Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء تحليل تمثل أدوات تجريبية للتحقيق التوازن الدوبامين في الفئران بعد تقييم وظيفة نقل الدوبامين ومستويات الدوبامين في نسيج سترياتال، وامتصاص الدوبامين سينابتوسومال على التوالي. نقدم هنا بروتوكولات لقياس محتوى الأنسجة الدوبامين وتقييم الأداء الوظيفي للناقل الدوبامين.

Abstract

الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري السيطرة على النشاط الحركي ومكافأة العمليات والوظائف المعرفية. ضعف كبيرة تتميز (دايرجيك) يرتبط ارتباطاً قويا بالعديد من الأمراض المرتبطة بالجهاز العصبي المركزي مثل مرض باركنسون، واضطراب نقص الانتباه-العجز-فرط النشاط وإدمان المخدرات1،2 ،،من34. تحديد آليات الأمراض التي تنطوي على خلل دا يتوقف بصورة حاسمة على نماذج حيوانية تحاكي جوانب الأمراض، وهكذا البروتوكولات التي تقييم أجزاء معينة من التوازن دا مهم لتقديم رؤى جديدة وممكن العلاجية أهدافا لهذه الأمراض.

هنا، نحن نقدم اثنين من البروتوكولات التجريبية مفيدة أن عند الجمع بينها وتوفر قراءة وظيفية للنظام دايرجيك في الفئران. يتم الحصول على المعلمات البيوكيميائية والوظيفية على التوازن دا من خلال تقييم مستويات دا والدوبامين وظيفة الناقل (دات)5. عند التحقيق في النظام دا، القدرة على قياس موثوق بها مستويات الذاتية دا من الدماغ الكبار أمر أساسي. ولذلك، نقدم على كيفية أداء كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) في أنسجة المخ من الفئران لتحديد مستويات التنمية. ونحن إجراء التجربة على الأنسجة من المخطط الظهرية (دستر) ونواة accumbens (NAc)، ولكن الأسلوب أيضا مناسبة للمناطق الأخرى في المخ معصب دا.

دات ضروري لامتصاص دا إلى المحطة presynaptic، وبالتالي السيطرة على النشاط الزماني والمكاني في صدر جدول أعمال التنمية. معرفة مستويات ووظائف دات في المخطط أهمية كبرى عند تقييم التوازن دا. هنا، نحن نقدم بروتوكول يسمح للاستدلال في نفس الوقت معلومات عن مستويات السطحية ودالة باستخدام مقايسة امتصاص سينابتوسومال6 دا.

توفر الأساليب الحالية جنبا إلى جنب مع البروتوكولات القياسية إيمونوبلوتينج الباحث بالأدوات ذات الصلة لوصف النظام دايرجيك.

Introduction

الدوبامين (DA) ناقل عصبي مودولاتوري حاسمة بالنسبة للسلوك الحركي والمكافأة والوظائف المعرفية1،7،،من89. الاختلالات في التوازن دا متورطة في العديد من الأمراض العصبية مثل الاهتمام-اضطراب فرط النشاط، وإدمان المخدرات والاكتئاب ومرض باركنسون1. يتم تحريرها دا من العصبية presynaptic في المشقوق متشابك، حيث يربط وينشط المستقبلات على غشاء ما قبل وبوستسينابتيك، وبالتالي زيادة نقل الإشارات. مستوى دا في المشبك بعد إطلاق سراح يسيطر دات3،10مكانياً وزمنياً. الناقل تبتلع دا من الفضاء خارج الخلية، وهكذا تحافظ على مستويات دا الفسيولوجية3،11. الأسباب الوراثية إزالة دات في الفئران من هايبردوبامينيرجيك النمط الظاهري تتميز بمستويات مرتفعة من دا متشابك، استنفاد مجمعات دا داخل الخلايا وتغيرات عميقة في دايرجيك بوستسينابتيك يشير إلى10،12.

هنا، تعرض اثنين من بروتوكولات منفصلة، أسلوب واحد لمحتوى الأنسجة التدبير دا وأخرى لتقييم الأداء الوظيفي ل dat. المجمعة مع الإنزيم بيوتينيليشن السطحية ووصف غابرييل et al.13 هذان الأسلوبان يوفر معلومات عن دا المحتوى ووظيفية مستويات دات لإجراء تقييم دقيق للتوازن دا. مع هذه الأساليب يمكن وصف التوازن دا الفئران المحورة وراثيا أو نماذج الأمراض المختلفة ووصف. تم تنفيذ هذه الأدوات والأمثل ويتم استخدام القياسية في مختبراتنا. عملت فحوصات الحالية للتحقيق في الآثار على التوازن دا لتغيير ج--المحطة الطرفية دات14 أو التعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية تحت المروج تيروزين hydroxylase (TH) 5.

Protocol

المبادئ التوجيهية "مفتشية التجريب الحيوان الدانمركية" (رقم إذن: 2017-15-0201-01160) أعقب وإجراء التجارب في منشأة آآلاك المعتمدة كاملة تحت إشراف رعاية الحيوانات المحلية اللجنة-

1-"امتصاص الدوبامين سينابتوسومال" (أسلوب 1)

ملاحظة: هذا البروتوكول هو تقييم موازية لاثنين من العقول، ولكن يمكن أن تستخدم بنجاح القيام بتجارب الامتصاص دا سينابتوسومال مع العقول الأربعة في متوازي.

  1. أنابيب الاستعدادات
    1. تسمية 48 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي في الجدول 1 (24 لكل الدماغ). استخدام ألوان مختلفة لأنابيب المنتمين إلى كل الدماغ لمنع الالتباس بين عينات
    2. التﻷلؤ 51 تسمية أنابيب #1-51-
      3. فوسفات
    3. مكان مخزنة المالحة (PBS) على الجليد. سيتم استخدام هذا للحفاظ على العقول مبردة.
    4. تشغيل أجهزة الطرد المركزي للسماح لتبرد قبل إلى 4 درجة مئوية.
    5. قبل تزن أنبوبين مايكرو--أجهزة الطرد المركزي للحصول على وزن الأنسجة الدقيقة أثناء إعداد سينابتوسومال (قسم 2.6).
    6. التجانس إعداد المخزن المؤقت عن طريق خلط السكروز حبيس و 0.32 م 4 مم. ضبط ال pH إلى 7.4 والحفاظ على مدت
      ملاحظة: التجانس المخزن المؤقت يمكن الاحتفاظ بها في مختبرين في-20 درجة مئوية ومذاب يوم التجربة.
      7. المخزن المؤقت لامتصاص
    7. تحضير عن طريق الجمع بين ما يلي: 25 مم هيبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم كاكل 2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر). ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم (يؤدي إلى تركيز صوديوم حوالي 130 مم) والحفاظ على مدت
      ملاحظة: للعقول 2، إعداد المخزن المؤقت لاستيعاب 1500 مل. إعداد المخزن المؤقت لامتصاص 10 × الحل الأسهم دون حمض الأسكوربيك والجلوكوز في 4 ° جعل جيم 1 × الحل العامل طازجة اليوم، المكمل مع حمض الأسكوربيك والسكر. ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.4.
      8. المخزن المؤقت لامتصاص إعداد
    8. + يجند بالجمع بين ما يلي: 25 مم هيبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم CaC l2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر)، 1 ميكرومتر بارجيليني، 100 نانومتر desipramine، 10 نانومتر مثبط الكاتيتشول-O-الميثيل-ترانسفيراز (ضميرياً). ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، والحفاظ على مدت
      ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت لاستيعاب 50 مل وإضافة [ليغند]. تتم إضافة بارجيليني للمساعدة في منع تدهور دا بالاكسدة عن طريق مونوأمين أوكسيديز (ماو). يتم إضافة ضميرياً المانع (RO-41-0960) للحيلولة دون تردي دا (الكاتيشولامين بصورة عامة) من خلال ضميرياً. ديسيبراميني إضافة إلى تمنع امتصاص عن طريق الناقلين السيروتونين وإفراز، ومما جعل الإقبال على نتائج محددة دات
      9. المخزن المؤقت لامتصاص إعداد
    9. + يجند الكوكايين عن طريق الجمع بين ما يلي: 25 مم حبيس، 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.2 مم كاكل 2، 1.2 مم MgSO 4، 1 ملم حمض الأسكوربيك (0.194 غرام/لتر)، 5 ملم د-الجلوكوز (0.991 غرام/لتر)، 1 ميكرومتر بارجيليني، 100 نانومتر desipramine ، 10 نانومتر ضميرياً المانع، والكوكايين 500 ميكرومتر. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، والحفاظ على مدت
      ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت لاستيعاب 7 مل + يجند وإضافة الكوكايين. يتم إضافة الكوكايين للحصول على قياس خلفية لامتصاص دا غير محددة للطرح من البيانات، وترك استيعاب DAT محددة فقط (حيث هي إعاقة سيرة وصافي من ديسيبراميني كما هو موضح أعلاه). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مثبط دات قوية للغاية ومحددة روسيدسكي-12935، بدلاً من ذلك-
      هام: إبقاء كل شيء على الجليد من الآن فصاعدا .
  2. سينابتوسومال إعداد
    1. التضحية ماوس واحدة في وقت واحد بالتفسخ عنق الرحم وقطع الرأس.
    2. قطع الجلد باستخدام مقص لتكشف عن الجمجمة وقطع أي مؤخرة الأنسجة الزائدة من يسار الجمجمة من قطع الرأس. قطع الجمجمة مع مقص مستقيمة صغيرة على طول ساجيتاليس سوتورا تنتهي إلى الأسفل قدر الإمكان.
    3. وضع نصائح مقص اثنين في كل عين من الماوس وقطع طريق الجمجمة لإزالة ما تبقى من الجمجمة والدماغ سليمة. سرعة إزالة الدماغ ووضعه في برنامج تلفزيوني المثلج. هذا وسوف تبقى من البرد، بينما الثاني هو تشريح الدماغ.
    4. استخدام مصفوفة الدماغ، تشريح شريحة الاكليلية 3 مم من المخطط (الأمامي الخلفي: +1.5 مم-1.50 مم) متبوعاً بالتشريح الدقيقة مع تثقيب. انظر الشكل 1 لمنطقة لكمه.
    5. الحفاظ على الأنسجة على الجليد في جميع الأوقات المضي قدما-
    6. نقل الأنسجة إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.5 مل لوزنها.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذا الوزن في خطوة 1.2.14-
    7. كرر الخطوة 1.2.1-1.2.6 للدماغ الثاني.
    8. مرة واحدة وقد تم الحصول على الوزن لكل العقول، نقل الأنسجة لزجاج تجانس الذي يحتوي على 1 مل من المخزن المؤقت لتجانس المثلج.
    9. مجانسة الأنسجة باستخدام مدقة مدفوعة موتور 800 لفة في الدقيقة، السكتات الدماغية حتى 10-
      ملاحظة: ضربة واحدة يساوي واحد إلى أعلى وأسفل العمل، ينبغي أن تكون السكتة الدماغية الأولى حوالي 5 ق، ما يلي 3-4 س. التجانس في المتوسط متساوي التوتر مهم لمنع انفجار سينابتوسوميس 6. استخدام القوة المناسبة والمتوسطة متساوي التوتر سيسمح المحطات بريسينابتيك لإعادة ختم أرفق السيتوبلازم وحويصلات متشابك، الميتوكوندريا وسيتوسكيليتون 15-
    10. نقل هوموجيناتي إلى 1.5 مل أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي وتجميع هوموجيناتي المتبقية من الزجاج التجانس قبل الشطف مع المخزن المؤقت لتجانس إضافية 0.5 مل.
    11. تبقى العينة على الجليد بينما هو تجانس الأنسجة من الدماغ الأخرى. تشغيل العقول اثنين في نفس الوقت في الخطوات 1.2.12-1.2.13.
    12. بيليه الأنوية وخلية الحطام بالطرد المركزي (1,000 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية)-
    13. نقل المادة طافية (S1) (التي تحتوي على أغشية الخلية، والسيتوبلازم) إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة والطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 20 دقيقة في 4 ° C.
    14. تجاهل المادة طافية (التي تحتوي على السيتوبلازم) وريسوسبيند بيليه (P2) (التي تحتوي على سينابتوسوميس النفط الخام) في المخزن المؤقت لتجانس ميكروليتر 40/mg الأنسجة (استناداً إلى الوزن التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.6). ريسوسبيند الكسر سينابتوسومال النفط الخام مع ماصة p1000 لطف كما سيتم قطع الكثير من القوة في سينابتوسوميس-
      ملاحظة: من المهم في نهاية المطاف مع ميكروليتر 280 على الأقل. إذا لم يكن الأمر كذلك، تمييع مع أكثر من 40 ميكروليتر كل مغ سيكون ضروريا. 1.2.1-1.2.13 خطوات يجب أن يتم في أسرع وقت ممكن، وكل شيء يجب أن تبقى على الجليد. بمجرد قد تم حراكه سينابتوسوميس الخام في المخزن المؤقت للتجانس فمستقرة إلى حد ما طالما يتم الاحتفاظ بها على الجليد 6 ، ، من 15 16-

2. تجربة امتصاص

المخزن المؤقت لامتصاص
  1. ميكروليتر إضافة 440 + يجند الكوكايين للأنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل 12 المعينة والعازلة امتصاص ميكروليتر 440 + يجند إلى 36 المتبقية 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب (انظر الجدول 1 للتخطيط)-
    ملاحظة: إزالتها من الجليد 15 دقيقة قبل البدء التجربة إلى تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة، ولكن تبقى على الجليد حتى ثم للحفاظ على مثبطات.
  2. تحضير منحنى التشبع (الدوبامين (2، 5، 6-[3H]-DA) (3-ح الدوبامين) (91.1 Ci/ملمول) بتركيزات مختلفة النهائي (0.031 0.0625، 0.125، 0.25، 0.5 و 1.0 ميكرومتر)).
    1. تسمية ستة أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل 10 و 5، 2.5، 1.25، 0.62 و 0.31-
    2. المخزن المؤقت لامتصاص ميكروليتر إضافة 750 + يجند للأنابيب ميكروسينتريفوجي 5 مع عدد أدنى.
    3. المخزن المؤقت لامتصاص ميكروليتر 1,455.4 إضافة + يجند، 14.6 الدوبامين ميكروليتر (1 ملم)، ميكروليتر 30 3-ح الدوبامين (11 ميكرومتر) إلى الأنبوب المسمى 10-
    4. نقل 750 ميكروليتر من الأنبوب المسمى 10 إلى الأنبوب المسمى 5. مزيج جيد ونقل 750 ميكروليتر من هذا الأنبوب إلى الأنبوب 2.5. كرر هذا التخفيف مع أنابيب المتبقية.
  3. قبل شطف مرشحات ستوكات الزجاج مع المخزن المؤقت لامتصاص 4 مل بعد وضعها في دلو تصفية جيدا 12-
    4. أنابيب
  4. ميكروليتر 10 إضافة تعليق غشاء سينابتوسومال إلى 24 الأولى 1.5 مل مايكرو--أجهزة الطرد المركزي (انظر الجدول 1 للتخطيط) التي تحتوي على 440 ميكروليتر العازلة. الدوامة بعناية وتدور أسفل قريبا لضمان أن سينابتوسوميس مغمورة في المخزن المؤقت. ترك في 37 س ج للحد الأدنى 10
    ملاحظة: من المهم على وجه الدقة في أوقات خلال التجربة الإقبال مقارنة منصفة بين العقول. استخدام ساعة توقيت للدقة.
    5. الدوبامين
  5. إضافة 50 ميكروليتر من تركيز 10 و 5 ميكرومترات (القسم 2-2) في أول عمودين وإجازة في 37 س ج لمدة 5 دقائق مع الهز. بعد 5 دقائق بالضبط، وقف رد الفعل بإضافة 1 مل امتصاص المثلج المخزن المؤقت. تفعل الشيء نفسه مع تركيز 2.5 و 1.25 ميكرومتر (القسم 2-2)، ومن ثم مع تركيز 0.62 و 0.31 ميكرومترات.
    6. إضافة العينات للمرشحات ستوكات قبل مشطوف
  6. وتغسل مع المخزن المؤقت لامتصاص المثلج مل 5 × 4. عندما تم إضافة العينات 12 أولاً إلى عوامل التصفية، وتحريك عوامل التصفية لأنابيب التﻷلؤ. كرر هذه العملية مع العينات التالية 12-
  7. كرر الخطوة 2.4-2.6 للدماغ المقبل.
  8. عد ماكس 3 إعداد أنابيب بوضع عامل تصفية ستوكات في الجزء السفلي من الأنابيب التﻷلؤ 49-51 وإضافة 25 ميليلتر من تركيز الدوبامين كحد أقصى في الأعلى (10 ميكرومترات).
  9. ترك جميع الأنابيب التﻷلؤ 51 في غطاء دخان حاء – 1
  10. أضف 3 مل التﻷلؤ السائل إلى كل أنبوب التﻷلؤ وهزه قوية في شاكر حاء – 1
  11. العد [ح] 3 [--دا في عداد بيتا للحد الأدنى 1
    1. افتح البرنامج واختر: التسمية: H-3، لوحة/تصفية: قنينة مل 4، 4 من 6، نوع الفحص: عادي وحساب الوقت: 1 كحد أدنى
      ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يؤديها في اليوم التالي إذا كان أكثر ملاءمة. ترك عينات مغطاة بالقصدير إحباط طوال الليل-
  12. تحديد البروتين
    1. استخدام أدوات "مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي" قياسية لتحديد تركيزات البروتين سينابتوسوميس لتعديلات من التهم الموجهة إليه في الدقيقة (cpm) ميكروغرام/فمول/دقيقة ومقارنة سليمة لامتصاص بين العينات.

3. تحليل بيانات

  1. استخدام البيانات من الاستيعاب التجربة جعل تشبع منحنى لكل مجموعة، وحساب معدل رد الفعل (V max) وثابت ميكايليس مينتين (ك م)-
    ملاحظة: القيمة ك م يعكس تركيز الركيزة اللازمة للوصول إلى نصف الخامس كحد أقصى. وبناء على ذلك، الخامس ماكس مباشرة يعكس وظيفة DAT (القدرة على امتصاص الحد الأقصى)، الذي يعتمد على عدد دات على السطح وكيف يمكن التضمين نشاطها بتعديلات بوسترانسلاشونال و/أو البروتينات المتفاعلة وكذلك على التعديلات في التدرجات أيون. القيمة ك م تدبير غير مباشر لتقارب الركيزة للناقل أن الأهم من ذلك أيضا يمكن أن يكون عن طريق التعديلات بوسترانسلاشونال و/أو البروتينات المتفاعلة التضمين. إجراء تقييم كامل للتغييرات الوظيفية المهم وبالتالي لتحديد مستويات التعبير السطحي مباشرة بها على سبيل المثال مقايسة بيوتينيليشن سطحية. وقد استعرضت وصفاً لامتصاص الدوبامين، ووضع على معنى القيم ماكس ك م والخامس شميتز et al. 17-

4. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (أسلوب 2)

  1. تشريح المخ
    1. أنابيب ميكروسينتريفوجي التسمية ووزنها؛ وواحدة في المنطقة الواحدة والماوس.
      2. التضحية
    2. ماوس واحدة في وقت واحد بالتفسخ عنق الرحم وقطع الرأس. سرعة إزالة الدماغ كما هو موضح في القسم 1-2. كذلك إجراء تشريح فورا.
    3. باستخدام مصفوفة الدماغ، تشريح شريحة الاكليلية 3 مم من المخطط تليها الدقيقة الثنائية تشريح بريدًا ودستر مع تثقيب. انظر الشكل 3 لناحية لكمه.
      4. نقل الأنسجة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب
    4. ووضع بسرعة على الثلج الجاف. وزن الأنسجة ووضعه مرة أخرى على الجليد الجاف فورا.
      ملاحظة: وزن الأنسجة مهم لحساب تركيز لاحقاً.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. تكرار الخطوات مع الماوس المقبل.
      ملاحظة: وضع الأنسجة في 80 س ج حتى مزيد من المعالجة أو تشرع فورا في معالجة الأنسجة.

5. إعداد الأنسجة

  1. بدوره على أجهزة الطرد المركزي للسماح لها لتبرد قبل إلى 4 درجة مئوية
  2. تعد الحل التجانس (بيرتشلوريك N 0.1 حمض (هكلو 4))، والحفاظ على مدت
  3. استخدام تجانس الحل، إعداد معيار طازجة 0.1 pmol/ميكروليتر دوبامين من حل أسهم 1 مم (إضعاف 10,000 x)-
    ملاحظة: تعد الحل الأسهم تذويب الدوبامين في المخزن المؤقت للتجانس إلى تركز أسهم 1 ملم، والتي يمكن أن تبقى في 20 درجة مئوية لمدة شهر تقريبا. إذا كانت مناطق أخرى من الدماغ للفائدة، وسيكون تركيز المعيار إلى تعديل، منذ مناطق الدماغ الأخرى بما في ذلك قشرة بريفرونترال، الحصين والرمادية في الدماغ ومنطقة تيجمينتال البطني تمتلك دا يصل إلى 100 مرة أقل مقارنة بالمخطط-
    4. إضافة 500 ميكروليتر التجانس الحل لكل عينة (أي سي بريدًا ودستر الأنسجة؛ الفرع 4-1)
  4. وتجانسه العينات باستخدام الترا-الخالطون على السرعة الكاملة لإبقاء حوالي 30 س. العينة في الماء المثلج أثناء التجانس. بين كل عينة، الخالطون الترا مع المياه النظيفة (كامل السرعة لمدة 30 ثانية)-
  5. الطرد المركزي في نماذج لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية، 14,000 غ. س
  6. نقل ما يقرب من 200 ميكروليتر عينة إلى عامل تصفية ميكرومترات زجاج 0.22 (قطرها 1 سم) باستخدام المحاقن بلاستيكية 1 مل.
    ملاحظة: استخدام المرشحات الزجاج غير هامة، طالما عوامل التصفية اختار 0.22 ميكرومتر لإزالة المواد المرتفعة الوزن الجزيئي.
  7. تحليل العينات بكشف الكهروكيميائية (EC)-[هبلك] منهجية 18 كما هو موضح في القسم 6-

6. تحليل كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء

حل
  1. تحضير التالية لمرحلة الجوال: خلات الصوديوم 55 مم، حمض أوكتانيسولفونيك 1 مم، غ 2 يدتا 0.1 ملم، الاسيتو الانيتريل 8%، حمض الخليك 0.1 M، درجة الحموضة = 3.2.
    ملاحظة: ضبط الأس الهيدروجيني مع حمض الخليك 0.1 متر. من المهم أن يكون دقيقا مع درجة الحموضة. وينبغي أن يكون الحل ديجاسي(د) التي ديجاسير على الخط (جزءا لا يتجزأ من النظام [هبلك]). جعل L 2 المرحلة المتنقلة وتغييره عن مرة واحدة في شهر (تغييره عندما يحصل على الضجيج ملحوظ). بسبب التقلبات ويستغرق حوالي 24 ساعة لضبط بعد تغيير المرحلة المتنقلة-
  2. إنشاء كاشف:
    1. مجموعة فولت الإخراج إلى 700 mV ودرجه حرارة 32 درجة مئوية في الفرن الكاشف؛ وهذا أمر مهم جداً. جعل برنامج نطاق باستخدام دليل على الإنترنت. راجع الدليل لمزيد من التفاصيل). إضافة البرنامج الوقت وفقا الجدول 2-
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تم تعيين البرنامج تغيير الحالي في الاحتفاظ بتعيين الأوقات، للحفاظ [هبلك] الحالية الأمثل وللحفاظ على قمم chromatogram كتوسيع نطاق ممكن، ولكن لا يزال داخل طريقة العرض تلقائياً. هذا وقد تم تحسين ل striatal الدماغ ليساتيس من الفئران.
  3. عندما تم إضافة البرنامج إلى الجهاز، جعل منحنى معايرة نقطة 3، وثلاث مرات بالحقن القياسية (5 و 10 و 15 ميكروليتر)-
    ملاحظة: المعيار (10 ميكروليتر (ميكروليتر 10 × 0.1 pmol/ميكروليتر = 1 بمول دا)) ينبغي أن يكون حقن كل عينة العاشرة، والعينات معايرة مستوى أقرب. غرامة ضبط النظام السابق اليوم بتعديل المعيار 3-نقطة، والتحقق إذا كان يخرج chromatogram ضمن النطاق المتوقع. إذا كان من الملاحظ ضوضاء كبيرة، تغيير المرحلة المتنقلة. إذا ذروة أعلى من 990 أم ثم إعادة حقن العينة في حجم أقل، أو جعل برنامج مجموعة جديدة ومنحني قياسي جديد. يتم قياس حدود الكشف عن 3 مرات قيمة الضوضاء في المتوسط إلى أقل قيمة الذروة لحقن لكل معيار (NA، دوباك، دا، 5-حياة، هبا، 3-طن و 5-HT).
    1. نظام الإنشاء بفتح الحل LC وتفعيل التحليل 1؛ وهذا يبدأ في وضع الاتصال. اكتب معرف المستخدم وكلمة المرور، ثم انقر فوق موافق. انتظر الحل LC للاتصال للصكوك. انتقل إلى جدول الدفعات وملء البيانات والمعلومات (مثلاً، نوع العينة: غير معروف للأمراض المنقولة جنسياً وعينات لنوع التحليل القياسي،: "أنه كيو تي"، حجم inj: 10، ISTD التونسيين: يخدع المستوى 1). احفظ الملف (الذهاب إلى ملف--> حفظ الملف الدفعي ك-> حفظ)-
    2. جعل النظام يقوم بحقن العينة الأولى بالضغط على ' "بدء الدفعية" '. هذا سيؤدي إلى ضخ 10 ميكروليتر عينة من أوتوسامبلير مع وحدة نمطية لإيصال المذيبات.
      ملاحظة: استخدم معدل تدفق مضخة 0.15 مل/دقيقة وعمود C18 بعكس المرحلة. واستخدمت هنا كشف أمبيروميتريك لكشف الكهروكيميائية. يجب تعيين مسرى الكربون زجاجي إلى 0.8 الخامس مع قطب مرجعي Ag/AgCl. من أجل الاعتداء الدوبامين، استخدم 3 اللوني μ C18 (3) المواد المستنفدة للأوزون (دا 2 مم × 100 مم، الجسيمات حجم 3 ميكرومتر) تحقيق الفصل الكروماتوغرافي.
    3. استخراج مجالات ذروة مسجل ومحسوب.
      1. الذهاب للحصول على البيانات لمتابعة في chromatogram عند الانتهاء من العينات. انتقل إلى وظيفة تشغيل تحليل-Lc > اختيار اسم الملف (سيتم فتح chromatogram)-> انقر فوق عرض. شريط التكامل اليدوي، إضافة كافة قمم تكون متكاملة-> انتقل إلى تقرير البيانات وطباعتها في القراءة-
        ملاحظة: هنا استخدمت البرمجيات الحل LC لمراقبة النظام وتحليل البيانات-
  4. من المناطق الذروة، حساب تركيز الدوبامين في عينة، على النحو التالي باستخدام تركيز القياسية المعروفة:
    1. استخدام منطقة الذروة المعيار (يساوي 1 pmol) للحصول على عامل ألف
      figure-protocol-16222
    2. استخدام عامل للحصول على تركيز العينات.
      تركيز العينة (في بمول الواحدة 10 ميكروليتر) = معامل A × ذروة مجال العينة
    3. باستخدام هذه الصيغة للحصول على تركيز العينة في الحرس الوطني-
      عينة تركيز pmol/10 ميليلتر ميليلتر x 500 x MW الدوبامين = تركيز العينة في الحرس الوطني
      عينة تركيز (بالحرس الوطني) = تركيز العينة (في بمول الواحدة 10 ميكروليتر) × 500 ميكروليتر x MW الدوبامين
    4. استخدام تركيز العينة في الحرس الوطني للحصول على تي أنه نموذج التركيز في أنسجة جزء من الغرام/غرام (عينة تركز في جزء من الغرام/ز الأنسجة = الأنسجة pg/g).

النتائج

ويشمل البروتوكول امتصاص دا الحالية (الشكل 1) جميع الخطوات اللازمة لتقييم الأداء الوظيفي لدات في سينابتوسوميس من الفئران. لدينا بيانات تمثيلية لأسلوب امتصاص دا (الشكل 2) يصور منحنى تشبع مع البيانات غير المعدلة (الشكل 2B) وتعد?...

Discussion

ويصف هذه المخطوطة البروتوكولات التجريبية مفيدة لتحديد التوازن دا في أي نموذج الماوس للاختيار. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لقياس مستويات دا في أنسجة المخ من الفئران باستخدام [هبلك]، وامتصاص دا سينابتوسومال لتقييم النقل دا الوظيفية عن طريق دات. وسيتم وضع الإجراءات والبروتوكولات وحدود للتج?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمه التميز برنامج عام 2016 أوكف (عنوان، أ. ر.، K.J.)، ومؤسسة Lundbeck (محمد) مركز مؤسسة Lundbeck بيوميمبرانيس في "لطب النانوي" (عنوان)، الوطني معهد للصحة منح P01 DA 12408 (عنوان)، الدانمرك مجلس للبحوث المستقلة-العلوم الطبية (عنوان).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
COMT inhibitorSigma Aldrich, GermanyRO-41-0960For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCFor synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluidPerkin Elmer1200-437For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2Perkin ElmerFor synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225For synaptosomal DA uptake protocol
HEPESSigma Life ScienceH3375For synaptosomal DA uptake protocol
SucroseSigma Life ScienceS7903For synaptosomal DA uptake protocol
NaClSigma Life ScienceS3014For synaptosomal DA uptake protocol
KClSigma Life ScienceP9541For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4Sigma Life Science63065For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278For synaptosomal DA uptake protocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021For synaptosomal DA uptake protocol
PargylineSigma AldrichP-8013For synaptosomal DA uptake protocol
DesipramineSigma AldrichD3900For synaptosomal DA uptake protocol
DopamineSigma Life ScienceH8502For synaptosomal DA uptake protocol
CocaineSigma Life ScienceC5776For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CFor synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupterBuch & HolmDiscontinuedFor synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)Antec, Leiden, The NetherlandsDiscontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filterFrisenette ApS, Denmark13CP020ASFor HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, GermanyPart Number:00A-3300-E0For HPLC protocol
LC solution softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationFor HPLC protocol
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlFor HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTASigmaE5134-50gFor HPLC protocol
NatriumdihydrogenphospharBie&Berntsen1.06346 1000gFor HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrateAldrich74885 -10gFor HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC gradeScharlauAC03402500For HPLC protocol
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DenmarkAvantec 13CP020ASFor HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%Merck1.00563. 1000mlFor HPLC protocol
ElectrodeAntec, Leiden, The NetherlandsAN1161300For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detectorAntec, Leiden, The NetherlandsLite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol

References

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved