المؤقت x RIPA 1 ك solubilization المخزن المؤقت لاستخراج البروتين كفاءة الغشاء. إذا كان لا مقايسة المتلقين للمعلومات غير مطلوب لكسر الغشاء، استخدام x laemmli 1 عينة المخزن المؤقت لاستخراج البروتين غشاء القصوى.
    ملاحظة: نحن نقترح إزاحة ونقل بيليه في المخزن المؤقت سولوبيليزيشن إلى أنبوب نظيفة على المدورة أنبوب عند 4 درجة مئوية لاستخراج البروتين غشاء القصوى.
    ملاحظة: إذا كان بيليه هو لزجة جداً (الدهون كثيرة جداً) كفاءة إزالتها من الأنبوب أولتراسينتريفوجي ه في المخزن المؤقت سولوبيليزيشن، فإننا نقترح المفاجئة تجميد بيليه في النتروجين السائل، وإزاحة بيليه من أنبوب أولتراسينتريفوجي بسرعة مع ملعقة معدنية صغيرة قبل أن يذوب بيليه.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، غشاء الكريات يمكن حراكه فقط ولا سولوبيليزيد في المخزن مؤقت غير المحتوية على مواد التنظيف لإنتاج ف جزء بسيط من الغشاء حويصلة تعليق، فيه حالة الطرد المركزي الخطوة في 4.6 غير مطلوب. هذه الكسور ف مفيدة عند التحقيق في وظائف مثل إنزيم الأنشطة التي تعتمد على رابطة الغشاء.
  6. الطرد المركزي تعليق بيليه solubilized تماما من الخطوة 4، 5 في غ س 20,000 في أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 10 دقائق في 4 ° C. جمع المادة طافية باستخدام ماصة 1 مل (الكسر ف) وتجاهل بيليه (غير قابلة للذوبان الدهون)-
  7. إجراء فحوصات المطلوب مثل النشاف الغربية مع كسور سيتوسوليك و/أو الغشاء، أو حفظها في-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

النتائج

ويبين الشكل 2 تقسيم البروتينات الخلوية من السندات الإذنية في كسر سيتوسوليك القابلة للذوبان (S) أو غشاء بيليه الكسر (P). قمنا بفحص ثلاثة خطوط الخلايا الممثل من أنواع مختلفة من الخلايا: HEK-293 (طلائي)، والمعاهد الوطنية للصحة-3T3 (تنتجها الخلايا الليفية) وجوركات (ال...

Discussion

وتتعدد مزايا التجويف النيتروجين عبر طرق أخرى لتعطيل الميكانيكية. ربما الفائدة الأكثر أهمية هو قدرته على تجانسه بلطف ولكن كفاءة العينات. المبادئ الفيزيائية للعينات يبرد الضغط بدلاً من توليد التدفئة المحلية الأضرار مثل الموجات فوق الصوتية والقص/الاحتكاك على أساس تقنيات. التجويف أيضا فعال...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من GM055279 و CA116034 و CA163489.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Disruption Vessel (45 mL)Parr Instrument4639Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL)Kontes885300-0002Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½Becton Dickinson329461Needle
Atg12 antibodySanta Cruz271688Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibodySanta Cruz47778Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibodyDSHBE7-sMouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibodySanta Cruz23954Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibodySanta Cruz373863Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibodySanta Cruz271803Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibodyAbcam124767Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibodySanta Cruz137130Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibodySanta Cruz373746Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibodySanta Cruz514419Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibodySanta Cruz55597Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibodySanta Cruz374022Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibodySanta Cruz59820Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibodySanta Cruz81598Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibodyCell Signaling Technology2024SRabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibodySanta Cruz376248Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibodyDSHBH4A3-cMouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibodySanta Cruz48345Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibodyAbcam137029Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibodyThermoMA3-067Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibodySanta Cruz398052Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibodySanta Cruz360Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibodySanta Cruz74459Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibodySanta Cruz12322Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter349622Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotorBeckman Coulter349481rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal UltracentrifugeBeckman Coulter364300ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsRoche11697498001protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm BladeCorning353089large cell scraper
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-57SIXmicro stir bar
Ceramic-Top Magnetic StirrerFisher ScientificS504501ASmagnetic stirrer

References

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved