Application de MultiColor FlpOut Technique pour étudier les Morphologies de cellule unique de haute résolution et Interactions cellulaires des cellules gliales chez la drosophile

Résumé

Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.

Résumé

Les cellules affichent différentes morphologies et relations anatomiques complexes. Comment les cellules interagissent avec leurs voisins ? Les interactions diffèrent-ils entre les types de cellules ou même au sein d’un type donné ? Quels types de règles spatiales ils suivent ? Les réponses à ces questions fondamentales in vivo ont été entravés jusqu'à présent par un manque d’outils pour l’étiquetage de cellule unique de haute résolution. Ici, un protocole détaillé pour cibler les cellules individuelles avec une technique de FlpOut MultiColor (MCFO) est fourni. Cette méthode s’appuie sur trois marqués différemment reporters (HA, drapeau et V5) sous contrôle de l’UAS qui restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-FRT). Une impulsion de choc thermique induit l’expression d’une recombinase Flp de chaleur d’induite par le choc, qui enlève au hasard les cassettes de FRT-stop-FRT dans des cellules individuelles : expression se produit uniquement dans les cellules qui expriment également un pilote de GAL4. Cela conduit à une matrice de cellules colorées différemment d’un type donné de cellules qui permet la visualisation des morphologies de cellules individuelles à haute résolution. À titre d’exemple, la technique MCFO est cumulable avec les pilotes de GAL4 gliales spécifiques pour visualiser les morphologies des différents sous-types gliales dans le cerveau adulte de la drosophile .

Introduction

Glia, la population de cellules non neuronales du système nerveux (NS), ont longtemps cru à fournir un cadre statique pour les neurones et n’ont donc pas été étudiées en détail. Cependant, chez les humains, cellules gliales constituent la grande majorité des cellules dans le NS (~ 90 %) et entrent dans plusieurs catégories, y compris les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie et les cellules de Schwann. Chez la drosophile, cellules gliales constituent environ 10 % des cellules dans le NS. Curieusement, leurs morphologies et leurs fonctions sont remarquablement similaires à ceux trouvés chez les vertébrés^1,2. Leurs morphologies comprennent la barrière hémato - encéphalique (BHE) formant des épithéliums, engainantes et cellules semblables à des astrocytes.

Drosophila système nerveux central (SNC) se compose des structures principales suivantes : régions de cortex qui contiennent les corps cellulaires neurones ; neuropils hébergeant des connexions synaptiques ; tracts axon petits et grands qui relient les différents neuropiles ; nerfs périphériques qui se connectent les organes sensoriels et les muscles avec le système nerveux central (Figure 1). Cellules gliales se trouvent associés à toutes ces structures anatomiques : Cortex cellules gliales (CG) dans les régions corticales, astrocyte ressemblant cellules gliales (ALG) et engainantes glia (EG) dans les régions de neuropile, engainantes glia sont aussi associés aux tracts axon central et périphérique nerfs (EGN) et enfin, deux feuillet glia, périneurale glia (PG) et subperineurial (SPG), qui ensemble forment une couche contigue qui recouvre l’ensemble NS (Figure 2).

Des études antérieures ont montré que glia jouent un rôle important dans le développement de la NS ; elles surveillent nombre de cellules neuronales en réagissant à la circulation systémique insuline-like peptides, soutiennent trophique aux neurones, tels que la navette de lactate astrocyte-neurone et éliminer les neurones mourants par phagocytose^{3,4 , 5 , 6}. dans le NS mature, cellule gliale maintenir la BHE, relever les neurotransmetteurs et maintenir l’homéostasie ionique, agissent comme les grandes cellules immunitaires dans le NS, étant donné que les macrophages ne peuvent violer la BHE et moduler l’activité synaptique comme comportement animal^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Si les différents sous-types gliales fonctions spécialisées importante question reste ouverte. Cependant, une analyse systématique de tout le génome des cellules gliales, surtout chez l’adulte, a été entravée par un manque d’outils génétiques appropriés pour leur manipulation. Ici, on présente une méthode qui permet la caractérisation facile et efficace des formes cellulaires pour étudier les interactions cellule-cellule complexe. Cette technique a été utilisée pour caractériser la morphologie des différents sous-types gliales dans le cerveau de drosophile adulte, mais, selon le pilote spécifique de GAL4 utilisé, il pourrait être adapté pour étudier les neurones^12,13 , tout type de cellules entremêlant et en principe n’importe quel tissu dans des stades de développement.

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Protocole

1. préparation des mouches pour expériences MultiColor FlpOut (MCFO)

Remarque : MCFO le technique se réfère à une version modifiée de l’excision de cassette Flp-mediated arrêt ce qu’on appelle (FlpOut). Transgéniques MCFO mouches portent un promoteur de choc thermique (hsp)-recombinase Flp et différents journalistes sous SAMU de contrôle. Chaque journaliste est constitué d’une ossature commune d’une myristoylated (myr) super dossier vert fluorescent protéine (sfGFP), dont 10 exemplaires d’une balise de l’épitope (e.g., HA, drapeau ou V5) ont été insérés. Les protéines fluorescentes qui en résultent sont nommées " monstre en spaghettis sexes " (smGFPs) ¹⁴ et peuvent être détectés en utilisant des anticorps spécifiques contre les épitopes différents tags.

1. Cross vole avec la cassette MCFO et le PIH-Flp (hsp-Flp ; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) à gliales GAL4 conducteur lignes appropriées (voir Table des matières) .
   1. Comme le PSH est déjà actif à 25 ° C et peu de cellules peut-être subir une recombinaison conduisant à un marquage non spécifique, mis en place des croisements à 18 ° C afin d’éviter la perméabilité du système. Attendre environ 20 jours à 18 ° C pour obtenir la génération F1. Après la chaleur de choc (voir étape 2), de maintenir les mouches à 25 ° C ( Figure 3).

2. Choc thermique

Remarque : selon le site d’insertion, l’efficacité de la PIH-Flp peut-être différer ; par conséquent, le temps du choc thermique optimal doit être optimisé. Pour ce protocole, un stock de mouche MCFO dans laquelle le PSH-Flp a été inséré sur le chromosome X a été utilisé (voir Table des matières).

1. Transfert la progéniture de la Croix à l’étape 1.1 (oiseau de génération F1, âgés de 3 à 4 jours) dans les nouveaux flacons contenant des aliments et la chaleur de leur choc à 37 ° C dans un bain d’eau.
   Remarque : Les jeunes mouches (1-2 jours) sont très sensibles aux chocs thermiques. Attendre 1 ou 2 jours de plus avant d’effectuer le choc thermique afin de réduire le taux de mortalité causé par le traitement. Utilisation de certains de la génération F1 vole comme un contrôle, sans choc thermique.
2. Pendant le choc thermique, maintenir les mouches en flacons normales avec de la nourriture afin de diminuer le taux de mortalité induite par le stress. Mettre les femmes et les hommes dans des flacons séparés.
3. Veillez à plonger le flacon entier dans l’eau pour assurer un choc thermique homogène. Utiliser un choc de 5-8 min comme point de départ approprié pour l’étiquetage clairsemée des cellules gliales de nombreuses lignes de pilote GAL4 ; la durée du choc doit être optimisée pour chaque pilote et expérience (temps de choc thermique plus ou moins longue peuvent être nécessaires).
4. Après le choc thermique, poser les flacons horizontalement sur le banc pendant quelques minutes afin de permettre les mouches à récupérer du choc thermique.
   Remarque : Il n’est pas nécessaire de changer les flacons de.
5. Maintenir les mouches à 25 ° C et disséquer (Voir l’étape 3 et 4) les 2 jours ou plus après le choc de la chaleur pour l’expression du Rapporteur optimale.

3. Préparation de la dissection et de la Solutions

1. le jour de la dissection, préparer la solution de fixation fraîche dans des tubes PCR 200 µL en mélangeant 180 µL de milieu de culture cellulaire S2 avec 20 µL de paraformaldéhyde (PFA) pour obtenir une solution PFA de 2 % à 20 %. Maintenir la solution de fixation sur la glace avant et Pendant la dissection.
   ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
   NOTE : Mélanger 160 µL de milieu de culture cellulaire S2 avec 40 µL de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube PCR de 200 µL pour préparer une solution PFA de 4 % au lieu d’une solution de 2 % à 20 %.
2. Utiliser un tube PCR par génotype avec un maximum de 8-10 cerveaux par tube pour des résultats optimaux de coloration.
3. Préparer le cerveau adulte, solution de lavage : 0,5 % d’albumine sérique bovine, 0,5 % Triton X-100 dans du PBS.
   Remarque : Selon la coloration, une solution contenant 1 % Triton X-100 peut-être être nécessaires. Une concentration plus élevée de Triton X-100 augmente la pénétration de l’anticorps dans les tissus et il faut des régions de tache qui se trouvent à l’intérieur du tissu (par exemple, les régions synaptiques dans le cerveau adulte de la drosophile).
4. Préparer la solution de blocage : sérum de chèvre normal de 3 %, 3 % de sérum d’âne normal et 0,5 % Triton X-100 dans du PBS.
5. Le cerveau adulte solution et la solution de blocage de lavage peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
6. Mettre la plaque de verre pour le puits profond de la dépression sur la glace et remplir chaque bien avec les solutions suivantes : l’un avec l’éthanol à 70 %, l’un avec du PBS et un avec milieu de culture cellulaire S2.

4. Dissection de cerveau adulte

1. positionner un 3 cm plat de dissection sur la scène d’un stéréomicroscope et remplissez-le avec froid S2 un milieu de culture cellulaire. Effectuer toutes les dissections dans ce milieu pour s’assurer que le tissu reste sain pendant la procédure de dissection.
   Remarque : Utilisez un plat dissection bordé de plusieurs millimètres de silicone noir qui offre un bon fond contraste (dans les images) et préserver la pince pendant la dissection.
2. Anesthésier les mouches du génotype désiré en CO ₂.
3. Avec une pince, saisir à la volée par les ailes et lavez-le à l’éthanol 70 % froid pendant 30 s, puis avec du PBS froid pour 30 supplémentaires s.
4. Transférer la mouche dans la profonde dépression bien rempli avec un milieu de culture cellulaire S2.
5. Répétez la même procédure pour toutes les mouches du même génotype et maintenir au froid milieu de culture cellulaire S2 jusqu'à dissection, qui permettra de préserver le tissu.
   NOTE : Anesthésier seulement le nombre de mouches qui peut être disséqué en un laps de temps d’environ 30 min. de longs délais d’incubation dans un milieu de culture cellulaire S2 peut endommager les tissus.
6. Prenez la mouche avec une pince et, sous un stéréomicroscope, submerger la volée dans un milieu de culture cellulaire S2.
7. Détacher la tête du reste du corps. Jeter le corps et garder la tête immergée dans un milieu de culture cellulaire S2. Il est extrêmement important de tenir la tête avec une pince pour toute la durée de la dissection. Si la tête commence à flotter, il sera difficile de le récupérer sans agresser le tissu.
8. Commencer la dissection en tirant sur un œil, tout en tenant la tête avec une pince au moins une en tout temps. Assurez-vous que l’extrémité de la pince est juste en dessous de la rétine pour éviter d’endommager le tissu sous. Tirez sur l’autre oeil et commencer à retirer la cuticule jusqu'à ce que le cerveau semble.
9. Supprimer tous les tissus trachéal et cuticule autour du cerveau jusqu'à ce que le tissu semble propre. Veillez à enlever tous les tissus trachéale autour du cerveau pour des résultats optimaux de coloration ; les tissus sont maintenant prêtes à être fixées et colorées.
10. Maintenir tous les cerveaux disséqués en S2 froid milieu de culture de cellules avant de les transférer dans la solution PFA pour l’étape de la fixation du temps.

5. Coloration de cerveau adulte

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Transférer le cerveau isolé avec une pipette de P10 dans la solution de la PFA à température ambiante (RT). Pour éviter des lésions tissulaires, ne jamais utiliser forceps pour transférer le cerveau après la dissection. Effectuer toutes les étapes de 200 tubes PCR de µL sur un nutator.

Pour toutes les étapes, avant de jeter la vieille solution avec une pipette de P200, permettent le cerveau à se déposent au fond du tube. Essayez de supprimer le surnageant sans aspirer le tissu. Protéger le tissu contre l’exposition à la lumière.

Difficulté le cerveau dans 200 µL de 2 % PFA en milieu de culture cellulaire S2 pendant 1 h ou en 4 % PFA pendant 30 minutes. Garder le temps de fixation identique entre les échantillons afin d’augmenter la reproductibilité.

Après que 3 (ou plus) se lave de 15 minutes chacune, dans 200 µL de cerveau adulte lavage solution, bloquer les tissus avec 200 µL de solution de blocage pendant 30 minutes. Temps d’incubation plus longs en bloquant la solution sont possibles.

Incuber le cerveau pendant la nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires dilués dans le cerveau adulte, solution de lavage dans un volume total de 200 µL.
Remarque : Les temps d’incubation peuvent varier selon le type d’anticorps utilisé. Des incubations plus longues peuvent être nécessaires.

1. Pour l’étiquetage des trois marqueurs MCFO, incuber les cerveaux avec anti-HA (1/500), Anti-Flag (épitope DYKDDDDK) (1/100) et les anticorps primaires anti-V5.
2. Primaire directement conjugués anticorps pourraient être utilisés au lieu de la combinaison normale de primaire + secondaire (p. ex.., anti-549 V5:DyLight (1 : 200)). Dans ce cas, traiter l’anticorps conjugué directement comme anticorps secondaires.
   Remarque : Pour chaque génotype, garder quelques cerveaux comme des contrôles pour vérifier la spécificité de la coloration. Ignorez l’incubation de l’anticorps primaire et passez directement à l’étape suivante.

Laver les tissus 3 fois pendant 1 h à 200 µL de cerveau adulte solution (point 3.3) de lavage et les incuber avec secondaires fluorophore/primaires conjugués anticorps conjugués directement dilués dans le cerveau adulte, solution de lavage pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 4 h à la droite, dans un volume total de 200 µL
Remarque : exemples d’anticorps appropriés : AlexaFluor 488 (1/250), anti-549 V5:DyLight (1 : 200) et les DyLight 647 (1/100)-conjugués anticorps.

Laver le cerveau 3 fois pendant 1 h à 200 µL de cerveau adulte lavage solution, suivie d’un lavage final de 200 µL de PBS pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 1-2 h à RT ; l’étape de lavage final dans du PBS supprime toute trace de Triton X-100 et est nécessaire pour coloration des résultats optimaux. Monter le cerveau au milieu de montage avec un agent anti-fondu sur couvre-objet en verre.

6. Montage des cerveaux pour l’imagerie

1. Trim une imagerie entretoise à la taille appropriée à l’aide de ciseaux. Microscopie à haute résolution, le spécimen et imagerie spacer entre deux lamelles de verre sandwich.
   NOTE : L’imagerie entretoises sont mince (0,12 mm d’épaisseur) adhésifs entretoises qui peler et collent au verre couvre-objet ou microscope slides, permettant le montage des spécimens sans compression.
2. Using pince, retirer le papier adhésif d’un revêtement et appliquer l’espaceur, côté adhésif vers le bas, sur la surface d’une lamelle de verre (22 x 60 mm). Appliquer 10 µL de milieu de montage d’une lamelle de verre nouvel.
3. Avec un P10 pipette, transférer les cerveaux du tube 200 µL de la lamelle, à côté de la goutte de milieu de montage. Ainsi que les tissus, transférer certains PBS afin de maintenir le cerveau en solution.
4. Pipette avec un P10, déplacez le cerveau de la PBS la goutte de milieu de montage essayant de limiter la quantité de PBS. Transférer les échantillons en milieu de montage sur la lamelle couvre-objet avec l’entretoise d’imagerie. Utiliser suffisamment supports de montage pour couvrir le spécimen.
5. Supprimer l’autre revêtement adhésif de la face supérieure de l’entretoise et ajouter une lamelle de verre sur le dessus les spécimens. Avec la pointe d’un forceps, appliquer une légère pression sur la zone adhésive pour sceller. Les tissus montés l’image immédiatement ou stocker les lames à-20 ° C pour une analyse ultérieure.

7. Acquisition d’images

1. piles d’acquérir des images confocal fluorescence à l’aide d’un microscope confocal avec un 40 X (NA = 1.2, immersion dans l’eau) objectif ou 63 X (NA = 1,4, immersion dans l’huile) objectif (tailles pixel = 1 024 x 1 024 dans le plan xy ; Distance entre deux sections confocale = 0,5 µm). Ajuster le gain du détecteur et l’offset pour chaque voie de telle sorte qu’aucun pixel saturé et valeurs nulles pixel sont présents dans les images ; Cela évite la perte d’informations et assure une utilisation de la plage dynamique complète du détecteur de.
   Remarque : Étant donné que l’imagerie 3D prend beaucoup de temps, les mesures peuvent être automatisés en analysant des échantillons multiples en parallèle à des endroits différents. Pour éviter l’évaporation avec l’objectif à immersion d’eau, utilisez une huile spéciale immersion moyenne avec indice de réfraction n = 1,33.
2. Traiter les piles confocal pour les projections de densité maximale, changements de teinte de canal et ajustement de la luminosité et de contraste à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse image standard (voir la Table des matières).

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Résultats

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la technique MCFO dans le cerveau adulte de la drosophile . La figure 3 montre une représentation schématique de la méthode. Trois marqués différemment membrane reporters (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-drapeau et myr-smGFP-V5) sous contrôle de l’UAS restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-F...

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple et efficace afin d’étudier la morphologie des différents types de cellules dans un tissu d’intérêt à haute résolution. Avec la technique MCFO, plusieurs reporters avec étiquettes d’épitope différents sont utilisés en combinaison pour multicolor étiquetage stochastique (Figure 2). Semblable à d’autres méthodes telles que Brainbow/Flybow^15,16,17<...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning