Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

Zusammenfassung

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und komplexen anatomischen Verhältnisse. Wie interagieren die Zellen mit ihren Nachbarn? Unterscheiden sich die Wechselwirkungen zwischen Zelltypen oder sogar innerhalb eines bestimmten Typs? Welche Arten von räumlichen Regeln folgen sie? Die Antworten auf solche grundlegenden Fragen in Vivo haben bisher durch einen Mangel an Tools für hochauflösende Einzelzelle Kennzeichnung behindert worden. Hier steht ein detailliertes Protokoll auf einzelne Zellen mit einer mehrfarbigen FlpOut (MCFO) Technik zur Verfügung. Diese Methode beruht auf drei unterschiedlich tagged Reporter (HA, Flagge und V5) unter FH-Kontrolle, die durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) still gehalten werden. Ein Hitze-Schock-Puls induziert die Expression von einer Hitze Schock-induzierte Flp Rekombinase, die nach dem Zufallsprinzip die FRT-Stop-FRT-Kassetten in einzelnen Zellen entfernt: Ausdruck tritt nur in Zellen, die auch einen GAL4-Fahrer zum Ausdruck bringen. Dies führt zu einer Reihe von unterschiedlich gefärbten Zellen von einem bestimmten Zelltyp, der die Visualisierung der einzelnen Zelle Morphologien in hoher Auflösung ermöglicht. Als Beispiel kann die MCFO Technik mit spezifischen Glia GAL4-Treibern, die Morphologien der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila zu visualisieren kombiniert werden.

Einleitung

Glia, der nicht-neuronale Zellpopulation des Nervensystems (NS), waren lange geglaubt, um einen statischen Rahmen für Neuronen und wurden daher nicht im Detail untersucht. Jedoch beim Menschen, Glia bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in der NS (~ 90 %) und fallen in verschiedene Kategorien, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und Schwann-Zellen. In DrosophilaGlia sind etwa 10 % der Zellen in der NS. Faszinierenderweise sind ihren Morphologien und Funktionen bemerkenswert ähnlich denen in Wirbeltieren^1,2. Ihre Morphologien gehören Blut - Hirn-Schranke (BBB) Epithelien, Ensheathing und Astrozyten-wie Zellen bilden.

Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus folgenden Grundstrukturen: Cortex-Regionen, die enthalten die neuronalen Zellkörpern; Neuropils, die synaptische Verbindungen zu beherbergen; kleine und große Axon Traktate, die die verschiedenen Neuropiles zu verbinden; periphere Nerven, die Sinnesorgane und Muskeln mit CNS (Abbildung 1) zu verbinden. Glia sind assoziiert mit diesen anatomischen Strukturen gefunden: Cortex Glia (CG) in den kortikalen Regionen, Astrozyten-ähnliche Glia (ALG) und Ensheathing Glia (EG) in den Neuropile Regionen, Ensheathing Glia sind auch zentrale Axon Traktate und peripheren zugeordnet Nerven (EGN), und schließlich zwei folienartigen Glia, perineurial Glia (PG) und subperineurial (SPG), die zusammen bilden eine zusammenhängenden Schicht, die die gesamte NS (Abbildung 2) abdeckt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der NS; Sie überwachen neuronale Zelle Zahlen durch Reaktion auf systemisch zirkulierende Insulin-Like-Peptide, Neuronen, wie z. B. die Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle, trophische unterstützen und beseitigen sterbende Neuronen durch Phagozytose^{3,4 , 5 , 6}. in die Reife NS Glia pflegen die BBB Neurotransmitter nehmen Ionischen Homöostase aufrechtzuerhalten, und fungieren als wichtigeren Immunzellen in der NS, da Makrophagen nicht die BBB verletzen und synaptische Aktivität sowie das Verhalten der Tiere^{6 moduliert , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Ob der glialen Subtypen spezialisierte Funktionen ausführen, bleibt eine wichtige offene Frage. Jedoch wurde eine systematische genomweite Analyse der Glia, vor allem bei den Erwachsenen, durch einen Mangel an geeigneten genetischen Tools für ihre Handhabung behindert. Hier ist eine Methode, die ermöglicht die effiziente und einfache Charakterisierung der Zellformen zu komplexen Zellezelle Interaktionen zu untersuchen präsentiert. Diese Technik wurde zur Charakterisierung der Morphologie der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila angewandt, aber abhängig von den jeweiligen GAL4-Treiber verwendet, es kann angepasst werden, um Neuronen^{12,13 studieren} , jede Art von Vermischung Zellen und im Prinzip jedes Gewebe in alle Entwicklungsstadien.

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Protokoll

1. Vorbereitung fliegen für mehrfarbige FlpOut (MCFO) Experimente

Hinweis: die MCFO Technik bezieht sich auf eine modifizierte Version der so genannten Flp-vermittelten Stop Kassette Exzision (FlpOut). Transgene MCFO fliegen tragen einen Hitze-Schock-Promotor (Hsp)-Flp Rekombinase und andere Reporter unter UAS zu kontrollieren. Jeder Reporter besteht aus einer gemeinsamen Rückgrat einer Myristoylated (Myr) super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP), in welcher 10 Exemplare eines Epitops Tags (zB., HA, Flagge oder V5) eingelegt. Die daraus resultierende nicht fluoreszierenden Proteine benannt " Spaghettimonster GFPs " (SmGFPs) ¹⁴ und detektiert werden mit spezifischen Antikörpern gegen die verschiedenen Epitop Tags.

1. Fliegt Kreuz mit der MCFO Kassette und die Hsp-Flp (Hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) zu den entsprechenden glialen GAL4 Fahrer Linien (siehe Tabelle der Materialien) .
   1. Eingerichtet wie der Hsp bereits aktiv bei 25 ° C ist und einige Zellen können Rekombination führt zu einer unspezifischen Kennzeichnung durchlaufen Kreuze bei 18 ° C um Undichtigkeit des Systems zu vermeiden. Warten Sie ca. 20 Tage bei 18 ° C, die F1-Generation zu erhalten. Nach der Hitze Schock (siehe Schritt 2), halten fliegen bei 25 ° C ( Abbildung 3).

2. Heat Shock

Hinweis: abhängig von der Einstichstelle kann die Effizienz der Hsp-Flp abweichen; daher die optimale Hitze Schock Zeit muss optimiert werden. Für dieses Protokoll ein MCFO fliegen bestand in der Hsp-Flp, auf dem x-Chromosom eingefügt wurde verwendet wurde (siehe Tabelle der Werkstoffe).

1. Übertragung der Nachkommenschaft des Kreuzes im Schritt 1.1 (F1-Generation fliegt, 3-4 Tage alt) in neue Ampullen mit Nahrung und Wärme schockieren sie bei 37 ° C in einem Wasserbad.
   Hinweis: Junge fliegen (1-2 Tage alt) sind sehr empfindlich gegenüber Hitzeschock. Warten Sie 1 oder 2 Tage vor der Durchführung der Hitzeschock um die Sterblichkeit infolge der Behandlung zu verringern. Verwenden einige der F1-Generation fliegt als ein Steuerelement ohne Hitzeschock.
2. Während der Hitzeschock fliegen in normalen Fläschchen mit Lebensmitteln aufrechtzuerhalten, um die Rate der Stress-induzierte Sterblichkeit zu verringern. Weibchen und Männchen in separaten Fläschchen setzen.
3. Achten Sie darauf, das gesamte Fläschchen in das Wasser zu einer homogenen Hitzeschock gewährleisten eintauchen. Verwenden Sie einen 5-8 min Schock als ein geeigneter Ausgangspunkt für spärlich Kennzeichnung von Glia-Zellen mit vielen GAL4 Fahrer Linien; die Schock-Dauer muss für jeden Fahrer und Experiment (kürzere oder längere Hitze Schock mal möglicherweise erforderlich) optimiert werden.
4. Nach der Hitzeschock lag die Flaschen horizontal auf der Bank für ein paar Minuten damit die fliegen von der Hitzeschock erholen können.
   Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Fläschchen ändern.
5. Pflegen die fliegen bei 25 ° C und sezieren (siehe Schritt 3 und 4) sie mindestens 2 Tage nach dem Hitzeschock für optimale Reporter Ausdruck.

3. Dissektion Vorbereitung und Lösungen

1. Tag der Dissektion, bereiten frische Fixativ Lösung in 200 µL PCR Schläuche durch das Mischen von 180 µL S2 Zellkulturmedium mit 20 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA), eine 2 % PFA-Lösung zu erhalten. Wartung der Fixativ Lösung auf dem Eis vor und während der Dissektion.
   Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.
   Hinweis: 160 µL S2 Zellkulturmedium mit 40 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA) in einem 200 µL PCR-Röhrchen, bereiten Sie eine 4 % PFA Lösung anstelle einer 2 % igen Lösung mischen.
2. Verwenden eine PCR-Röhrchen pro Genotyp mit maximal 8-10 Köpfe pro Röhre für optimale Färbung Ergebnisse.
3. Bereiten die Erwachsene Gehirn Waschlösung: 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,5 % Triton x-100 in PBS.
   Hinweis: Je nach der Färbung, einer Lösung mit 1 % sein Triton x-100 erforderlich. Eine höhere Konzentration von Triton x-100 erhöht die Penetration des Antikörpers ins Gewebe und es ist notwendig, Fleck-Regionen, die tief in das Gewebe (z. B. synaptischen Regionen im erwachsenen Gehirn Drosophila) liegen.
4. Bereiten Sie die blockierende Lösung: 3 % normalem Ziegenserum, 3 % normale Esel Serum und 0,5 % Triton x-100 in PBS.
5. Erwachsene Gehirn waschen und die blockierende Lösung ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden.
6. Tiefe Depression Brunnen Glasplatte auf Eis gelegt und füllen jeweils auch mit den folgenden Lösungen: mit 70 % Ethanol, mit PBS und mit S2 Zellkulturmedium.

4. Erwachsenen Gehirn Dissektion

1. 3 cm Teller auf der Bühne eines Stereomikroskops sezieren zu positionieren und füllen Sie ihn mit kaltem S2 Zellkulturmedium. Führen Sie alle Sektionen in diesem Medium um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Verfahrens der Dissektion gesund bleibt.
   Hinweis: Verwenden Sie einen sezierenden Teller, gesäumt von mehreren Millimetern von schwarzem Silikon sorgt für einen guten Hintergrundkontrast (in den Bildern) und bewahren die Zange während der Dissektion.
2. Betäuben die fliegen von der gewünschten Genotyp mit CO ₂.
3. Mit der Pinzette, greifen die Fly-by-Flügel und waschen Sie ihn in kaltem 70 % igem Ethanol für 30 s, dann mit kaltem PBS für zusätzliche 30 s.
4. Übertragen die Fliege in die Tiefe Depression gut, die gefüllt ist mit S2 Zellkulturmedium.
5. Wiederholen Sie den Vorgang für alle fliegen des gleichen Genotyps und pflegen sie in kalten S2 Zellkulturmedium bis Dissektion, die das Gewebe erhalten.
   Hinweis: Zu betäuben, nur die Anzahl der fliegen, die in einem Zeitraum von ca. 30 min. langen Inkubationszeiten in S2 Zellkulturmedium seziert werden kann das Gewebe schädigen kann.
6. Im laufenden Betrieb mit Zange greifen und unter einem Stereomikroskop tauchen die Fliege in S2 Zellkulturmedium.
7. Trennen den Kopf vom Rest des Körpers. Verwerfen Sie den Körper und halten Sie den Kopf in S2 Zellkulturmedium getaucht. Es ist äußerst wichtig, den Kopf mit der Pinzette für die gesamte Dauer der Dissektion zu halten. Wenn der Kopf beginnt zu schweben, es wird schwierig sein, es abzurufen, ohne das Gewebe zu schädigen.
8. Beginnen die Zerlegung durch Herausziehen eines Auges, während Sie den Kopf mit mindestens eine Zange zu allen Zeiten halten. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Zange direkt unterhalb der Netzhaut zu vermeiden das Gewebe unterhalb schadet. Ziehen Sie das andere Auge und beginnen, entfernen der Nagelhaut, bis das Gehirn erscheint.
9. Entfernen Sie alle trachealen Gewebe und Nagelhaut um das Gehirn herum, bis das Gewebe sauber erscheint. Achten Sie darauf, alle trachealen Gewebe um das Gehirn für optimale Färbung Ergebnisse zu entfernen; die Gewebe sind jetzt bereit, fixiert und gefärbt werden.
10. Pflegen die seziert Köpfe in kalten S2 Zelle Kulturmedium vor der Übertragung in die PFA-Lösung um die Fixierung Schritt Zeit.

5. Erwachsenen Gehirn Färbung

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Übertragen die isolierte Gehirn mit einer P10-Pipette in die PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT). Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie niemals Pinzetten für die Übertragung von den Gehirnen nach der Präparation. Führen Sie alle Schritte in 200 µL PCR Röhren auf ein Nutator.

Für alle Schritte, bevor verwerfen die alte Lösung mit einer Pipette P200 lassen Sie die Köpfe auf den Boden des Röhrchens zu Regeln. Versuchen Sie, den Überstand zu entfernen, ohne das Gewebe absaugen. Das Gewebe vor Lichteinwirkung schützen.

Fixieren die Köpfe in 200 µL 2 % PFA in S2 Zellkulturmedium für 1 h oder 4 % PFA für 30 Minuten. Halten die Fixierung Mal identisch zwischen Proben um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.

Nach 3 (oder mehr) von jeweils 15 Minuten in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, wäscht blockieren die Gewebe mit 200 µL Lösung für 30 Minuten zu blockieren. Längere Inkubationszeiten bei der Blockierung Lösung sind möglich.

Inkubieren die Gehirn über Nacht bei 4 ° C mit verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung in einem Gesamtvolumen von 200 µL Primärantikörper.
Hinweis: Die Inkubationszeiten variieren je nach Art der Antikörper verwendet. Längere Inkubationen können erforderlich sein.

1. Für die Bezeichnung der drei MCFO Marker, brüten die Gehirne mit anti-HA (1: 500), Anti-FLAG (DYKDDDDK Epitop) (1: 100), und Anti-V5 Primärantikörper.
2. Primäre direkt konjugierten Antikörpern könnte statt der normalen primären + sekundäre Kombination verwendet werden (zB., Anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). In diesem Fall behandeln die direkt konjugierten Antikörper als Sekundärantikörper.
   Hinweis: Für jeden Genotyp halten Sie einige Gehirne als Steuerelemente, die Spezifität der Färbung zu überprüfen. Die Primärantikörper Inkubation zu überspringen und direkt zum nächsten Schritt gehen.

Waschen Gewebe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung (Schritt 3.3) und inkubieren sie mit Fluorophor-Konjugate/primär direkt konjugierten Sekundärantikörper verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung über Nacht bei 4 ° C oder 4 h bei RT, in einem Gesamtvolumen von 200 µL
Hinweis: Beispiele für entsprechende Antikörper: AlexaFluor 488 (1: 250), Anti-V5:DyLight 549 (1: 200) und DyLight 647 (1: 100)-konjugierten Antikörpern.

Waschen die Köpfe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, gefolgt von einer endgültigen waschen in 200 µL PBS über Nacht bei 4 ° C oder 1-2 h bei RT; die letzten Waschschritt mit PBS-Puffer entfernt alle Spuren von Triton x-100 und ist notwendig für optimale Färbung Ergebnisse. Montieren Sie die Köpfe in Eindeckmittel mit einem Anti-Fade-Agenten auf Glasdeckgläser.

6. Für die Bildgebung des Gehirns Montage

1. Trim eine Bildgebung Abstandhalter auf die entsprechende Größe mit einer Schere. Für hochauflösende Mikroskopie, sandwich-Probe und Bildgebung Abstandhalter zwischen zwei Glasdeckgläser.
   Hinweis: Imaging Distanzscheiben sind dünne (0,12 mm dick) selbstklebende Abstandshalter, die Schale und halten Sie sich an Deckgläsern oder Mikroskop Objektträger, ermöglicht die Montage von Proben ohne Komprimierung.
2. Mit Zange, entfernen Sie die selbstklebende Folie von einer Oberfläche und Spacer, klebende Seite nach unten, auf der Oberfläche von einem Glas Deckgläschen (22 x 60 mm). Ein neues Glas Deckglas 10 µL Eindeckmedium zuweisen.
3. Mit ein P10 Pipette, übertragen die Gehirne aus 200 µL Tube, Deckglas, neben den Tropfen Eindeckmittel. Zusammen mit den Geweben, einige PBS zu übertragen, um die Köpfe in Lösung halten.
4. Mit ein P10 Pipette, bewegen die Gehirne von PBS bis zum Tropfen Eindeckmittel versuchen, die Menge der PBS zu begrenzen. Übertragen Sie die Exemplare in Eindeckmittel auf das Deckglas mit bildgebenden Abstandhalter. Genügend Montage Medien nutzen, um die Probe zu decken.
5. Die selbstklebende Folie von der Oberseite der Abstandhalter entfernen und hinzufügen ein Glas Deckglas auf die Proben. Wenden Sie mit einer Pinzette einen sanften Druck über die Klebefläche zu versiegeln. Bild der montierten Gewebe sofort oder lagern Sie die Folien bei-20 ° C für eine spätere Analyse.

7. Bild Erwerb

1. Acquire Stapel konfokale Fluoreszenz-Bilder mit einem confocal Mikroskop mit einem 40 X (NA = 1.2, Eintauchen in Wasser) Ziel oder 63 X (NA = 1.4, Ölimmersion) Ziel (Pixelgrößen = 1.024 x 1.024 in der Xy-Ebene; Abstand zwischen zwei konfokalen Abschnitte = 0,5 µm). Stellen Sie Detektor Gain und Offset in jedem Kanal in einer Weise, dass keine gesättigten Pixel und Null Pixelwerte in den Bildern vorhanden sind; Dies vermeidet Informationsverluste und sorgt für den vollen Dynamikumfang des Detektors.
   Hinweis: Da 3D-Bildgebung zeitaufwändig ist, können durch das Scannen mehrerer Proben parallel an verschiedenen Orten die Messungen automatisiert werden. Verwenden Sie zur Vermeidung von Verdampfung mit dem Ziel, Wasser eintauchen Spezialöl eintauchen Medium mit Brechungsindex n = 1,33.
2. Verarbeiten die konfokale Stacks für maximale Dichte Projektionen, Änderungen im Kanal Farbton und Anpassung von Helligkeit und Kontrast mit jedem standard-Image-Analyse-Software (siehe Tabelle der Werkstoffe).

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Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mithilfe der MCFO-Technik im erwachsenen Gehirn Drosophila abgerufen werden können. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Methode. Drei unterschiedlich Membran-Tags Reporter (Myr-SmGFP-HA, Myr-SmGFP-FLAG und Myr-SmGFP-V5) unter Kontrolle der FH sind durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) geschwiegen. Ein Hitze-Sch...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode, um die Morphologie der verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes von Interesse in hoher Auflösung zu studieren. Mit der MCFO Technik mehrere Reporter mit verschiedenen Epitop-Tags in Kombination multicolor stochastische Kennzeichnung (Abbildung 2) dienen. Ähnlich wie bei anderen Methoden wie Brainbow/Flybow^15,16,17, MCFO erhö...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning