Avaliação da homeostase Dopaminergic em camundongos pelo uso de análise de cromatografia líquida de alta performance e captação da dopamina Synaptosomal

Resumo

Absorção de dopamina synaptosomal e ferramentas experimentais de cromatografia líquida de alto desempenho análise representam para investigar a homeostase de dopamina em camundongos avaliando-se a função do transportador de dopamina e níveis de dopamina no tecido striatal, respectivamente. Aqui nós apresentamos protocolos para medir o teor de tecido de dopamina e avaliar a funcionalidade do transportador de dopamina.

Resumo

Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora, controlando a atividade motora, processos de recompensa e função cognitiva. Comprometimento da neurotransmissão dopaminérgico (DAergic) é fortemente associado com várias doenças associadas a sistema nervoso central, tais como a doença de Parkinson, transtorno déficit-hiperatividade e dependência de drogas^{1,2 ,3,4}. Delinear os mecanismos de doença que envolvem o desequilíbrio DA é criticamente dependente de modelos animais para imitar os aspectos das doenças, e assim protocolos que avaliam a partes específicas do DA homeostase são importantes para fornecer novos insights e possível terapêutico alvos para estas doenças.

Aqui, apresentamos dois protocolos experimentais úteis que quando combinados fornecem uma leitura funcional do sistema de DAergic em camundongos. Parâmetros bioquímicos e funcionais na homeostase DA são obtidos através da avaliação dos níveis DA e de funcionalidade de transporte (DAT) dopamina⁵. Ao investigar o sistema DA, a capacidade de medir confiantemente níveis endógenos do cérebro de um adulto é essencial. Portanto, apresentamos como realizar a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) no tecido cerebral de ratos para determinar os níveis de DA. Podemos realizar o experimento no tecido do striatum dorsal (dStr) e núcleo accumbens (NAc), mas o método também é apropriado para outras áreas do cérebro DA-inervada.

DAT é essencial para a recaptação para o terminal pré-sináptica, assim, controlar a atividade temporal e espacial de DA. lançado Saber os níveis e a funcionalidade do DAT no striatum é de grande importância na avaliação DA homeostase. Aqui, nós fornecemos um protocolo que permite deduzir simultaneamente informações sobre níveis de superfície e função usando um ensaio de absorção de synaptosomal⁶ DA.

Atuais métodos combinados com protocolos padrão immunoblotting fornecem o pesquisador com ferramentas relevantes para caracterizar o sistema de DAergic.

Introdução

Dopamina (DA) é um neurotransmissor moduladora essencial para comportamento motor, recompensa e função cognitiva^1,7,8,9. Desequilíbrios na homeostase DA estão implicados nas várias doenças neuropsiquiátricas como transtorno de déficit de atenção e hiperatividade, vício em drogas, depressão e doença de Parkinson¹. DA é liberada a partir o neurônio pré-sináptica para a fenda sináptica, onde liga a e ativa receptores na membrana pré e pós-sináptica, transmitindo, assim, mais o sinal. O nível na sinapse após lançamento é espacial e temporalmente controlado por DAT^3,10. O transportador sequestra do espaço extracelular e, portanto, sustenta fisiológica DA níveis^3,11. Remoção de genética de DAT em camundongos faz com que um fenótipo hiperdopaminérgicas caracterizado por níveis elevados DA sinápticos, depleção de intracelular DA piscinas e mudanças profundas na pós-sináptica DAergic^10,12de sinalização.

Aqui, apresentam-se dois protocolos separados, um método de medida DA tecido conteúdo e outro para avaliar a funcionalidade do DAT. combinado com o ensaio de superfície biotinylation descrito por Gabriel et al¹³ esses dois métodos fornecem informações sobre DA conteúdo e funcionais níveis de DAT para uma avaliação completa DA homeostase. Com estes métodos DA homeostase de vários ratos transgénicos ou modelos de doença pode ser caracterizado e descrito. Estas ferramentas foram implementadas e optimizadas e são de uso padrão em nossos laboratórios. Ensaios atuais têm servido para investigar as consequências sobre a homeostase de alterar o C-terminal da DAT¹⁴ ou expressam a recombinase Cre sob a Tirosina Hidroxilase (TH) promotor ⁵.

Protocolo

as orientações da Inspetoria dinamarquês de Experimentação Animal (número de permissão: 2017-15-0201-01160) foi seguido e experiências realizadas em uma instalação totalmente AAALAC credenciado sob a supervisão de um local ao bem-estar dos animal Comitê.

1. synaptosomal absorção de dopamina (método 1)

Nota: Este protocolo é para avaliação paralela de dois cérebros, mas pode ser utilizado com sucesso para realizar experiências de captação DA synaptosomal com quatro cérebros em paralelo.

1. Preparações
   1. microcentrífuga de 1,5 mL de rótulo 48 tubos por tabela 1 (24 em cada cérebro). Use cores diferentes para os tubos pertencentes a cada cérebro para evitar a confusão entre amostras
   2. rótulo 51 cintilação tubos #1-51.
   Fosfato de
   3. lugar tampão salino (PBS) no gelo. Isso será usado para manter o cérebro refrigerado.
   4. Ativar o centrifugador para deixar arrefecer pre-4 ° C.
   5. Pre-pesar dois tubos de centrífuga de micro para obter o peso exato do tecido durante a preparação de synaptosomal (seção 2.6).
   Buffer de
   6. preparar homogeneização pela mistura de 4 mM HEPES e 0,32 M de sacarose. Ajustar o pH para 7,4 e manter no gelo
      Nota: Tampão de homogeneização pode ser mantido em alíquotas a-20 ° C e descongelado no dia do experimento.
   Buffer de absorção
   7. preparar combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl ₂, 1,2 mM de MgSO ₄, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L). Ajustar o pH para 7,4 com NaOH (leva a uma concentração de sódio de cerca de 130 mM) e manter no gelo
      Nota: Para 2 cérebros, prepare-se 1500 mL de tampão de captação. Preparar o buffer de captação como um 10 x solução sem ácido ascórbico e glicose mantido a 4 ° C. Make 1 x solução de trabalho recentemente no dia, completando com ácido ascórbico e glicose. Ajustar o pH com NaOH para 7.4.
   Buffer de captação de preparar
   8. + ligante combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC _l2, 1,2 mM de MgSO ₄, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM, 10 nM Inibidor da Catecol-O-metil-transferase (COMT). Ajustar o pH 7,4 com NaOH e manter no gelo
      Nota: Usar 50 mL de tampão de captação e adicionar ligante. Pargyline é adicionado para ajudar a prevenir a degradação pela oxidação através da monoamina oxidase (MAO). Inibidor da COMT (RO-41-0960) é adicionada para prevenir a degradação DA (catecolaminas em geral) pela COMT. Desipramina é adicionada ao inibir a absorção através dos transportadores de noradrenalina e serotonina e assim, tornar os resultados de absorção específica para DAT.
   Buffer de captação de preparar
   9. + ligante + cocaína combinando-se o seguinte: 25mm HEPES, 120 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl ₂, 1,2 mM de MgSO ₄, 1mm o ácido ascórbico (0,194 g/L), 5 mM D-glicose (0,991 g/L), 1 pargyline μM, 100 desipramina nM , 10 nM COMT inibidor, cocaína de 500 μM. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH e manter no gelo
      Nota: Use 7 mL de tampão de captação + ligante e adicionar a cocaína. Cocaína é adicionada para obter uma medição de fundo de captação DA não-específica para subtrair os dados, deixando apenas a absorção de DAT específicos (desde que SERT e NET são inibidas por desipramina conforme descrito acima). Alternativamente, um altamente potente e específico inibidor da DAT GBR-12935, pode ser usado em vez disso.
      Importante: Manter tudo em gelo com .
2. Synaptosomal preparação
   1. sacrificar um rato de cada vez por deslocamento cervical e decapitação.
   2. Cortar a pele com uma tesoura para revelar o crânio e corte qualquer excesso de tecido posterior do crânio esquerda de decapitação. Cortar o crânio com uma pequena tesoura reta ao longo da microporagem sagittalis terminando como anteriormente possível.
   3. Coloque as pontas da duas tesoura em cada olho do rato e corte no crânio para remover o restante do crânio e do cérebro intacto. Rapidamente Retire o cérebro e colocá-lo em PBS gelado. Isto irá mantê-lo frio, enquanto o segundo cérebro é dissecado.
   4. Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum (ântero-posterior: +1,5 mm mm-1,50) seguida por uma dissecção mais fina com um perfurador. Veja a Figura 1 para área de soco.
   5. Manter o tecido no gelo em todos os momentos a avançar.
   6. Transferir o tecido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para a pesagem.
      Nota: Este peso será usado na etapa 1.2.14.
   7. Repeat passo 1.2.1-1.2.6 para o segundo cérebro.
   8. Uma vez que o peso foi obtido para os cérebros, transferir o tecido para um vidro de homogeneização contendo 1 mL de tampão de homogeneização gelada.
   9. Homogeneizar o tecido usando um pilão motor conduzido a 800 rpm, 10 traços mesmo.
      Nota: Um curso é igual a um acima e para baixo a ação, o primeiro traço deve ser cerca de 5 s, o seguinte 3-4 s. homogeneização em meio isotônico é importante para evitar o estouro do sinaptossomas ⁶. Usando a força apropriada e meio isotônico permitirá que os terminais pré-sináptica reseal delimitador citoplasma, vesículas sinápticas, mitocôndrias e citoesqueleto ¹⁵.
   10. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e coletar o restante homogenate de vidro a homogeneização enxaguando com 0,5 mL de tampão de homogeneização adicionais.
   11. Manter a amostra em gelo, enquanto o tecido do outro cérebro é homogeneizado. Executar os dois cérebros em paralelo em etapas 1.2.12-1.2.13.
   12. Núcleos de pelotas e detritos de células por centrifugação (1.000 x g, 10 min, 4° C).
   13. Transferir o sobrenadante (S1) (contendo as membranas celulares e citoplasma) para novos tubos de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar a 16.000 x g por 20 min a 4 ° C.
   14. Desprezar o sobrenadante (que contém o citoplasma) e ressuspender o precipitado (P2) (contendo sinaptossomas brutas) em tampão de homogeneização 40 μL / tecido mg (baseado no peso obtido na etapa 1.2.6). Resuspenda suavemente a fração synaptosomal bruta, com uma pipeta p1000 como muita força vai quebrar as sinaptossomas.
       Nota: É importante acabar pelo menos 280 μL. Se não, será necessário diluir com mais de 40 μL por mg. 1.2.1-1.2.13 etapas devem ser executadas mais rápido possível, e tudo tem de ser mantido no gelo. Tão logo as sinaptossomas brutas tem sido resuspended no buffer de homogeneização são relativamente estáveis, enquanto são mantidos em gelo ^{6 , 15 , 16}.

2. Experiência de absorção

1. Adicionar 440 μL tampão de captação + ligante + cocaína para os designado 12 tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e 440 buffer de captação μL + ligante para os 36 restantes tubos de microcentrifuga de 1,5 mL (ver tabela 1 para o layout).
   Nota: Remova-os do gelo 15 min antes do início do experimento para trazê-los à temperatura ambiente, mas manter-se no gelo até então conservar inibidores.
2. Curva de saturação de preparar (dopamina (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamina) (91,1 Ci/mmol) em diferentes concentrações finais (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 e 1,0 μM)).
   1. Rotular seis tubos de 2ml microcentrifuga como 10, 5, 2,5, 1,25, 0.62 e 0,31.
   2. Buffer de captação μL adicionar 750 + ligante para os 5 tubos microcentrifuga com número mais baixo.
   3. Buffer de absorção 1,455.4 Adicionar μL + ligante, 14,6 dopamina μL (1 mM), 30 μl dopamina 3-H (11 μM) ao tubo rotulado 10.
   4. Transferência 750 μL do tubo rotulado 10 para o tubo de 5. Misture bem e transferir 750 μL deste tubo ao tubo de 2,5. Repita esta diluição com os restantes tubos.
3. Pré-enxágue os filtros de microfibra de vidro com 4 mL de tampão de captação depois colocando-os em um balde de filtro bem 12.
Microcentrífuga de 1,5 mL de
4. Adicionar 10 μL de suspensão de membrana synaptosomal para as primeiras 24 tubos (ver tabela 1 para o layout) com tampão μL 440. Vórtice cuidadosamente e spin para baixo em breve para garantir que a sinaptossomas estão submersos no buffer. Deixar em 37 ^o C por 10 min.
   Nota: É importante ser mais exato no times durante o experimento de absorção para uma comparação justa entre cérebros. Use um cronômetro para precisão.
5. Adicionar 50 μL de dopamina concentração 10 e 5 μm (seção 2.2) para o primeiro duas colunas e deixar em 37 ^o C por 5 min com agitação. Depois de exatamente 5 min, pare a reação adicionando 1 mL de tampão de captação gelada. Faça o mesmo com concentração 2,5 e 1,25 μM (seção 2.2) e, em seguida, com concentração 0.62 e 0,31 μM.
6. Adicionar as amostras para os filtros de microfibra previamente enxaguado e lave com 4 x 5 mL de tampão de captação gelada. Quando as primeiras 12 amostras foram adicionadas aos filtros, mudar os filtros para tubos de cintilação. Repita isto com as próximo 12 amostras.
7. Repeat passo 2.4-2.6 para o cérebro próximo.
8. Contagem max 3 preparar tubos colocando um filtro de microfibra na parte inferior dos tubos de cintilação 49-51 e adicionando 25 µ l da concentração de dopamina máxima no topo (10 μM).
9. Deixar todos os 51 tubos de cintilação em uma coifa de 1 h.
10. Líquido de cintilação adicionar 3 mL de cada tubo de cintilação e agitação vigorosa num agitador por 1 h.
11. Contagem [³ H]-em um beta-contador de 1 min.
    1. Abrir o programa e escolha: Label: H-3, placa/filtro: frasco de 4 mL, 4 por 6, tipo de ensaio: Normal e contando o tempo: 1 min.
       Nota: Esta etapa pode ser realizada no dia seguinte se mais conveniente. Deixe amostras cobertas com papel alumínio durante a noite.
12. Determinação da proteína
    1. usar um kit de ensaio da proteína de BCA padrão para determinar as concentrações de proteína das sinaptossomas de ajustamentos de contagens por minuto (cpm) μg/fmol/min e para comparação adequada de absorção entre as amostras.

3. Análise de dados

1. usar os dados de captação experiência tornar-se uma saturação curva para cada grupo e calcular a taxa de reação (V _max) e a constante de Michaelis Menten (K _M).
   Nota: O valor de K _M reflete a concentração de substrato necessária para chegar a metade de V _máx. Nesse sentido, V _máx diretamente reflete a função do DAT (capacidade de absorção máxima), que depende do número de DAT na superfície e sobre como sua atividade pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas, bem como na alterações em gradientes de íons. O valor de K _M é uma medida indireta da afinidade de substrato para o transportador que, importante também pode ser modulada por modificações do posttranslational e/ou interação de proteínas. Para avaliar plenamente as alterações funcionais, portanto, é importante determinar diretamente os níveis de expressão de superfície por exemplo um ensaio de superfície biotinylation. Uma descrição da recaptação de dopamina e uma elaboração sobre o significado dos valores _máximo de K, _M e V foram revistas pelo Schmitz et al. ¹⁷.

4. Cromatografia líquida de alta eficiência (método 2)

1. dissecação cerebral
   1. rótulo e pesar tubos microcentrifuga; um por região por rato.
   2. Sacrificar um rato de cada vez por decapitação e desconjunção do colo do útero. Remova rapidamente o cérebro conforme descrito na seção 1.2. Executar outras dissecação imediatamente.
   3. Usando uma matriz de cérebro, dissecar uma fatia de 3 mm coronal do striatum seguido mais fino bilateral dissecação do NAc e dStr com um perfurador. Veja a Figura 3 para área de soco.
   4. Transferir o tecido para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e coloque rapidamente em gelo seco. Pesar o tecido e coloque-o no gelo seco imediatamente.
      Nota: O peso do tecido é importante para o cálculo da concentração mais tarde.
   Repita os passos de
   5. 4.1.1-4.1.4 com o mouse próximo.
      Nota: Coloque o tecido em 80 ^o C até posterior processamento ou imediatamente proceder ao processamento do tecido.

5. Preparação do tecido

1. centrífuga de deixe-a esfriar previamente a 4 ° C
2. preparar a solução de homogeneização (0.1 N perclórico ácido (HClO ₄)) e fique na Ice.
3. Usando solução de homogeneização, preparar um padrão de fresco 0.1 dopamina pmol/μL de uma solução stock de 1 mM (uma diluição 10.000 x).
   Nota: A solução é preparada dissolvendo dopamina no buffer de homogeneização para uma concentração das ações de 1 mM, que pode ser mantida a 20 ° C por cerca de um mês. Se outras áreas do cérebro são de interesse, concentração da norma terá que ser modificado, desde que outras áreas do cérebro, incluindo o córtex prefrontral, hipocampo, substância negra e área tegmental ventral possuem até 100 vezes menos DA comparado ao striatum.
4. Adicionar solução de homogeneização 500 μL de cada amostra (ou seja, tecido NAc e dStr; seção 4.1) e homogeneizar as amostras usando um ultra-homogenizador na velocidade máxima por cerca de 30 s. manter a amostra em água gelada durante a homogeneização. Entre cada amostra, limpar o Homogenizador ultra com água (toda a velocidade para 30 s).
5. Centrifugar as amostras por 30 min a 4 ° C, 14.000 g. x
Amostra de
6. de transferência de aproximadamente 200 μL para um vidro 0.22 μm filtro (1 cm de diâmetro), utilizando uma seringa de plástico de 1 mL.
   Nota: O uso de filtros de vidro não é importante, desde que os filtros escolhidos são 0,22 μm para remover as substâncias de alto peso molecular.
7. Analisar amostras por detecção eletroquímica (CE)-HPLC metodologia ¹⁸ conforme descrito na seção 6.

6. Análise de cromatografia líquida alta performance

1. Prepare a seguinte solução para a fase móvel: acetato de sódio 55 milímetros, octanesulfonic ácido 1 mM, Na ₂ EDTA 0,1 mM, acetonitrilo 8%, ácido acético 0,1 M, pH = 3.2.
   Nota: Ajuste o pH com o ácido acético 0,1 M. É importante ser mais preciso com o pH. A solução deve ser degassed pelo desgaseificador on-line (parte integrante do sistema de HPLC). Fazer 2 L da fase móvel e alterá-lo uma vez por mês (mudá-lo quando o ruído fica perceptível). Devido a flutuações leva cerca de 24 h para ajustar depois de mudar a fase móvel.
2. Instalação do detector:
   1. Set volts saída para 700 mV e temperatura para 32 ° C no forno detector; isto é muito importante. Fazer um programa de escala usando o manual on-line. Consulte o manual para mais detalhes). Adicionar o programa tempo conforme tabela 2.
      Nota: Neste estudo, o programa é ajustado para mudar automaticamente a corrente em tempos de retenção ajustado, para manter a HPLC a corrente ideal e para manter os picos do cromatograma, sendo ampliado quanto possível, mas ainda no modo de exibição. Isto foi otimizado para striatal lysates de cérebro de ratos.
3. Quando o programa foi adicionado ao detector, faz uma curva de calibração de 3 pontos, injetando o padrão três vezes (5, 10 e 15 μL).
   Nota: Padrão (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/μL = 1 pmol DA)) deve ser injetado a cada décima amostra e amostras calibradas para o padrão mais próximo. Fine tune o sistema o dia antes ajustando o padrão de 3 pontos, e verificando se o cromatograma sai dentro do intervalo esperado. Se for observado ruído substancial, mude a fase móvel. Se um pico superior a 990 mV então re-injetar a amostra em um volume menor, ou fazer um novo programa de gama e uma nova curva padrão. Limite de detecção é medido como 3 vezes o valor de ruído em mV para o menor valor de pico injectado a cada norma (ND, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT e 5-HT).
   1. Sistema de set-up, abrindo a solução de LC e ativando começa de 1; esta análise no modo online. Digite a ID de usuário e senha e clique em okey. Espere a solução de LC para conectar instrumentos. Ir para tabela de lotes e preencha as informações de dados (por exemplo, tipo de amostra: desconhecido para amostras e std para padrão, tipo de análise:-QT, volume de inj: 10, ISTD amt: golpe de nível 1). Salve o arquivo (vá para arquivo - > salve o arquivo de lote como - > salvar).
   2. Que o sistema injete a primeira amostra pressionando ' lote iniciar '. Isso resultará na injeção de amostra de 10 μL pelo mostruário com um módulo de solvente entrega.
      Nota: Utilize uma taxa de fluxo da bomba de 0,15 mL/min e uma coluna C18 com fase de reversão. Aqui, foi usado um detector amperométrico para a deteção de eletroquímica. O eletrodo de carbono vítreo deve ser definido para 0,8 V com um eletrodo de referência Ag/AgCl. Fim do ensaio dopamina, use 3 cromatografia µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partícula tamanho 3 µm) para conseguir a separação cromatográfica.
   3. Extrair as áreas de pico registado e calculado.
      1. Ir para aquisição de dados a seguir o cromatograma quando tem terminado as amostras. Acesse a Lc análise post - > escolheu o nome do arquivo (o cromatograma abrirá) - > clique em ver. Na barra de integração manual, adicione todos os picos para ser integrado - > ir ao relatório de dados e imprima a leitura.
         Nota: Aqui o software de solução LC foi usado para controle de sistema e análise de dados.
4. De áreas de pico, calcular a concentração de dopamina em uma amostra, como segue, usando a concentração conhecida do padrão:
   1. usar a área do pico do padrão (igual a 1 pmol) para adquirir o fator r.
      
   2. usar fator para obter a concentração das amostras.
      Concentração da amostra (em pmol por 10 μL) = área do pico de fator A × da amostra
   3. Use esta fórmula para obter a concentração da amostra em ng.
      Amostra concentração pmol / 10 µ l x 500 µ l x MW de dopamina = concentração da amostra em ng
      amostra concentração (ng) = concentração da amostra (em pmol por 10 μL) x 500 μL x MW de dopamina
   4. usar a concentração da amostra no ng para obter t Ele concentração no tecido pg/g da amostra (amostra concentração em pg / g de tecido = tecido pg/g).

Resultados

Protocolo de captação DA corrente (Figura 1) inclui todas as etapas necessárias para avaliar a funcionalidade do DAT em sinaptossomas de ratos. Nossos dados representativos do método DA absorção (Figura 2) mostra uma curva de saturação com dados não corrigidas (Figura 2B) e ajustados dados (Figura 2A). A curva de saturação mostra captação de ratos tipo selva...

Discussão

Este manuscrito descreve protocolos experimentais úteis para delinear DA homeostase em qualquer modelo do rato da escolha. Nós fornecemos protocolos detalhados para medição de níveis no tecido cerebral de ratos usando HPLC e synaptosomal DA absorção para avaliar funcional DA transporte através de DAT. Os procedimentos, protocolos e limites para o experimento HPLC e ensaio de absorção DA synaptosomal serão elaborados abaixo.

O protocolo de captação synaptosomal pode fornecer uma vi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
COMT inhibitor	Sigma Aldrich, Germany	RO-41-0960	For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-Dopamine	Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA	NET67-3001MC	For synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filters	GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire	1822-024	For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluid	Perkin Elmer	1200-437	For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2	Perkin Elmer		For synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kit	Thermo Scientific Pierce	23225	For synaptosomal DA uptake protocol
HEPES	Sigma Life Science	H3375	For synaptosomal DA uptake protocol
Sucrose	Sigma Life Science	S7903	For synaptosomal DA uptake protocol
NaCl	Sigma Life Science	S3014	For synaptosomal DA uptake protocol
KCl	Sigma Life Science	P9541	For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2	Merck KGaA	10043-52-4	For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4	Sigma Life Science	63065	For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic Acid	Sigma Life Science	A0278	For synaptosomal DA uptake protocol
D-Glucose	Sigma Life Science	G7021	For synaptosomal DA uptake protocol
Pargyline	Sigma Aldrich	P-8013	For synaptosomal DA uptake protocol
Desipramine	Sigma Aldrich	D3900	For synaptosomal DA uptake protocol
Dopamine	Sigma Life Science	H8502	For synaptosomal DA uptake protocol
Cocaine	Sigma Life Science	C5776	For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrix	ASI instruments	RBM2000C	For synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupter	Buch & Holm	Discontinued	For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)	Antec, Leiden, The Netherlands	Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176	For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filter	Frisenette ApS, Denmark	13CP020AS	For HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18	Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany	Part Number:00A-3300-E0	For HPLC protocol
LC solution software	Shimadzu	LabSolutions Series Workstation	For HPLC protocol
Perchlor acid 0.1M	Fluka Analytical	35418-500ml	For HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTA	Sigma	E5134-50g	For HPLC protocol
Natriumdihydrogenphosphar	Bie&Berntsen	1.06346 1000g	For HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrate	Aldrich	74885 -10g	For HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC grade	Scharlau	AC03402500	For HPLC protocol
Filtre 0.22um	Frisenette ApS, Denmark	Avantec 13CP020AS	For HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%	Merck	1.00563. 1000ml	For HPLC protocol
Electrode	Antec, Leiden, The Netherlands	AN1161300	For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detector	Antec, Leiden, The Netherlands	Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176	For HPLC protocol