JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы для моющих средств свободный гомогенизации культивируемых клеток млекопитающих, азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны привязкой на основе ultracentrifugation. Этот метод идеально подходит для мониторинга секционирование периферийных мембранных белков между растворимых и мембраны фракции.

Аннотация

Культивируемых клеток являются полезными для изучения субцеллюлярные распределение белков, включая периферийные мембранных белков. Генетически закодированный дневно тегами белки революционизировал изучение распределения внутриклеточных белков. Однако трудно дать количественную оценку распределения с помощью флуоресцентной микроскопии, особенно когда белки являются частично цитозольной. Кроме того важно изучить эндогенного белков. Биохимическая assays, такие, как иммуноблотов остаются золотой стандарт для количественной оценки распределения белка после субцеллюлярные фракционирования. Хотя есть коммерческие наборы, которые стремятся изолировать цитозольной или определенных фракций мембраны, большинство этих комплектов основаны на добычу с моющих средств, которые могут быть неподходящими для изучения периферических мембранных белков, которые легко извлекаются из мембраны. Здесь мы представляем бесплатный стиральный порошок протокол для сотовых гомогенизации азота кавитации и последующее разделение белков цитозольной и мембраны прыгните на ultracentrifugation. Мы подтверждаем разделение внутриклеточных органелл в растворимые и Пелле фракции через различных типов клеток и сравните экстракции белка среди нескольких общих методов на основе моющих средств механической гомогенизации. Среди нескольких преимуществ азота кавитации является превосходной эффективности клеточных нарушений с минимальными физические и химические повреждения тонкий органеллы. В сочетании с ultracentrifugation, кавитация азота является отличным способом для изучения сдвиг периферийных мембранных белков между цитозольной и мембраны фракции.

Введение

Клетчатые протеины можно разделить на два класса: те, которые связаны с мембраны и те, которые не являются. Non мембранных белков и связанные находятся в цитозоле, нуклеоплазмы и lumina органеллы например эндоплазменный ретикулум (ER). Существует два класса связанный мембранами белков, неотъемлемой и периферийных устройств. Неотъемлемой мембранных белков, также известный как трансмембранные белки, потому что один или несколько сегментов цепи полипептида охватывает мембраны, как правило в α-спирали состоит из гидрофобных аминокислот. Трансмембранные белки co-translationally вставляются в мембраны в ходе их биосинтез и остаются так настроен до тех пор, пока они являются голодании. Периферические мембранных белков вынуждены вторично мембраны, обычно вследствие столб-поступательные изменения с гидрофобные молекулы, такие как липиды. В отличие от составной мембранных белков Ассоциация периферийных мембранных белков с клеточных мембран является обратимым и может регулироваться. Многие функции белков периферийных мембраны в сигнальных путей и регулируемых ассоциацией с мембран является одним из механизмов для активации или препятствующих путь. Одним из примеров сигнальной молекулы, что периферической мембранный белок является небольшой ГТФазы, ран. После серии столб-поступательные изменения, которые включают модификации с Фарнезилпирофосфат липидов изменение C-конечная зрелой белок RAS вставляет в цитоплазматических листовка клеточной мембраны. В частности плазматической мембраны является, где ран занимается ее течению эффекторных RAF1. Чтобы предотвратить учредительный активации Митоген активированный протеин киназы (MAPK) пути, несколько уровней управления РАН находятся на месте. Кроме предоставляемых РАН неактивных гидроизолирующей GTP в ВВП, активные РАН также могут быть освобождены от плазматической мембраны путем изменения или взаимодействия с растворяющие факторы для подавления сигналов. Хотя флуоресцентные живых изображений дает клеточных биологов возможность наблюдать за субцеллюлярные локализации флуоресцентный протеин тегами периферийных мембранные белки1, остается крайне необходимо оценить мембраны ассоциации эндогенные белки полу количественно с простой биохимических подходов.

Надлежащей оценки биохимических белка перегородки между мембраной и растворимых фракций зависит от двух факторов: сотовой гомогенизации и эффективное разделение мембраны и растворимых фракций. Хотя некоторые протоколы, включая наиболее широко используемых коммерциализированной наборы, зависят от гомогенизации ячейки на основе моющих средств, эти методы могут запутывать анализа путем извлечения мембранных белков в растворимые фаза2. Соответственно без моющих средств на основе, механические методы разрушения клеток предоставляют результаты уборщика. Существует несколько методов механического разрушения клеток выросли в культуре или заготавливаемым из крови или органов. К ним относятся Dounce гомогенизации, нарушения тонкой иглой, -подшипник гомогенизации, sonication и азота кавитации. Здесь мы оцениваем азота кавитации и сравнить его с другими методами. Кавитация азота зависит от азота, растворенных в цитоплазме клеток под высоким давлением. После уравновешивания суспензию клеток резко подвергается воздействию атмосферного давления таким образом, что в цитоплазме, разорвать клеток вследствие их вскипания образуются пузырьки азота. Если давление является достаточно высоким, пузырьков азота может нарушить ядра3 и мембраной связаны органеллы как лизосомы4. Однако если давление сохраняется достаточно низкий, декомпрессия нарушит плазматической мембраны и ER, но не другие органеллы, тем самым разлив цитозоле и нетронутыми цитоплазматических органелл в огневки, который обозначается cavitate5. По этой причине кавитации азота является методом выбора для изоляции как лизосом и митохондрии органеллы.

Однако это также отличный способ подготовки огневки, который может быть легко разделена на мембраны и растворимых фракций. Сосуд под давлением (отныне называется «бомба») используется в процессе кавитации состоит из корпуса из нержавеющей стали толщиной, выдерживает высокое давление, с входом для доставки газ азот из танка и напорный канал с регулируемой разгрузочный клапан.

Кавитация азота был использован для гомогенизации клеток начиная с 1960-х6. В 1961 году Хантер и Commerfold7 создана кавитации азота как жизнеспособный вариант для млекопитающих тканей срыв. С тех пор исследователи приспособились технику для различных клеток и тканей с успехом, и азота кавитации стал штапель в нескольких приложениях, включая мембраны подготовка8,9, ядер и органелл Подготовка10,11и лабильных биохимических добычи. В настоящее время клеточных биологов чаще используют другие методы клеток гомогенизации, потому что преимущества азота гомогенизации широко не объявлена, бомбы азота являются дорогостоящими и есть заблуждение, что относительно большое количество клеток Обязательно. Протоколы для кавитации азота для достижения свободных клеток гомогенатах с нетронутыми ядра не были опубликованы, и в наиболее опубликованных оценок использовались объемы 20 мл суспензии клеток. Чтобы адаптировать этот классический метод для удовлетворения текущих требований работы с небольших образцов, мы представляем измененный Протокол азота кавитации, специально предназначенные для культивируемых клеток. После азота кавитации, огневки разделяется на водорастворимые (S) и мембранные (P) фракции, дифференциального центрифугирования, сначала с низкой скорости отжима для удаления ядра и нерушимой клетки, а затем с высокоскоростным вращением (> 100 000 x g) для разделения мембраны из растворимых фракции. Мы анализируем эффективность разделения с иммуноблотов и сравните азота кавитации с другими методами механического нарушения. Мы также расследовать осмотического эффекта гомогенизации буфера во время азота кавитации.

протокол

1. буфер и оборудование подготовки

  1. Chill 45 мл клеток нарушения бомбы, 15 мл трубы и трубы ultracentrifugation на 4 ° C.
  2. Подготовка и холод 25 мл гомогенизации буфера за 2 x 10 7 клеток на 4 ° C. добавить один протеазы ингибитор планшета непосредственно перед употреблением.
    Примечание: Гомогенизации буферы обычно содержат KCl, вместо того, чтобы NaCl лучше отражать внутриклеточных солевой состав. Гомогенизация буфер, используемые в настоящем Протоколе состоит из 10 мм HEPES на рН 7,4, 10 мм KCl и 1,5 мм MgCl 2 (именуемой в дальнейшем гипотонический гомогенизации буфера). Большинство буферы могут быть адаптированы для кавитации азота (см. обсуждение).
  3. Подготовка и холод 6 мл 1 x Phosphate-Buffered солевой (PBS) буфера на сэмпл в 4 ° C. Добавить протеазы ингибитор аксессуарами свежий перед использованием.
    Примечание: PBS буфер, используемые в настоящем Протоколе состоит из 10 мм Na 2 HPO 4 на рН 7,4, 1.8 мм х 2 PO 4, 137 мм NaCl и 2,7 мм KCl.
  4. Подготовка и холод 4 мл солюбилизация буфера на сэмпл в 4 ° C. добавить один протеазы ингибитор планшета непосредственно перед употреблением.
    Примечание: Солюбилизация буфер, используемые в настоящем Протоколе — 1 x Radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера, который состоит из 25 мм трис на рН 7,4, 150 мм NaCl, 0.1% SDS, Дезоксихолат натрия 0,5% и 1% NP-40. 4.6 см.

2. Сотовый заготовка

  1. растут 2 x 10-7 -10 x 10 9 клетки культуры ткани с рекомендуемым культуры средств массовой информации для типа ячейки. Как правило, одна 15-см блюдо дает 2 x 10-7 ГЭС-293 клетки культивировали в среде DMEM на 90% confluency ( рис. 1).
  2. Удалить средство роста вакуум.
  3. Для адэрентных клеток, место культуры блюда на льду, мыть ячейки непосредственно на культуру блюда нежно с охлажденной гомогенизации буферу дважды (10 мл за 15 см блюдо за мыть) и урожай клетки с крупноклеточный скребок в соответствующий объем гомогенизация буфер; Для подвески клеток собирать и помыть лепешка клеток в охлажденной гомогенизации буферу дважды (10 мл в 50-мл культуры за мыть) с 500 x g спина на 4 ° C за 5 мин и Ресуспензируйте Пелле мыть ячейки в соответствующий объем буфера гомогенизации на льду.
    Примечание: объем должен основываться на требованиях для концентрации белка в предполагаемой эксперименты, а также минимальный/максимальный объем в бомба разрушение клеток. Общая рекомендация — 2-10 x 10 7 кл/мл, или около 10 томов ячейки Пелле. Этот протокол оптимизирован для трех блюд 15см ГЭС-293 клеток в 2 мл буфера гомогенизации.

3. Кавитация азота

  1. передачи суспензию клеток чистой и охлажденные бомбу в ледяной ванне на сенсацию пластина.
    Предупреждение: Бомба имеет высокое давление, низкая температура, газ азот – носить личной охраны .
  2. Место микро магнитные перемешать бар внутри бомбы и включите перемешать пластины для поддержания однородности подвеска.
  3. Добавить одну таблетку ингибитор протеазы к приостановлению и закрыть бомбу за производителя ' s инструкция.
  4. Постепенно давление бомба с баком газа азота за производителя ' s инструкция до бомба манометр читает 300 до 600 psi. Закройте все клапаны и отсоединить бак азота.
    Примечание: Давление, необходимое может меняться с типом ячейки. Здесь мы провели кавитации на 350-400 psi для ячеек ГЭС-293, низ 3T3 и Jurkat.
  5. Ждать 20 минут позволить азота распустить и достичь равновесия внутри клетки.
  6. Удалить излишки воды вокруг сливного клапана, используя ткань полотенце. Откройте клапан сброса осторожно, чтобы достичь прикапывают релиз огневки и собирать в предварительно охлажденные 15 мл.
    Примечание: В конце коллекции будет рывок огневки и газовые выйдет с шипящим звуком. Убедитесь, что газ не причиной ранее собранных cavitate стрелять из трубки (отсюда использование 15 мл пробирок вместо 1.5 мл пробирок). Как только начинает рывок, закройте сливной клапан и откройте клапан впуска азота внезапно для того бомбу и достижения кавитация остальных ячеек в бомбы. Открытые cavitate бомбу для восстановления и тщательной очистки.
    Примечание: Последний cavitate должны иметь Млечный возникновение с пены на вершине. Аккуратно перемешайте с кончиком пипетки разрешить пены спадать перед центрифугированием.
    Примечание: Изучите cavitate, фазово контрастной микроскопии для определения эффективности гомогенизации. Добавить каплю 15 мкл cavitate на поверхности крышки с coverslip и микроскопии слайд. Повторите шаг 3.4-3.6 только если слишком много непрерывной клетки обнаруживаются с 20 X цель.
    Примечание: Если гомогенизации буфера не содержит ЭДТА или EGTA, добавить его в собранных cavitate в конечной концентрации 1 мм в течение 5 мин после выписки.

4. Разделение Cytosolic и мембраны фракции

  1. центрифуги cavitate на 500 x g 10 мин при 4 ° C для удаления непрерывной клетки и ядер.
    Примечание: Повторите шаг центрифугирования до тех пор, пока не видны гранулы производятся и собирать пост ядерной супернатанта (ПНС), избегая пены, плавающей на вершине. Повторно центрифуга пены для дальнейшего сбора и объединить ПНС, при необходимости ( рис. 1).
  2. Процесс ПНС нужным получить фракций интерес. Целью разделения цитозольной и мембраны фракций ПНС передавать ультрацентрифуга трубки и выполнять ultracentrifugation нужным. Этот протокол оптимизирован для < 3,5 мл образца в трубке ультрацентрифуга поликарбоната и для ultracentrifugation на 350 000 x g на 1 ч в 4 ° C.
  3. Собирать супернатант (фракция S) с помощью пипетки 1мл.
  4. Тщательно промойте лепешка с 3 мл холодного PBS не нарушая его. Удаление PBS вакуум.
    Примечание: Если загрязнение мембраны дроби, цитозольной белки большую озабоченность, чем потери образца, Ресуспензируйте гранулы в 3 мл холодного PBS и ре ультрацентрифуга как в шаге 4.2. Удаление PBS вакуум.
  5. Ресуспензируйте гранулы полностью в соответствующий объем моющих средств содержащих солюбилизация буфера выбора. Для достижения эквивалентности ячейки, используйте такой же объем солюбилизация буфера в цитозольной фракции.
    Примечание: Мы рекомендуем использовать 1 x RIPA буфер как солюбилизация буфер для эффективного мембранных белков добычи. Если не ниже по течению пробирного требуется для фракция мембраны, используйте 1 буфер образца x laemmli для максимальной мембранных белков извлечения.
    Примечание: Мы предлагаем выбивании и передачи Пелле в буфере солюбилизация чистой трубки на вращателе трубки на 4 ° C для максимальной мембранных белков извлечения.
    Примечание: Если гранулы слишком липким (слишком много липиды) эффективно удаляться из йe ультрацентрифуга трубки в буфере солюбилизация, мы предлагаем оснастки замораживания гранулы в жидком азоте и быстро выбивании гранулы из трубки ультрацентрифуга с мини-металлической лопаткой до гранулы таяет.
    Примечание: в качестве альтернативы, мембраны окатышей может быть просто высокомобильна и не солюбилизирован в буфере моющих средств содержащих производить P часть мембраны везикул подвеска, в которой дело центрифуги шаг в 4.6 не требуется. Такие дроби P полезны при расследовании функций, таких как ферментативной активности, которые зависят от Ассоциации мембраны.
  6. Центрифуга подвеска полностью растворимых гранул из шага 4.5 на 20000 x g в настольная центрифуга для 10 мин на 4 ° C. собирать супернатанта, с помощью пипетки (фракция P) 1 мл и отбросить Пелле (нерастворимых липиды).
  7. Выполнения желаемых анализы как Западный blotting с дробями цитозольной и/или мембраны, или сохранить их на-80 ° C для использования в будущем.

Результаты

На рисунке 2 показано секционирование клеточных белков от ПНС в растворимые цитозольной фракции (S) или мембраны Пелле дроби (P). Мы рассмотрели три представителя клеточных линий из различных типов клеток: ГЭС-293 (эпителия), низ 3T3 (фибробласты) и Jurkat (лимфо?...

Обсуждение

Преимущества кавитации азота над другими методами механического разрушения многообразны. Возможно наиболее значительные выгоды является его способность мягко, но эффективно гомогенизировать образцов. Физические принципы декомпрессии охлаждает образцы вместо создания местного наг...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась GM055279, CA116034 и CA163489.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Disruption Vessel (45 mL)Parr Instrument4639Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL)Kontes885300-0002Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½Becton Dickinson329461Needle
Atg12 antibodySanta Cruz271688Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibodySanta Cruz47778Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibodyDSHBE7-sMouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibodySanta Cruz23954Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibodySanta Cruz373863Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibodySanta Cruz271803Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibodyAbcam124767Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibodySanta Cruz137130Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibodySanta Cruz373746Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibodySanta Cruz514419Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibodySanta Cruz55597Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibodySanta Cruz374022Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibodySanta Cruz59820Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibodySanta Cruz81598Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibodyCell Signaling Technology2024SRabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibodySanta Cruz376248Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibodyDSHBH4A3-cMouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibodySanta Cruz48345Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibodyAbcam137029Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibodyThermoMA3-067Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibodySanta Cruz398052Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibodySanta Cruz360Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibodySanta Cruz74459Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibodySanta Cruz12322Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tubeBeckman Coulter349622Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotorBeckman Coulter349481rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal UltracentrifugeBeckman Coulter364300ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tabletsRoche11697498001protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm BladeCorning353089large cell scraper
Magnetic Stir BarFisher Scientific14-513-57SIXmicro stir bar
Ceramic-Top Magnetic StirrerFisher ScientificS504501ASmagnetic stirrer

Ссылки

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R., Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2 (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. , (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126ultracentrifugation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены