تطبيق متعدد الألوان فلبوت تقنية لدراسة عالية الدقة مورفولوجيس وحيد الخلية والتفاعلات بين الخلايا لإطلاق في المورفولوجية

Summary

عرض مورفولوجيس مختلف الخلايا وإنشاء مجموعة متنوعة من التفاعلات مع جيرانهم. هذا البروتوكول يصف كيف تكشف مورفولوجية الخلايا المفردة والتحقيق التفاعل خلية-خلية باستخدام نظام التعبير Gal4/UAS الراسخة.

Abstract

تعرض الخلايا مورفولوجيس مختلفة ومعقدة من العلاقات التشريحية. كيف تتفاعل مع جيرانهم الخلايا؟ هل تختلف التفاعلات بين أنواع الخلايا أو حتى داخل نوع معين؟ ما هي أنواع القواعد المكانية أنها تتبع؟ الإجابات على هذه الأسئلة الأساسية في فيفو أعاقت حتى الآن عدم وجود أدوات لتسمية خلية مفردة عالية الدقة. ويرد هنا، بروتوكول مفصل لاستهداف الخلايا المفردة مع تقنية متعددة الألوان فلبوت (مكفو). ويعتمد هذا الأسلوب على المعلمة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (هكتار، والعلم و V5) تحت سيطرة UAS التي يحتفظ بها صامتة بفاصل النسخي يحف به موقعين معاهدة سجل الأفلام (FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام). نبضة صدمة حرارة الحث على التعبير عن الحرارة الناجمة عن صدمة حزب العمل الفيجي recombinase، الذي يزيل أشرطة FRT-توقف-معاهدة سجل الأفلام عشوائياً في الخلايا الفردية: التعبير يحدث فقط في الخلايا التي نعرب أيضا عن برنامج تشغيل GAL4. وهذا يؤدي إلى مجموعة خلايا الملونة بشكل مختلف من نوع خلية معينة يسمح تصور مورفولوجيس الخلايا الفردية بدقة عالية. على سبيل مثال، يمكن الجمع بين تقنية مكفو مع السائقين GAL4 الدبقية محددة لتصور مورفولوجيس من مختلف الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار.

Introduction

إطلاق، السكان الخلايا غير العصبية للجهاز العصبي (NS)، منذ فترة طويلة ويعتقد أن توفير إطار ثابت للخلايا العصبية ولم تدرس بالتفصيل لذلك. ومع ذلك، في البشر، وإطلاق تشكل الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في NS (~ 90%)، وتنقسم إلى عدة فئات مختلفة، بما في ذلك أستروسيتيس، أوليجوديندروسيتيس، ميكروجليا وخلايا شوان. في المورفولوجية، يشكل إطلاق حوالي 10% الخلايا في NS. الفضول، مورفولوجيس، والوظائف ملحوظ مماثلة لتلك التي عثر عليها في الفقاريات^1،2. وتشمل على مورفولوجيس حاجز الدم – المخ (BBB) تشكيل ابيثيليا، وجرت، وأستروسيتي مثل الخلايا.

المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتكون من الهياكل الرئيسية التالية: مناطق القشرة التي تحتوي على جثث الخلايا العصبية؛ نيوروبيلس التي تأوي متشابك الاتصالات؛ مساحات إكسون الصغيرة والكبيرة التي تربط نيوروبيليس مختلفة؛ الأعصاب المحيطية التي تربط الحواس والعضلات مع الجهاز العصبي المركزي (الشكل 1). إطلاق توجد المرتبطة بجميع هذه الهياكل التشريحية: إطلاق اللحاء (CG) في المناطق القشرية، أستروسيتي--مثل إطلاق (ALG) وإطلاق جرت (مثلاً) في مناطق نيوروبيلي، إطلاق جرت ترتبط أيضا بمساحات إكسون المركزية والطرفية الأعصاب (الأسماء)، وأخيراً، هما مثل ورقة إطلاق، إطلاق بيرينيوريال (PG) وسوببيرينيوريال (SPG)، التي تشكل معا طبقة متجاورة تغطي NS كامل (الشكل 2).

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إطلاق تلعب أدواراً هامة في تنمية NS؛ أنها رصد إعداد الخلايا العصبية باﻻستجابة لتعميم عناصره الببتيدات الشبيهة بالانسولين وتوفير الدعم الغذائي للخلايا العصبية، مثل المكوك لاكتات astrocyte-العصبية، والقضاء على الخلايا العصبية الموت عن طريق البلعمه^{3،4 , 5 , 6}-في NS ناضجة، إطلاق الحفاظ على بي بي بي، وتناول العصبية والحفاظ على التوازن الأيونية، بمثابة الخلايا المناعية الرئيسية في NS، منذ الضامة لا يخل بي بي بي، وتعدل النشاط متشابك، فضلا عن سلوك الحيوانات^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

ما إذا كانت الأنواع الفرعية الدبقية مختلفة المهام المتخصصة تظل مسألة مفتوحة هامة. ومع ذلك، إجراء تحليل منهجي على نطاق الجينوم لإطلاق، خصوصا في الكبار، قد أعاق الافتقار إلى الأدوات الوراثية المناسبة للتلاعب بهم. ويرد هنا، أسلوب يسمح توصيف الأشكال الخلية لدراسة التفاعلات المعقدة خلية-خلية فعالة وسهلة. تم تطبيق هذا الأسلوب لتحديد خصائص مورفولوجية مختلفة الأنواع الفرعية الدبقية في الدماغ المورفولوجية الكبار، ولكن تبعاً للسائق GAL4 المحددة المستخدمة، فإنه يمكن تكييفها لدراسة الخلايا العصبية^12،13 ، أي نوع من خلايا الاختلاط، ومن حيث المبدأ أي الأنسجة في أي من مراحل النمو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. "إعداد الذباب" لتجارب متعددة الألوان فلبوت (مكفو)

ملاحظة: تقنية "مكفو" يشير إلى نسخة معدلة من الختان كاسيت وقف حزب العمل الفيجي بوساطة ما يسمى (فلبوت). المعدلة وراثيا مكفو الذباب حمل مروج صدمة حرارة (hsp)-التحكم في ريكومبيناسي حزب العمل الفيجي والصحفيين مختلفة تحت UAS. يتكون كل مراسل دعامة المشترك ميريستويلاتيد (myr) المجلد سوبر أخضر نيون بروتين (سفجفب)، في أي 10 نسخ من علامة حانمه (مثلاً.، هكتار أو العلم أو V5) قد تم إدراجها. تتم تسمية البروتينات الفلورية غير الناتجة عن " وحش السباغيتي الجنسانية " (سمجفبس) ¹⁴ ويمكن الكشف عنها باستخدام أجسام مضادة محددة ضد العلامات حانمه مختلفة-

1. عبر الذباب مع كاسيت مكفو و hsp-حزب العمل الفيجي (hsp-حزب العمل الفيجي؛ 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG، 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) إلى خطوط سائق GAL4 الدبقية المناسبة (انظر الجدول للمواد) .
   1. Hsp تنشط عند 25 درجة مئوية وقد تخضع بعض الخلايا جزئ مما أدى إلى وسم غير محدد، إعداد الصلبان عند 18 درجة مئوية تجنبا ليجتازها للنظام. انتظر حوالي 20 يوما عند 18 درجة مئوية للحصول على الجيل F1. بعد الحرارة صدمة (راجع الخطوة 2)، والحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية ( الشكل 3).

2. حرارة صدمة

ملاحظة: قد تختلف تبعاً للموقع، والإدراج كفاءة hsp-حزب العمل الفيجي؛ ولذلك قد الوقت صدمة الحرارة المثلى يكون الأمثل. لهذا البروتوكول، وقد استخدم أسهم يطير مكفو التي أدرجت hsp-حزب العمل الفيجي على كروموسوم إكس (انظر الجدول للمواد)-

1. نقل ذرية للصليب في الخطوة 1، 1 (الذباب الجيل F1، 3-4 أيام القديمة) في قارورة جديدة التي تحتوي على الأغذية والحرارة صدمة لهم في 37 درجة مئوية في حمام مائي-
   ملاحظة: الذباب الشباب (1-2 أيام القديمة) حساسة جداً للحرارة صدمة. انتظر 1 أو 2 أيام قبل إجراء صدمة الحرارة من أجل خفض معدل الوفيات الناجمة عن العلاج. استخدام بعض من الجيل F1 الذباب كعنصر تحكم، دون صدمة الحرارة.
2. أثناء صدمة الحرارة، الحفاظ على الذباب في القوارير العادية مع الغذاء من أجل خفض معدل الوفيات الناجمة عن الإجهاد. وضع الإناث والذكور في قنينات منفصلة.
3. تأكد من أن تزج القنينة كاملة في الماء لضمان حدوث صدمة حرارة متجانسة. استخدام صدمة 5-8 دقيقة كنقطة انطلاق مناسبة لوسم متفرق إطلاق الخلايا التي تحتوي على العديد من بنود برنامج التشغيل GAL4؛ مدة الصدمة يجب أن يكون الأمثل لكل سائق والتجربة (يلزم مرات صدمة الحرارة أطول أو أقصر).
4. بعد صدمة الحرارة، تكمن قنينات أفقياً على مقاعد البدلاء لبضع دقائق كي يتسنى الذباب للتعافي من صدمة الحرارة.
   ملاحظة: ليس من الضروري تغيير في القنينات.
5. الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية وتشريح (راجع الخطوة 3 و 4) منهم 2 أو أكثر من أيام بعد صدمة الحرارة للتعبير الأمثل مراسل.

3. إعداد التشريح والحلول

1. يوم التشريح، إعداد حل مثبت الطازجة في أنابيب PCR ميليلتر 200 بخلط ميليلتر 180 من S2 خلية الثقافة المتوسطة مع 20 ميليلتر من 20% بارافورمالدهيد (PFA) للحصول على حل منهاج عمل 2%. الحفاظ على الحل مثبت على الجليد قبل وأثناء التشريح.
   تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ويجب التعامل معها بحذر-
   ملاحظة: مزيج ميليلتر 160 من S2 خلية الثقافة المتوسطة مع 40 ميليلتر من بارافورمالدهيد 20% (PFA) في أنبوب بكر 200 ميليلتر لإعداد حل منهاج عمل 4% بدلاً من حل 2%-
2. استخدام أنبوب PCR واحد كل النمط الوراثي بحد أقصى 8-10 العقول كل أنبوب لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة.
إعداد
3. الدماغ الكبار الغسيل الحل: ألبومين المصل البقري 0.5%، 0.5% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: اعتماداً على تلطيخ، محلول يحتوي على 1% وقد يلزم X-100 تريتون. يزيد تركيز أعلى من Triton X-100 اختراق جسم إلى الأنسجة ومن الضروري أن وصمة عار المناطق التي تقع داخل الأنسجة (مثل المناطق متشابك في الدماغ المورفولوجية الكبار)-
4. إعداد حل حظر: مصل الماعز العادي 3% والمصل حمار عادي 3% 0.5% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
5. يمكن تخزين الدماغ الكبار الغسيل الحل والحل حظر عند 4 درجة مئوية لبضعة أسابيع-
6. وضع لوحة زجاج الآبار الاكتئاب العميق على الجليد وملء كل جيدا مع الحلول التالية: واحد مع الإيثانول 70% وواحدة مع برنامج تلفزيوني، وواحدة مع خلية S2 الثقافة المتوسطة.

4. تشريح الدماغ الكبار

1. موقف سم 3 تشريح طبق في مرحلة ستيريوميكروسكوبي وملئه بخلية S2 الباردة الثقافة المتوسطة. إجراء تشريح جميع في هذه الوسيلة لضمان بقاء الأنسجة الصحية أثناء إجراء تشريح.
   ملاحظة: استخدم طبق تشريح اصطف مع عدة ملليمترات من السيليكون الأسود الذي ينص على النقيض خلفية جيدة (في الصور)، والاحتفاظ الملقط خلال التشريح.
2. تخدير الذباب من النمط الوراثي المطلوب مع CO ₂-
3. مع الملقط، انتزاع يطير بالأجنحة وغسله في الإيثانول 70% الباردة لمدة 30 ثانية، ثم مع برنامج تلفزيوني الباردة 30 إضافية س.
4. نقل الطاير إلى الاكتئاب العميق جيدا مليء بالمتوسطة ثقافة الخلية S2.
5. كرر نفس الإجراء لجميع الذباب من نفس النمط الوراثي والمحافظة عليها في الخلية S2 الباردة الثقافة المتوسطة حتى التشريح، الذي سوف يحافظ على الأنسجة.
   ملاحظة: تخدير فقط عدد الذباب الذي يمكن تشريح في فترة زمنية من حوالي 30 دقيقة في حضانة في أوقات طويلة في S2 خلية الثقافة المتوسطة قد تتلف الأنسجة.
6. الاستيلاء على الطاير مع الملقط، وتحت ستيريوميكروسكوبي، تغرق الطاير في مستنبت الخلية S2.
7. فصل الرأس عن باقي الجسم. تجاهل الجسم وإبقاء الرأس غارقة في S2 خلية الثقافة المتوسطة. من المهم جداً عقد الرأس مع الملقط لكامل مدة التشريح. إذا كان الرأس يبدأ بتعويم، سيكون من الصعب على استعادته دون إلحاق الضرر بالانسجة.
تبدأ
8. التشريح عن طريق سحب عينة واحدة، بينما يمسك الرأس مع الملقط واحدة على الأقل في جميع الأوقات. تأكد من أن تلميح الملقط هو أسفل شبكية العين لتجنب إتلاف الأنسجة تحت. سحب العين الأخرى والبدء في إزالة بشرة حتى يظهر الدماغ.
9. إزالة جميع أنسجة القصبة الهوائية وبشرة حول الدماغ حتى تظهر الأنسجة نظيفة. تأكد من إزالة جميع الأنسجة الرغامى حول الدماغ لتحقيق أفضل النتائج المصبوغة؛ الأنسجة جاهزة الآن لتكون ثابتة والملون.
10. الحفاظ على جميع العقول تشريح في S2 الباردة الخلية المتوسطة الثقافة قبل تحويلها إلى حل منهاج العمل من أجل الوقت خطوة التثبيت.

5. تلوين الدماغ الكبار

< را>

نقل الدماغ معزولة مع ماصة P10 في حل منهاج العمل في درجة حرارة الغرفة (RT). لتجنب إتلاف الأنسجة، ابدأ استخدام الملقط لنقل العقول بعد التشريح. تنفيذ كافة الخطوات في أنابيب PCR ميليلتر 200 على نوتاتور.

بجميع الخطوات، قبل تجاهل الحل القديم مع ماصة P200، تسمح بالعقل المدبر ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب. محاولة إزالة المادة طافية دون يسفط الأنسجة. حماية الأنسجة من التعرض للضوء.

فيكس

العقول في ميليلتر 200% 2 منهاج عمل بيجين في S2 خلية الثقافة المتوسطة ح 1 أو 4% منهاج العمل لمدة 30 دقيقة. تبقى مرات التثبيت متطابقة بين العينات من أجل زيادة إمكانية تكرار نتائج.

بعد أن يغسل 3 (أو أكثر) مدة كل منهما 15 دقيقة في 200 ميليلتر من الدماغ الكبار الغسيل الحل، كتلة الأنسجة مع 200 ميليلتر من عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة. أوقات أطول في الحضانة في عرقلة الحل ممكن.

إينكوباتي العقول المبيت في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأساسي المخفف في الدماغ الكبار الغسيل الحل في إجمالي حجم 200 ميليلتر.
ملاحظة: قد تختلف أوقات الحضانة تبعاً للنوع من الأجسام المضادة المستخدمة. قد يكون من الضروري إينكوبيشنز أطول.

1. لوضع العلامات من علامات مكفو الثلاثة، احتضان العقول مع مكافحة--هكتار (1: 500)، المضادة العلم (حانمه ديكدددك) (1: 100)، والأجسام المضادة-V5 الأولية.
2. الابتدائية مترافق مباشرة الأجسام المضادة يمكن أن تستخدم بدلاً من الجمع الابتدائي + الثانوية العادية (مثلاً.، أنتي-V5:DyLight 549 (1: 200)). وفي هذه الحالة، علاج الأجسام المضادة مترافق مباشرة كالأجسام المضادة الثانوية-
   ملاحظة: لكل الوراثي، تبقى بعض العقول كعناصر تحكم التحقق من الطابع الخاص لتلطيخ. تخطي في الحضانة جسم الابتدائية وانتقل مباشرة إلى الخطوة التالية-

غسل الأنسجة 3 مرات ح 1 في 200 ميليلتر من الدماغ الكبار الغسيل الحل (الخطوة 3، 3) واحتضانها لهم مع الثانوي fluorophore-يصرف الابتدائية مباشرة مترافق أضداد المخفف في الدماغ الكبار الغسيل الحل بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية أو 4 ح في الرايت، في إجمالي حجم 200 ميليلتر
ملاحظة: أمثلة من الأجسام المضادة المناسبة: 488 اليكسافلور (1: 250)، مكافحة-V5:DyLight 549 (1: 200) وديلايت 647 (1: 100)-مترافق الأجسام المضادة.

غسل أدمغة 3 مرات ح 1 في 200 ميليلتر من الدماغ الكبار الغسيل الحل، تليها يغسل نهائي في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1-2 في الرايت؛ ويزيل أي آثار ل X-100 تريتون خطوة الغسيل النهائي في برنامج تلفزيوني وضروري نتائج المصبوغة مثلى. جبل العقول في وسط تصاعد مع عامل تتلاشى المضادة على الزجاج كوفيرسليبس.

6. تصاعد من العقول لتصوير

1. تريم تصوير فاصل إلى الحجم المناسب باستخدام مقص. للفحص المجهري عالية الاستبانة، ساندويتش فاصل العينة والتصوير بين اثنين الزجاج كوفيرسليبس.
   ملاحظة: يتم تصوير الفواصل رقيقة (0.12 مم) الفواصل لاصقة قشر والعصا على الشرائح الزجاجية كوفيرسليبس أو المجهر، السماح بتركيب العينات دون ضغط.
إزالة الخطوط الملاحية المنتظمة لاصقة من سطح أحد
2. استخدام الملقط، وتطبيق مباعدة لاصق الجانب الأسفل، على سطح الزجاج ساترة (22 مم × 60 مم). تطبيق 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة ساترة زجاج جديد.
3. مع P10 ماصة، نقل العقول من أنبوب 200 ميليلتر إلى ساترة، إلى جانب انخفاض المتوسط المتصاعدة. جنبا إلى جنب مع الأنسجة، نقل بعض برنامج تلفزيوني من أجل المحافظة على العقول في الحل-
4. مع P10 ماصة، نقل العقول من برنامج تلفزيوني إلى قطره من تصاعد المتوسطة في محاولة للحد من برنامج تلفزيوني. نقل العينات في وسط تصاعد في ساترة مع فاصل التصوير. استخدام وسائل الإعلام المتزايدة ما يكفي لتغطية العينة.
إزالة الخطوط الملاحية المنتظمة لاصقة أخرى من الجانب العلوي من فاصل
5. وإضافة ساترة زجاجية على رأس العينات. مع تلميح الملقط، تطبيق ضغط لطيف فوق منطقة لاصقة لختم. صورة الأنسجة المركبة فورا أو تخزين الشرائح في-20 درجة مئوية لتحليلها في وقت لاحق.

7. التقاط صور

1. الحصول على أكوام من الصور الأسفار [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل] مع 40 س (NA = 1.2، غمر المياه) الهدف أو 63 X (NA = 1.4، غمر النفط) الهدف (أحجام بكسل = 1,024 x 1,024 على متن الطائرة س ص؛ المسافة بين قسمين [كنفوكل] = 0.5 ميكرومتر). ضبط الإزاحة في كل قناة في مثل هذه طريقة أن لا مشبعة بكسل وقيم بكسل الصفر موجودة في الصور؛ والكشف عن الكسب هذا يتجنب فقدان المعلومات ويضمن استخدام النطاق الديناميكي الكامل كاشف.
   ملاحظة: نظراً لتصوير ثلاثي الأبعاد مضيعة للوقت، يمكن أن يكون آليا القياسات عن طريق فحص عينات متعددة في نفس الوقت في مواقع مختلفة. لتجنب التبخر مع الهدف غمر المياه، استخدام النفط الخاص الغمر المتوسطة مع معامل الانكسار n = 1.33.
2. عملية المداخن [كنفوكل] للحد الأقصى من الكثافة الإسقاطات، التغييرات في هوي القناة، وضبط السطوع والتباين باستخدام أي برنامج تحليل الصورة القياسية (انظر الجدول للمواد)-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام تقنية مكفو في الدماغ المورفولوجية الكبار. ويبين الشكل 3 تخطيطي للأسلوب. وتحتفظ غشاء الموسومة بشكل مختلف الصحفيين الثلاثة (myr-سمجفب-ها myr-سمجفب-العلم و myr-سمجفب-V5)، تحت سيطرة UAS ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة وفعالة لدراسة مورفولوجية أنواع الخلايا المختلفة داخل أنسجة للاهتمام بدقة عالية. مع تقنية مكفو، تستخدم الصحفيين متعددة مع العلامات حانمه مختلفة في تركيبة لوسم العشوائية متعددة الألوان (الشكل 2). مماثلة إلى أساليب أخرى مثل برينبوو/فليبو

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning