JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ספיגת דופמין synaptosomal ו כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים ניתוח מייצגים ניסוי כלים לחקור דופמין הומאוסטזיס בעכברים על-ידי הערכת את הפונקציה של המשגר דופמין, רמות הדופמין ברקמת striatal, בהתאמה. כאן אנו מציגים פרוטוקולים למדוד דופמין רקמות תוכן, להעריך את הפונקציונליות של המשגר דופמין.

Abstract

דופמין (DA) הוא נוירוטרנסמיטור modulatory שליטה פעילות מוטורית, תהליכים גמול ועל התפקוד הקוגניטיבי. ירידת ערך של דופאמין (DAergic) עצבית הוא קשור מאוד עם מספר מחלות הקשורות במערכת העצבים המרכזית כגון מחלת פרקינסון, תשומת לב-קשב-היפראקטיביות וסמים התמכרות1,2 3, ,4. בהתוויית מנגנוני המחלה מעורבים דה איזון תלויה באופן ביקורתי מודלים בעלי חיים כדי לחקות את ההיבטים של המחלות, ובכך פרוטוקולים של להעריך חלקים ספציפיים של הומאוסטזיס DA חשובים לספק תובנות הרומן האפשר טיפולית מטרות עבור מחלות אלו.

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים ניסיוני שימושי זה בשילוב לספק read-out תפקודית של מערכת DAergic בעכברים. פרמטרים ביוכימיים ופונקציונליים על הומאוסטזיס DA מתקבלים באמצעות הערכה של DA רמות דופמין טרנספורטר (. DAT) פונקציונליות5. כאשר חוקרים את מערכת DA, היכולת למדוד באופן מהימן רמות אנדוגני של DA מהמוח למבוגרים הוא חיוני. לכן, אנו מציגים כיצד לבצע ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) על רקמת המוח של עכברים כדי לקבוע רמות של המחוזי. אנו מבצעים את הניסוי על רקמות הגבי סטריאטום (dStr), גרעין האקומבנס (NAc), אך השיטה מתאים גם באזורים אחרים במוח דה-innervated.

DAT הוא חיוני עבור ספיגה חוזרת של DA בטרמינל presynaptic, ובכך שולט הפעילות הגיאופוליטיות והמרחביות הטמפורלי של המחוזי שפורסמו לדעת את רמות והפונקציונליות של DAT ב סטריאטום זה חשיבות רבה בעת הערכת DA הומאוסטזיס. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המאפשר להסיק מידע על פני רמות ותפקוד שימוש assay ספיגת של synaptosomal6 DA בו זמנית.

שיטות בשילוב עם פרוטוקולים סטנדרטיים immunoblotting מספקים החוקר עם כלים רלוונטיים כדי לאפיין את המערכת DAergic.

Introduction

דופמין (DA) הוא נוירוטרנסמיטור modulatory קריטי עבור התנהגות מוטורית, פרס, התפקוד הקוגניטיבי1,7,8,9. חוסר איזון ב- DA הומאוסטזיס הם מעורבים מספר מחלות מנוטלי כמו הפרעת קשב-קשב, התמכרות לסמים, דיכאון, מחלת פרקינסון1. DA משוחרר מן הנוירון presynaptic לתוך החריץ סינפטית, איפה זה נקשר ומפעילה רצפטורים על קרום קדם ו postsynaptic, ובכך נוסף העברת האות. הרמה דה ב הסינפסה לאחר שחרור במרחב של חנותם נשלטת על ידי DAT3,10. המשגר מרחיק דא מן המרחב חוץ-תאית, ובכך ומקיימת פיזיולוגיים DA רמות3,11. הסרת גנטי של DAT בעכברים גורמת פנוטיפ hyperdopaminergic מאופיין על ידי רמות גבוהות DA סינפטית, דלדול של בריכות DA תאיים ושינויים עמוקה DAergic postsynaptic איתות10,12.

. הנה, שני פרוטוקולים נפרדים מוצגים, שיטה אחת מדד דה רקמות התוכן של אחר כדי להעריך את הפונקציונליות של במבטאו משולבים עם וזמינותו biotinylation פני השטח המתואר על ידי גבריאל ואח13 שתי שיטות אלו מספקים מידע אודות DA תוכני ופונקציונאלי רמות של DAT הערכה יסודית של DA הומאוסטזיס. באמצעות שיטות אלה DA הומאוסטזיס של העכברים הטרנסגניים או מחלת מודלים שונים יכול להיות מאופיין, תיאר. כלים אלו מיושמות, מותאם הן שימוש רגיל במעבדות שלנו. מבחני הנוכחי שמשו לחקור את ההשלכות על הומאוסטזיס DA של שינוי על C-הטרמינל DAT14 ולהבעת Cre recombinase תחת טירוזין hydroxylase (ה) יזם 5.

Protocol

הקווים המנחים של Inspectorate ניסויים הדנית החיה (מספר הרשאה: 2017-15-0201-01160) עקבו וביצע ניסויים במתקן באופן מלא AAALAC מוכר בפיקוחו של רווחת בעלי חיים המקומי ועדת.

1. דופמין synaptosomal ספיגת (שיטה 1)

הערה: פרוטוקול זה עבור הערכה מקבילים של מוחות, אך ניתן להשתמש בהצלחה ביצוע ניסויים ספיגת DA synaptosomal עם ארבע המוח במקביל.

  1. ההכנות
    1. תווית 48 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות לכל טבלה 1 (24 עבור כל המוח). השתמש בצבעים שונים על הצינורות השייכים כל המוח כדי למנוע בלבול בין דוגמאות
    2. 51 תווית נצנוץ צינורות #1-51.
    3. המקום פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) על קרח. זה ישמש כדי לשמור על המוח מקורר.
    4. להפעיל לצנטריפוגה כדי לאפשר להתקרר מראש ל- 4 מעלות צלזיוס
    5. מראש לשקול שני צינורות מיקרו-צנטריפוגה כדי לקבל את המשקל המדויק רקמות במהלך הכנת synaptosomal (סעיף 2.6).
      6. מאגר
    6. המגון להכין על ידי ערבוב 4 מ מ HEPES ו- 0.32 M סוכרוז. להתאים את ה-pH ל 7.4 ולשמור על קרח
      הערה: מאגר המגון ניתן המשיך ב- aliquots ב-20 ° C, הקרת היום של הניסוי-
      7. מאגר ספיגת
    7. הכן על-ידי שילוב הבאות: 25 מ מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.2 מ מ CaCl 2, 1.2 מ מ MgSO 4, חומצה אסקורבית 1 מ מ (0.194 g/L), 5 מ מ D-גלוקוז (0.991 g/L). להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH (מוביל ריכוז נתרן של-130 מ מ) ולשמור על קרח
      הערה: עבור 2 מוחות, להכין מאגר ספיגת 1500 מ. הכנת מאגר ספיגת כמו 10 x פתרון מניות ללא חומצה אסקורבית, גלוקוז שמרו ב-4 ° C. להפוך 1 x הפתרון עובד טרי ביום, שכשהם עם חומצה אסקורבית, גלוקוז. להתאים את ה-pH עם NaOH עד 7.4.
    8. הכן ספיגת מאגר + ליגנד על-ידי שילוב הבאות: 25 מ מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ. אשלגן כלורי, 1.2 מ מ זיכרון מטמון l2 בנפח 1.2 מ מ MgSO 4, חומצה אסקורבית 1 מ מ (0.194 g/L), 5 מ מ D-גלוקוז (0.991 g/L), 1 μM pargyline, desipramine 100 ננומטר, 10 ננומטר Catechol-O-מתיל-טרנספראז (COMT) מעכב. להתאים את ה-pH 7.4 עם NaOH ולשמור על קרח
      הערה: השתמש 50 מ ל ספיגת מאגר ולהוסיף ליגנד. Pargyline נוסף כדי לסייע במניעת השפלה של DA על ידי חמצון באמצעות מונואמין אוקסידאז (מאו). מעכב COMT (RO-41-0960) נוסף כדי למנוע השפלה של DA (catecholamines באופן כללי) דרך COMT. Desipramine מתווסף לעכב ספיגת דרך למעליות סרוטונין ונוראדרנלין, ובכך להפוך את התוצאות ספיגת ספציפי עבור במבטאו
    9. הכן ספיגת מאגר + ליגנד קוקאין על-ידי שילוב הבאות: 25 מ מ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.2 מ מ CaCl 2, 1.2 מ מ MgSO 4, חומצה אסקורבית 1 מ מ (0.194 g/L), 5 מ מ D-גלוקוז (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 ננומטר desipramine , מעכב COMT nM 10, קוקאין 500 μM. להתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH ולשמור על קרח
      הערה: השתמש מאגר ספיגת 7 mL + ליגנד ולהוסיף קוקאין. קוקאין נוסף כדי לקבל רקע מידת ספיגת DA שאינם ספציפיים כדי להפחית מן הנתונים, משאיר רק את ספיגת DAT ספציפיים (שכן SERT ובד מעוכבים בידי desipramine כמתואר לעיל). לחלופין, חזק מאוד, מדויקת DAT מעכב GBR-12935, ניתן להשתמש במקום זאת.
      חשוב: לשמור את הכל על קרח מכאן ואילך .
  2. Synaptosomal הכנת
    1. להקריב עכבר אחד בכל פעם על-ידי נקע צוואר, עריפת ראש.
    2. לחתוך את העור באמצעות מספריים כדי לחשוף את הגולגולת ולנתק את כל עודפי רקמת האחורי של הגולגולת משמאל של עריפת ראש. לחתוך את הגולגולת עם מספריים קטנות ישר לאורך sutura sagittalis סיום anteriorly ככל האפשר.
    3. למקם את הטיפים מספריים שני בכל עין של העכבר, לחתוך דרך הגולגולת כדי להסיר את שארית הגולגולת והמוח ללא פגע. במהירות מסירים את המוח ולמקם אותו ב- PBS קר כקרח. זה ישאיר אותו קר, ואילו השני הוא גזור המוח.
    4. שימוש במטריצה המוח, לנתח חתיכה הילתית 3 מ מ סטריאטום (קדמי-אחוריים: +1.5 מ"מ עד מ"מ-1.5) ואחריו דיסקציה עדינה יותר עם כבטלן. ראה איור 1 עבור אזור ניקוב.
    5. לשמור את הרקמה על קרח כל הזמן להתקדם.
    6. להעביר את רקמת צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL למערכת השקילה.
      הערה: המשקל הזה ישמש בשלב 1.2.14.
    7. 1.2.1-1.2.6 צעד חזור על המוח השני.
    8. ברגע משקל התקבל שכל שני, להעביר את הרקמה כוס המגון המכיל 1 מ"ל של מאגר המגון קר כקרח.
    9. Homogenize הרקמה באמצעות כבעלי מונע המנוע ב 800 סל ד, משיחות אפילו 10-
      הערה: קו אחד שווה אחד למעלה ולמטה פעולה, הקו הראשון צריך להיות בערך 5 s, הבאות המגון ס' 3-4 מול אמצעי חשוב למנוע התפוצצותה של synaptosomes 6. שימוש מתאים והמדיום מול יאפשר המסופים presynaptic הציטופלסמה תוחם reseal, הסינפטיות, המיטוכונדריה, שלד התא 15.
    10. להעביר homogenate את שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 1.5 mL ולאסוף את homogenate הנותרים מהזכוכית המגון על ידי שטיפה בעזרת מאגר המגון נוספים 0.5 mL-
    11. לשמור את הדגימה על קרח בזמן רקמת המוח השני הוא הומוגני. להפעיל את השכל שני במקביל צעדים 1.2.12-1.2.13.
    12. גלולה הגרעינים וסלולרי פסולת על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם, 10 דקות, 4° C).
    13. להעביר את תגובת שיקוע (S1) (המכילה קרום התא, הציטופלסמה) צינורות microcentrifuge 1.5 mL החדש, צנטריפוגה-16,000 x g עבור 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס
    14. למחוק את תגובת שיקוע (המכיל את הציטופלסמה) ו resuspend בגדר (P2) (מכיל synaptosomes גולמי) במאגר המגון μL 40 / רקמות mg (מבוסס על המשקל שהושג בשלב 1.2.6). בעדינות resuspend השבר synaptosomal גולמי עם פיפטה p1000 כפי כוח רב מדי ישבור את synaptosomes.
      הערה: חשוב לסיים עם μL 280 לפחות. אם לא, דילול עם μL יותר מ-40 מ"ג לכל צורך. צעדים 1.2.1-1.2.13 חייב להתבצע מהר ככל האפשר, הכל חייב להיות כל הזמן על קרח. ברגע שיש כבר resuspended את synaptosomes גולמי במאגר המגון הם יציבים למדי כל עוד הם שמרו על הקרח 6 , 15 , 16.

2. ניסוי ספיגת

  1. μL 440 להוסיף ספיגת מאגר + ליגנד + קוקאין הצינורות המיועדים 1.5 מ ל 12 microcentrifuge, 440 מאגר ספיגת μL + ליגנד 36 שנותרו 1.5 mL microcentrifuge צינורות (ראה טבלה 1 עבור הפריסה).
    הערה: להסיר אותם מן הקרח 15 דקות לפני תחילת הניסוי כדי מביאים לטמפרטורת החדר, אבל לשמור על הקרח עד אז כדי לשמר את מעכבי.
  2. הכן הרוויה העקומה (דופמין (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H דופמין) (91.1 Ci mmol) בריכוזים הסופי שונים (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 ו- 1.0 μM)).
    1. תווית ששה צינורות microcentrifuge 2 מ ל 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 ו 0.31.
    2. 750 להוסיף μL ספיגת מאגר + ליגנד כדי הצינורות microcentrifuge 5 עם המספר הנמוך ביותר.
    3. 1,455.4 להוסיף μL ספיגת מאגר + ליגנד, 14.6 μL דופמין (1 מ מ), 30 דופמין 3-H μl (11 μM) אל הצינור מתויג 10.
      4. ΜL
    4. 750 להעביר מהצינור מתויג 10 הצינור מתויג 5. מערבבים היטב ולהעביר 750 μL מהצינור הזה ל הצינור 2.5. חזור על זה דילול עם הצינורות הנותרים.
  3. מראש לשטוף את המסננים מיקרופייבר זכוכית עם 4 מ"ל ספיגת מאגר לאחר שהונחו על דלי מסנן טוב 12.
  4. להוסיף 10 μL של ההשעיה ממברנה synaptosomal ל- 24 שעות הראשונות 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות (ראה טבלה 1 עבור הפריסה) מאגר המכיל μL 440. מערבולת בקפידה ספין למטה זמן קצר כדי להבטיח כי synaptosomes טובע במאגר. נשאיר את 37 o C עבור 10 דקות
    הערה: חשוב למען הדיוק טיימס במהלך הניסוי ספיגת לשם השוואה הוגנת בין המוח. החישוב שלי עבור דיוק.
    5. דופמין
  5. להוסיף 50 μL של μM ריכוז 10 ו- 5 (סעיף 2.2) שתי העמודות ולהשאיר הראשון ב 37 o C עבור 5 דקות ברעידות. לאחר 5 דקות בדיוק, לעצור את התגובה על-ידי הוספת 1 מ"ל ספיגת כקרח מאגר. לעשות את אותו הדבר עם ריכוז 2.5 ו- 1.25 μM (סעיף 2.2) ולאחר מכן עם ריכוז 0.62 ו- 0.31 μM.
  6. להוסיף את הדגימות המסננים מיקרופייבר מראש שטופים, לשטוף עם מאגר ספיגת קרח 5 x 4 מ. כאשר נוספו הדגימות קודם 12 המסננים, לעבור את מסנני נצנוץ צינורות. חזור על פעולה זו עם הדגימות הבא 12.
  7. חזור על צעד 2.4-2.6 למוח הבאה.
  8. להכין 3 מקס-סופר צינורות על-ידי הצבת מסנן מיקרופייבר בתחתית של נצנוץ צינורות 49-51 והוספת µL 25 הריכוז המרבי דופמין על העליונה (10 μM).
  9. להשאיר את כל צינורות נצנוץ 51 בשכונה fume עבור ה 1
  10. להוסיף 3 מ ל נוזל נצנוץ כל נצנוץ צינור ו- shake נמרצת על מטרף עבור ה 1
  11. רוזן [3 H]-DA בבטא-מונה עבור מינימלית 1
    1. פתח את התוכנית ובחרו: תווית: H-3, צלחת/סינון: 4 מ"ל בקבוקון, 4 על ידי 6, וזמינותו סוג: נורמלי וספירת זמן: דק 1
      הערה: שלב זה יכול להתבצע למחרת אם נוח יותר. להשאיר דוגמאות מכוסה בנייר כסף במשך הלילה.
  12. קביעת חלבון
    1. להשתמש ערכת BCA חלבון Assay סטנדרטי כדי לקבוע ריכוז חלבון של synaptosomes על התאמות של ספירות לכל מין (cpm) fmol/min/μg ועל השוואה נאותה של ספיגת בין דגימות.

3. ניתוח נתונים

  1. שימוש הנתונים מכל תפיסה ניסוי כדי להפוך רוויה עקומת עבור כל קבוצה ולחשב את הקצב של התגובה (V מקס), קבוע מיכאליס מנטן (K M).
    הערה: ערך K M משקף את ריכוז המצע נדרש להגיע חצי V max. בהתאם לכך, V max ישירות משקף את הפונקציה של DAT (קיבולת ספיגת המרבי), אשר תלויה במספר של DAT על פני השטח ועל איך ייתכן מאופנן פעילותה posttranslational שינויים ו/או אינטראקציה חלבונים, כמו גם על שינויים הדרגתיים יון. ערך K M הוא מדד עקיף של המצע אהדה המשגר זה, חשוב גם יכול להיות מווסת על ידי שינויים posttranslational ו/או חלבונים אינטראקציה. כדי להעריך באופן מלא שינויים פונקציונליים לכן חשוב לקביעת רמות הביטוי משטח ישירות על ידי למשל וזמינותו biotinylation פני השטח. תיאור של דופמין ספיגה חוזרת של לפתח על המשמעות של ערכי מקסימום K M ו- V נבדקו בידי שמיץ ואח 17.

4. ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (שיטה 2)

  1. ניתוח מוחי
    1. צינורות microcentrifuge התווית ואת שוקלים; אחד לכל אזור לכל העכבר.
    2. להקריב עכבר אחד בכל פעם על-ידי נקע צוואר, עריפת ראש. מסירים את המוח במהירות כמתואר בסעיף 1.2. לבצע עוד ניתוח מיד.
    3. שימוש במטריצה המוח, לנתח חתיכה הילתית 3 מ מ סטריאטום ואחריו עדין הדו-צדדיים דיסקציה של NAc, dStr עם כבטלן. ראו איור 3 לאזור אגרוף.
    4. להעביר את הרקמה 1.5 mL microcentrifuge צינורות ומניחים במהירות על קרח יבש. שוקל את הרקמה ולמקם אותו בחזרה על הקרח היבש מיד.
      הערה: משקל הרקמה חשוב לחישוב ריכוז בהמשך.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. חזור על צעדים עם העכבר הבאה.
      הערה: במקום הרקמה בגיל 80 o C עד עיבוד נוסף או להמשיך מיד ברקמה.

5. הכנת הרקמה

  1. הפעל צנטריפוגה כדי לאפשר לה להתקרר מראש עד 4 ° C
  2. להכין את הפתרון המגון (0.1 N חומצה על-כלורית (HClO 4)) ולשמור על קרח
  3. שימוש המגון פתרון, להכין טרי 0.1 pmol/μL דופמין תקן פתרון מניות 1 מ מ (לדילול 10,000 x).
    הערה: הפתרון מניות מוכן על ידי המסת דופמין במאגר המגון כדי ריכוז מניות של 1 מ מ, אשר ניתן לשמור ב 20 מעלות צלזיוס במשך כחודש. אם אזורים אחרים של המוח של עניין, ריכוז של התקן יהיה חייב להיות שונה, מאז באזורים אחרים במוח כולל קליפת prefrontral, ההיפוקמפוס, הסובסטנציה ניגרה ואזור הטגמנטום הגחוני בעלי DA עד 100 פעמים פחות בהשוואה סטריאטום.
  4. להוסיף 500 μL המגון פתרון כל דגימה (קרי רקמות NAc, dStr; סעיף 4.1), homogenize את דגימות באמצעות אולטרה-מהמגן על מהירות מלאה עבור שמור ס' כ-30 המדגם במים קר במהלך המגון. בין כל דגימה, לנקות את מהמגן אולטרה עם מים (בכל המהירות ל 30 s)-
  5. Centrifuge את הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C, g x 14,000...
  6. העברת כ 200 הדגימה μL כדי מסנן μm זכוכית 0.22 (1 ס מ קוטר) בעזרת מזרק פלסטיק 1 מ"ל.
    הערה: השימוש של זכוכית מסננים אינה החשובים, כל עוד המסננים שנבחרו הם μm 0.22 להסיר את החומרים משקל מולקולרי גבוה.
  7. לנתח דגימות ידי זיהוי אלקטרו-כימיים (EC)-HPLC מתודולוגיה 18 כמתואר בסעיף 6-

6. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

  1. להכין הפעולות הבאות לפתרון שלב ניידים: סודיום אצטט 55 מ מ, חומצה octanesulfonic 1 מ מ, נה 2 EDTA 0.1 מ מ, acetonitrile 8%, חומצה אצטית 0.1 M, pH = 3.2.
    הערה: להתאים את ה-pH עם חומצה אצטית 0.1 M. חשוב לדייק עם ה-pH. הפתרון צריך להיות degassed על ידי degasser ופשוט (חלק משולב של מערכת HPLC). להכין 2 ל' של שלב ניידים ולשנות אותו פעם בחודש (לשנות אותו כאשר הרעש מורגש). בשל תנודות זה לוקח בערך 24 שעות כדי להתאים לאחר שינוי השלב נייד-
  2. הסידור של גלאי:
    1. סט וולט פלט 700 mV, בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס על התנור גלאי; זה מאוד חשוב. להכין תוכנית טווח באמצעות המדריך המקוון. עיין במדריך לפרטים נוספים). להוסיף את התוכנית זמן לפי טבלה 2-
      הערה: במחקר זה, התוכנית מוגדר לשנות באופן אוטומטי את הזרם בזמנים שמירה קבע, כדי לשמור על HPLC של האופטימלית הנוכחית וכדי לשמור את הפסגות של chromatogram כפי להגדיל ככל האפשר, אך עדיין בתוך נוף. זה כבר מותאם ל- striatal lysates המוח של עכברים.
  3. כאשר התוכנית נוספה הגלאי, תעשה סיבוב 3 נקודת הכיול, באמצעות הזרקת התקן שלוש פעמים (5, 10 ו-15 μL).
    הערה: תקן (10 μL (μL 10 x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) צריך להיות מוזרק כל עשירי מדגם ודוגמאות מכויל ברמה הקרובה ביותר. הקנס מנגינה מערכת ראש המנזר היום על-ידי התאמת בתקן 3 נקודות, ובדיקת אם chromatogram יוצא בתוך הטווח הצפוי. אם רעש ניכר נצפית, לשנות את שלב ניידים. אם לשיא גבוה יותר 990 mV ואז מחדש להזריק הדגימה באמצעי אחסון נמוך, או להפוך את תוכנית חדשה טווח עיקול סטנדרט חדש. המגבלה זיהוי נמדד כ 3 פעמים את הערך רעש ב- mV לערך שיא הנמוך ביותר מזריקים במשך כל תקן (NA DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT ו- 5-HT).
    1. הגדרת המערכת על-ידי פתיחת הפתרון LC והפעלת ניתוח 1; הזה מתחיל במצב מקוון. הקלד מזהה משתמש וסיסמה ולחץ על אישור. המתן פתרון LC להתחבר עם כלי נגינה. לשולחן אצווה ומלא מידע נתונים (למשל, סוג הדגימה: ידועה ל- std ודוגמאות עבור סוג ניתוח סטנדרטי: זה QT, נפח הפצוע למרכז הר: amt ISTD 10,: קון רמה 1). שמור קובץ (ללכת קובץ - > שמור קובץ אצווה כמו - > שמור).
    2. להפוך את המערכת להזריק המדגם הראשון על ידי לחיצה על ' התחל אצווה '. זה יגרום ההזרקה של מדגם μL 10 מאת תעשיה עם מודול משלוח החומר הממיס.
      הערה: השתמש קצב זרימה משאבה של 0.15 mL/min ועמודה סי18 עם היפוך פאזה. כאן נעשה שימוש של גלאי amperometric לגילוי אלקטרוכימי. האלקטרודה פחמן מזוגגות להגדיר ל- 0.8 V עם אלקטרודה הפניה Ag/AgCl. על מנת assay דופמין, השתמש כרומטוגרפיה 3 ממוצע הלחמה סי18 (3) (DA 2 מ"מ x 100 מ"מ, חלקיקים בגודל 3 מיקרומטר) כדי להשיג את ההפרדה כרומטוגרפי.
    3. חלץ האזורים שיא מוקלטות ומחושב.
      1. ללכת קירור והקפאה לעקוב אחרי chromatogram את הדגימות סיימו. ללכת Lc פוסט להפעיל ניתוח - > בחר את שם הקובץ (chromatogram ייפתח) - > לחץ על תצוגה. על הבר שילוב ידני, להוסיף את כל הפסגות כדי להיות משולב - > ללכת נתוני הדוח ולהדפיס קרא.
        הערה: כאן LC פתרון התוכנה שימשה עבור ניתוח נתונים ובקרת המערכת.
  4. מהאזורים שיא, לחשב את ריכוז הדופאמין במדגם, כמפורט להלן באמצעות הריכוז הידוע של התקן:
    1. להשתמש באזור השיא של התקן (שווה ל- 1 pmol) לרכוש פקטור א
      figure-protocol-14620
    2. להשתמש גורם כדי לקבל את הריכוז של הדגימות.
      ריכוז של המדגם (ב pmol לכל 10 μL) = גורם A × שיא אזור הדגימה
    3. להשתמש בנוסחה זו כדי לקבל את הריכוז לדוגמה ב- ng.
      דוגמת ריכוז pmol / 10 µL x 500 µL x MW של דופמין = ריכוז לדוגמה ב- ng
      לטעום ריכוז (ב ng) = ריכוז לדוגמה (ב pmol לכל 10 μL) x 500 μL x MW של דופמין
    4. להשתמש הריכוז לדוגמה ב- ng כדי לקבל את הציון הוא לטעום ריכוז ברקמת pg/g (לטעום ריכוז pg / רקמות g = pg/g רקמות).

תוצאות

הפרוטוקול ספיגת DA הנוכחי (איור 1) כולל את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את הפונקציונליות של DAT ב synaptosomes של עכברים. הנתונים שלנו נציג של השיטה ספיגת DA (איור 2) מתארת עקומה רוויה עם נתונים מקוריים (איור 2B) וסידר נתונים (

Discussion

כתב יד זה מתאר שימושי פרוטוקולים ניסיוני ניסחו DA הומאוסטזיס כל דגם העכבר של בחירה. אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור מדידת רמות של DA ברקמת המוח של עכברים באמצעות HPLC ספיגת DA synaptosomal כדי להעריך פונקציונלי DA התחבורה באמצעות ידיים למעלה הנהלים, הפרוטוקולים ואת מגבלות עבור ניסוי HPLC ו synaptosomal assay ס...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המצוינות של התוכנית 2016 (U.G., ע. ר, K.J.) UCPH, קרן לונדבק (M.R.) קרן לונדבק המרכז Biomembranes של ננו-רפואה (U.G.), לאומי המכון של בריאות מענקים P01 התובע 12408 (U.G.), הדנית המועצה מחקר עצמאי - מדעי הרפואה (U.G.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
COMT inhibitorSigma Aldrich, GermanyRO-41-0960For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCFor synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluidPerkin Elmer1200-437For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2Perkin ElmerFor synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225For synaptosomal DA uptake protocol
HEPESSigma Life ScienceH3375For synaptosomal DA uptake protocol
SucroseSigma Life ScienceS7903For synaptosomal DA uptake protocol
NaClSigma Life ScienceS3014For synaptosomal DA uptake protocol
KClSigma Life ScienceP9541For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4Sigma Life Science63065For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278For synaptosomal DA uptake protocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021For synaptosomal DA uptake protocol
PargylineSigma AldrichP-8013For synaptosomal DA uptake protocol
DesipramineSigma AldrichD3900For synaptosomal DA uptake protocol
DopamineSigma Life ScienceH8502For synaptosomal DA uptake protocol
CocaineSigma Life ScienceC5776For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CFor synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupterBuch & HolmDiscontinuedFor synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)Antec, Leiden, The NetherlandsDiscontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filterFrisenette ApS, Denmark13CP020ASFor HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, GermanyPart Number:00A-3300-E0For HPLC protocol
LC solution softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationFor HPLC protocol
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlFor HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTASigmaE5134-50gFor HPLC protocol
NatriumdihydrogenphospharBie&Berntsen1.06346 1000gFor HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrateAldrich74885 -10gFor HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC gradeScharlauAC03402500For HPLC protocol
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DenmarkAvantec 13CP020ASFor HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%Merck1.00563. 1000mlFor HPLC protocol
ElectrodeAntec, Leiden, The NetherlandsAN1161300For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detectorAntec, Leiden, The NetherlandsLite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol

References

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127HPLCsynaptosomalsynaptosomes

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved