Cavitazione di azoto e centrifugazione differenziale permette di monitorare la distribuzione periferica delle proteine di membrana in cellule coltivate

Riepilogo

Qui presentiamo protocolli per omogeneizzazione detergente privo di cellule di mammiferi coltivate basato su azoto cavitazione e successiva separazione delle proteine citosoliche e membrana-limiti di ultracentrifugazione. Questo metodo è ideale per il monitoraggio il partizionamento periferici delle proteine di membrana tra solubili e frazioni della membrana.

Abstract

Le cellule coltivate sono utili per studiare la distribuzione subcellulare delle proteine, tra cui proteine di membrana periferici. Geneticamente codificato fluorescente proteine etichettate hanno rivoluzionato lo studio della distribuzione subcellulare della proteina. Tuttavia, è difficile quantificare la distribuzione con microscopia di fluorescenza, soprattutto quando le proteine sono parzialmente citosoliche. Inoltre, è spesso importante per lo studio di proteine endogene. Come immunoblots rimangono il gold standard per la quantificazione della distribuzione della proteina dopo frazionamento subcellulare dosaggi biochimici. Anche se ci sono kit commerciali che mirano a isolare citosolico o determinate frazioni di membrana, la maggior parte di questi kit si basano sull'estrazione con detersivi, che potrebbe non essere adatto per lo studio delle proteine di membrana periferici che facilmente vengono estratti dalle membrane. Qui presentiamo un protocollo privo di detergente per cellulare omogeneizzazione di azoto cavitazione e successiva separazione delle proteine citosoliche e di membrana-limitano dall'ultracentrifugazione. Confermiamo la separazione degli organelli subcellulari in solubile e frazioni di pellet attraverso diversi tipi di cellule e confrontare l'estrazione di proteine tra diversi metodi di omogeneizzazione meccanica non basati su detergente comune. Tra i numerosi vantaggi di azoto cavitazione è l'efficienza superiore di rottura cellulare con minimo danno fisico e chimico di organelli delicati. Combinato con ultracentrifugazione, azoto la cavitazione è un metodo eccellente per esaminare lo spostamento delle proteine di membrana periferici tra citosolico e frazioni della membrana.

Introduzione

Proteine cellulari possono essere suddivisi in due classi: quelli che sono associati con membrane e quelli che non sono. Proteine associate non-membrana si trovano nel citosol, nucleoplasma e lumina degli organelli come il reticolo endoplasmico (ER). Ci sono due classi di proteine di membrana-collegato, integrale e periferici. Proteine integrali di membrana sono noti anche come proteine transmembrana, poiché uno o più segmenti della catena del polipeptide si estende la membrana, in genere come un α-elica composta da amminoacidi idrofobici. Proteine transmembrana co-translationally vengono inseriti nelle membrane nel corso della loro biosintesi e rimangono così configurate fino a quando essi sono catabolizzate. Proteine di membrana periferico secondariamente sono spinti a membrane, solitamente come conseguenza di modificazione post-traduzionale con molecole idrofobe quali i lipidi. A differenza di proteine integrali di membrana, l'associazione di proteine di membrana periferico con le membrane cellulari è reversibile e può essere regolata. Molti funzione di proteine di membrana periferico in vie di segnalazione e regolamentato associazione con membrane è un meccanismo per attivando o inibendo una via. Un esempio di una molecola di segnalazione che è una proteina di membrana periferico è il piccolo GTPase, RAS. Dopo una serie di modificazioni post-traduzionali che includono la modifica con un lipido di farnesyl, modificate C-terminale di una proteina RAS matura inserisce l'opuscolo citoplasmatico della membrana cellulare. In particolare, la membrana plasmatica è dove il RAS si aggancia il suo effettore a valle RAF1. Per impedire l'attivazione costitutiva della chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), livelli multipli di controllo RAS sono a posto. Oltre a rendering RAS inattivo idrolizzando il GTP in PIL, RAS attivo anche può essere rilasciato dalla membrana plasmatica da modifiche o interazioni con solubilizzanti fattori per inibire la segnalazione. Anche se fluorescente live imaging offre biologi cellulari l'opportunità di osservare la localizzazione subcellulare delle proteine di membrana periferico della proteina-etichetta fluorescente¹, ci rimane un bisogno fondamentale per valutare l'associazione della membrana di proteine endogene semi-quantitativamente con semplici approcci biochimici.

L'appropriata valutazione biochimica delle proteine partizionamento tra membrana e frazioni solubili è criticamente dipendono da due fattori: cellulare omogeneizzazione ed efficiente separazione della membrana e frazioni solubili. Anche se alcuni protocolli, tra cui i kit commercializzati più ampiamente usati, dipendono dall'omogeneizzazione di detergente a base di cellule, questi metodi possono offuscare analisi tramite l'estrazione di proteine di membrana nei solubile fase². Di conseguenza, non detergente basati, meccanici metodi di distruzione cellulare forniscono risultati più puliti. Ci sono diversi metodi di rottura meccanica delle cellule in coltura o raccolte dal sangue o organi. Questi includono lisata omogeneizzazione, rottura fine dell'ago, cuscinetti a sfera omogeneizzazione, sonicazione e cavitazione di azoto. Qui valutiamo cavitazione di azoto e confrontarlo con altri metodi. Cavitazione di azoto si basa sull'azoto che è dissolto nel citoplasma delle cellule ad alta pressione. Dopo l'equilibratura, la sospensione cellulare bruscamente è esposta alla pressione atmosferica tale che bolle di azoto si formano nel citoplasma che strappare aperto la cella in conseguenza del loro effervescenza. Se la pressione è sufficientemente elevata, effervescenza di azoto possa interferire con il nucleo³ e membrana associato organelli come i lisosomi⁴. Tuttavia, se la pressione è mantenuta abbastanza bassa, la decompressione altererà la membrana plasmatica ed ER ma non altri organelli, quindi versare sia cytosol e organelli citoplasmici intatti nell'omogenato viene designato il cavitate⁵. Per questo motivo, la cavitazione di azoto è il metodo di scelta per l'isolamento di organelli come i lisosomi e mitocondri.

Tuttavia, è anche un ottimo modo di preparare un omogeneato che può essere facilmente separato in membrana e frazioni solubili. Il recipiente a pressione (d'ora in poi chiamato "the bomb") utilizzato durante la cavitazione è costituito da un involucro di acciaio inox spessore che resiste ad alta pressione, con un ingresso per la consegna del gas dell'azoto da un serbatoio e un orificio di presa con valvola di scarico regolabile.

Cavitazione di azoto è stato utilizzato per l'omogeneizzazione delle cellule dal 1960s⁶. Nel 1961, Hunter e Commerfold⁷ stabilito cavitazione di azoto come una valida opzione per distruzione di tessuti di mammiferi. Da allora, i ricercatori hanno adattato la tecnica di varie cellule e tessuti con successo e cavitazione azoto è diventato un fiocco in più applicazioni, tra cui membrana preparazione^8,9, nuclei e organello preparazione^10,11ed estrazione biochimici labili. Attualmente, i biologi delle cellule più spesso impiegano altri metodi di omogeneizzazione delle cellule perché i benefici di omogeneizzazione di azoto non sono stati ampiamente pubblicizzati, bombe di azoto sono costose e c'è un equivoco che un numero relativamente elevato di celle è Obbligatorio. Protocolli per la cavitazione di azoto raggiungere omogeneati privo di cellule con nuclei intatti non sono stati pubblicati, e nelle valutazioni pubblicati più volumi di 20 mL di sospensione cellulare sono stati usati. Per adattare questa tecnica classica per soddisfare i requisiti attuali di lavorare con campioni di piccole dimensioni, vi presentiamo un protocollo modificato di cavitazione di azoto specificamente progettato per le cellule coltivate. Dopo cavitazione di azoto, l'omogeneizzato è separato in solubili (S) e frazioni di membrana (P) tramite centrifugazione differenziale, prima con un giro di basso-velocità per rimuovere i nuclei e cellule ininterrotte e poi con una rotazione ad alta velocità (> 100.000 x g) per separare membrane dalla frazione solubile. Analizziamo l'efficienza della separazione con immunoblots e confrontare cavitazione di azoto con altre tecniche di rottura meccanica. Studiamo anche l'effetto osmotico del buffer di omogeneizzazione durante la cavitazione di azoto.

Protocollo

1. buffer e attrezzature preparati

1. Chill 45ml cella perturbazione bombe, provette da 15 mL e tubi ultracentrifugazione a 4 ° C.
2. Preparare e chill 25 mL di tampone di omogeneizzazione per 2 x 10 ⁷ cellule a 4 ° C. Aggiungi una proteasi inibitore compressa appena prima dell'uso.
   Nota: Omogeneizzazione buffer contengono in genere KCl anziché NaCl per meglio riflettere composizione sale intracellulare. Buffer di omogeneizzazione utilizzato in questo protocollo è costituito da 10 mM HEPES pH 7.4, 10mm KCl e 1,5 mM MgCl ₂ (in appresso denominato buffer di omogeneizzazione ipotonica). Maggior parte dei buffer può essere adattato per la cavitazione di azoto (Vedi discussione).
3. Preparare e chill 6 mL di 1x tampone Phosphate-Buffered salino (PBS) per campione a 4 ° C. Aggiungi della proteasi inibitore compresse freschi prima dell'uso.
   Nota: Tampone PBS utilizzato nel presente protocollo è costituito da 10 mM Na ₂ HPO ₄ a pH 7.4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄, 137 mM NaCl e 2.7 mM KCl.
4. Preparare e chill 4 mL di tampone di solubilizzazione per campione a 4 ° C. aggiungere una proteasi inibitore pastiglia appena prima dell'uso.
   Nota: Solubilizzazione buffer utilizzato in questo protocollo è 1 tampone del saggio (RIPA) x Radioimmunoprecipitation, che consiste di 25 mM Tris a pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, sodio desossicolato 0,5% e 1% NP-40. Vedere nota 4.6.

2. Raccolta di cella

1. Grow 2 x 10 ⁷ -10 x 10 ⁹ celle di coltura del tessuto con la raccomandata di coltura per il tipo di cella. In genere, un piatto di 15 cm produce 2 x 10 ⁷ cellule HEK-293 coltivate in DMEM al 90% confluency ( Figura 1).
2. Rimuovere il mezzo di crescita dal vuoto.
3. Per le cellule aderenti, mettere i piatti di cultura sul ghiaccio, lavare le cellule direttamente sui piatti cultura delicatamente con buffer di omogeneizzazione refrigerati due volte (10 mL di tampone per ogni piatto di 15cm a lavaggio) e raccogliere le cellule con un raschietto di grandi cellule in un volume adeguato di buffer di omogeneizzazione; Per cellule in sospensione, raccogliere e lavare il pellet cellulare in due volte di buffer per il refrigerate omogeneizzazione (10 mL di tampone per la cultura di 50 mL per lavaggio) con x 500 g di spin a 4 ° C per 5 min e risospendere il pellet cellulare lavato in un adeguato volume di tampone di omogeneizzazione su ghiaccio.
   Nota: il volume dovrebbe essere basato sui requisiti di concentrazione nella proteina negli esperimenti previsti, nonché il volume minimo/massimo consentito della bomba di rottura delle cellule. Una linea guida generale è 2-10 x 10 ⁷ cellule/mL, o a pellet circa 10 volumi della cella. Questo protocollo è ottimizzato per i tre piatti di 15 cm di cellule HEK-293 in 2 mL di buffer di omogeneizzazione.

3. Cavitazione di azoto

1. trasferimento la sospensione cellulare a una bomba pulita e rilassante in un bagno di ghiaccio su scalpore piastra.
   Attenzione: La bomba ha ad alta pressione, bassa temperatura, gas azoto – indossare protezione personale appropriato .
2. Inserire un micro ancoretta magnetica all'interno della bomba e accendere la piastra stir per mantenere omogeneità sospensione.
3. Aggiungere una compressa di inibitore della proteasi alla sospensione e chiudere la bomba al produttore ' Istruzione s.
4. Pressurizzare gradualmente la bomba con un serbatoio di gas di azoto per fabbricante ' s istruzione fino al manometro bomba legge 300-600 psi. Chiudere tutte le valvole e scollegare il serbatoio di azoto.
   Nota: La pressione necessaria può variare con il tipo di cella. Qui abbiamo effettuato cavitazione a 350-400 psi per cellule HEK-293, NIH-3T3 e Jurkat.
5. Aspettare 20 minuti consentire l'azoto sciogliere e raggiungere l'equilibrio all'interno delle cellule.
6. Rimuovere l'acqua in eccesso attorno alla valvola di scarico con un tovagliolo di stoffa. Aprire la valvola di scarico delicatamente per ottenere un rilascio goccia a goccia dell'omogeneato e raccogliere in un tubo da 15 mL pre-refrigerati.
   Nota: Vicino alla fine della raccolta ci sarà un getto dell'omogeneato e gas emergerà con un sibilo. Assicurarsi che il gas non causa precedentemente raccolto cavitano per sparare fuori dal tubo (da qui l'uso di 15 mL tubi anziché provette da 1,5 mL). Una volta che il getto viene avviato, chiudere la valvola di scarico e aprire il rubinetto dell'azoto bruscamente per depressurizzare la bomba e raggiungere la cavitazione delle cellule restanti nella bomba. Aperta la bomba per cavitazione recupero e pulizia accurata.
   Nota: Il cavitate finale dovrebbe avere un aspetto lattiginoso con schiuma sulla parte superiore. Mescolare delicatamente con un puntale per consentire la schiuma a scemare prima centrifugazione.
   Nota: Esaminare il cavitate da microscopia di contrasto di fase per determinare l'efficienza di omogeneizzazione. Aggiungere una goccia di 15 µ l di cavitazione alla superficie di una diapositiva di microscopia e coprire con un vetrino coprioggetti. Ripetere il punto 3.4-3.6 solo se troppi ininterrotte cellule vengono rilevati con un obiettivo X 20.
   Nota: Se il buffer di omogeneizzazione non contiene EDTA o EGTA, aggiungerlo ai raccolti cavitano ad una concentrazione finale di 1 mM entro 5 min dopo la dimissione.

4. Separazione delle frazioni della membrana e citosolica

1. centrifuga cavitate a 500 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere cellule ininterrotte e nuclei.
   Nota: Ripetere la fase di centrifugazione non visibile a pellet è prodotto e raccogliere il surnatante nucleare Post (PNS) evitando la schiuma che galleggia sulla parte superiore. Ri-Centrifugare la schiuma per raccogliere e combinare PNS, ulteriormente se necessario ( Figura 1).
2. Elaborare il PNS come desiderato per ottenere frazioni di interesse. Ai fini della separazione citosolico e frazioni della membrana, trasferire il PNS in una provetta ultracentrifuga ed eseguire ultracentrifugazione come desiderato. Questo protocollo è ottimizzato per un < 3,5 mL di campione in un tubo di policarbonato ultracentrifuga e per ultracentrifugazione a 350.000 x g per 1 h a 4 ° C.
3. Raccogliere il surnatante (la frazione S) usando una pipetta da 1 mL.
4. Risciacquare accuratamente il pellet con 3 mL di PBS freddo senza disturbarla. Rimuovere il PBS dal vuoto.
   Nota: Se la contaminazione della frazione della membrana di proteine citosoliche è una preoccupazione maggiore rispetto alla perdita di campione, risospendere il pellet in 3 mL di PBS freddo e re-ultracentrifuga come descritto al punto 4.2. Rimuovere il PBS dal vuoto.
5. Risospendere il pellet completamente in un appropriato volume di tampone di solubilizzazione contenente detersivo di scelta. Per raggiungere l'equivalente di cella, utilizzare lo stesso volume di tampone di solubilizzazione come frazione citosolica.
   Nota: Si consiglia di utilizzare 1 x RIPA buffer come buffer di solubilizzazione per estrazione di proteine di membrana efficiente. Se nessun test a valle è necessaria per la frazione della membrana, utilizzare 1 x laemmli tampone per estrazione di proteine di membrana maximal.
   Nota: Consigliamo di sloggiare e trasferendo il pellet nel buffer di solubilizzazione in una provetta pulita in un rotatore tubo a 4 ° C per estrazione di proteine di membrana maximal.
   Nota: Se la pallina è troppo appiccicosi (troppi lipidi) per essere rimosso in modo efficiente da thtubo di ultracentrifuga e nel buffer di solubilizzazione, suggeriamo lo snap il pellet di congelamento in azoto liquido e rapidamente sloggiare il pellet dal tubo ultracentrifuga con una spatola di metallo mini prima il pellet si scongela.
   Nota: In alternativa, membrana pellet può essere solo risospese e non solubilizzati in un buffer non contenente detersivo per produrre una frazione P di sospensione delle vescicole di membrana, nel qual caso la centrifugazione passo in 4.6 non è richiesto. Tali frazioni di P sono utili quando indagare funzioni quali attività enzimatiche che dipendono dalla membrana associazione.
6. Centrifugare la sospensione a pellet completamente solubilizzata dal passaggio 4.5 a 20.000 x g in una centrifuga da tavolo per 10 min a 4 ° C. raccogliere il surnatante con una pipetta da 1 mL (la frazione di P) e scartare il pellet (lipidi insolubili).
7. Effettuare saggi desiderate come macchiarsi occidentale con le frazioni citosoliche e/o membrana, o salvarli a-80 ° C per un uso futuro.

Risultati

La figura 2 Mostra il partizionamento delle proteine cellulari da PNS in frazione citosolica solubili (S) o frazione della membrana della pallina (P). Abbiamo esaminato tre linee cellulari rappresentative da diversi tipi di cellule: HEK-293 (epiteliali), NIH-3T3 (fibroblasti) e Jurkat (linfociti). Inibitore di Rho guanina dissociazione (RhoGDI) e recettore di cationi-indipendente mannosio-6-fosfato (CIMPR) sono stati utilizzati come controlli positivi per cit...

Discussione

I vantaggi della cavitazione di azoto rispetto ad altri metodi di rottura meccanica sono molteplici. Forse il vantaggio più significativo è la sua capacità a delicatamente ma efficacemente omogeneizzare campioni. I principi fisici di decompressione si raffredda campioni invece di generare riscaldamento locale danni quali ultrasuoni e attrito/tosatura basato su tecniche. La cavitazione è anche estremamente efficiente a perturbare la membrana plasmatica. Perché l'azoto bolle vengono generate all'interno di ogni singol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL)	Parr Instrument	4639	Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL)	Kontes	885300-0002	Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½	Becton Dickinson	329461	Needle
Atg12 antibody	Santa Cruz	271688	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody	Santa Cruz	47778	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody	DSHB	E7-s	Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody	Santa Cruz	23954	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody	Santa Cruz	373863	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody	Santa Cruz	271803	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody	Abcam	124767	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody	Santa Cruz	137130	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody	Santa Cruz	373746	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody	Santa Cruz	514419	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody	Santa Cruz	55597	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody	Santa Cruz	374022	Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody	Santa Cruz	59820	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody	Santa Cruz	81598	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody	Cell Signaling Technology	2024S	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody	Santa Cruz	376248	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody	DSHB	H4A3-c	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody	Santa Cruz	48345	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody	Abcam	137029	Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody	Thermo	MA3-067	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody	Santa Cruz	398052	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody	Santa Cruz	360	Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody	Santa Cruz	74459	Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody	Santa Cruz	12322	Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	349622	Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor	Beckman Coulter	349481	rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge	Beckman Coulter	364300	ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11697498001	protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade	Corning	353089	large cell scraper
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-57SIX	micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer	Fisher Scientific	S504501AS	magnetic stirrer