تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

Coralie Cazin; Aurelie Chiche; Han Li

doi:10.3791/56201

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

هنا نقدم بروتوكول مفصلاً للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية عند الإصابة أثناء حمل في فيفو إعادة برمجة. هذا الأسلوب مناسبة لتقييم دور الشيخوخة الخلوية أثناء تجديد الأنسجة وإعادة برمجة في فيفو.

Abstract

الشيخوخة الخلوية هو استجابة إجهاد التي تتميز بحملة اعتقال نمو خلوي مستقر، هو أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السرطان والشيخوخة. في الآونة الأخيرة، كما قد تورط الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها. ولذلك، أصبح متزايد الأهمية لتحديد الخلايا مسن في فيفو. التحليل المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن في الثقافة و في فيفوعلى حد سواء. ويستند هذا التحليل محتويات الليزوزومية زيادة في الخلايا مسن، الذي يتيح الكشف عن نشاط الليزوزومية β-جالاكتوسيداسي histochemical في سوبوبتيموم درجة الحموضة (6 أو 5.5). بالمقارنة مع فحوصات أخرى، مثل التدفق الخلوي، وهذا ما يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتهم المقيم، الذي يقدم معلومات قيمة مثل الموقع المتعلقة بهندسة الأنسجة، مورفولوجية، إمكانية اقتران مع علامات أخرى عبر إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). الحد الرئيسية للمقايسة سا-β-غال هو المطلب للعينات الطازجة أو المجمدة.

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لفهم الشيخوخة الخلوية كيف تشجع التجديد اللدونة والأنسجة الخلوية في فيفو. نحن نستخدم سا-β-غال للكشف عن خلايا مسن في العضلات الهيكلية عند الإصابة، ونظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة. وعلاوة على ذلك، يمكننا استخدام المدينة للكشف عن نانج، علامة على الخلايا الجذعية pluripotent، في طراز ماوس المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يتيح لنا لدراسة وتحديد الشيخوخة الخلوية في السياق اللدونة الخلوية المستحثة و في فيفو إعادة برمجة.

Introduction

الشيخوخة الخلوية شكل من إجهاد استجابة تتسم بحملة اعتقال دورة خلية مستقرة. في العقد الماضي، أثبتت البحوث اعتقادا راسخا أن الشيخوخة يرتبط مع مختلف العمليات البيولوجية والمرضية بما في ذلك التنمية الجنينية والتليف والكائن الشيخوخة¹^،². للمرة الأولى الشيخوخة الخلوية في الخلايا الليفية البشرية في نهاية حياتها replicative فجرتها telomere تقصير³. بالإضافة إلى الإجهاد ريبليكاتيفي، هناك الكثير من المحفزات الأخرى التي يمكن أن تسبب الشيخوخة، بما في ذلك الأضرار الحمض النووي والأكسدة وإشارات النمطان والتعديلات الجينية/ابيجينوميك، أي منها في نهاية المطاف تنشيط p53/p21 و/أو pRB المسارات إلى إنشاء وتعزيز اعتقال دائمة النمو¹. واحدة من الخصائص الهامة للخلايا مسن هو أنها تبقى أيضي نشطة وقوة التعبير عن المرتبطة بالشيخوخة افرازية النمط الظاهري (ساسب): إفراز من كثير من السيتوكينات الالتهابية، وعوامل النمو والمصفوفة خارج الخلية ⁴من العوامل. واقترحت العوامل ساسب تلعب دوراً مهما في التوسط وتضخيم أثر الشيخوخة، نظراً لما لها من آثار قوية على جذب الخلايا المناعية وتغيير النسيج وجهازيه الأوساط¹. من المثير للاهتمام، اقترحت مؤخرا الشيخوخة مهمة للأنسجة إصلاح وتجديد⁵^،⁶. وباﻹضافة إلى ذلك، اقترحت البيانات من مختبرات عدة، بما في ذلك بلدنا، أن الشيخوخة الناجمة عن تلف الأنسجة قد تعزز اللدونة الخلوية، عن طريق وفقا، لتعزيز التجديد⁷^–⁹. ولذلك، كافة البيانات الناشئة تسليط الضوء على أهمية دراسة الشيخوخة في الجسم الحي.

في حقبة ما بعد المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية)، هو اللدونة الخلوية قدرة خلية للحصول على هوية جديدة واعتماد مصير بديلة عند التعرض لمؤثرات مختلفة سواء في الثقافة و في فيفو¹⁰. ومن المعروف أن إعادة برمجة كاملة يمكن أن يتحقق في فيفو¹¹^،¹²، حيث التعبير عن الكاسيت الذي يحتوي على أربعة عوامل ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4، و ج-حركة (أوسكم) يمكن أن يكون المحرض في فيفو لتشجيع تشكيل تيراتوماس في الأجهزة متعددة. ولذلك، يمكن استخدام نموذج ماوس ريبروجرامابل (i4F) كنظام قوي لتحديد المنظمين الحرجة والمسارات التي تعتبر مهمة للهاتف الخلوي اللدونة¹¹.

نظام مناسب والحساسة في فيفو ضروري لفهم الشيخوخة الخلوية كيف ينظم اللدونة الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. نقدم هنا، نظام قوي وبروتوكول مفصلة لتقييم العلاقة بين الشيخوخة واللدونه الخلوية في سياق تجديد الأنسجة. تلف العضلات مزيج من كارديوتوكسين (CTX) التي يسببها في مجموعة العضلات الظنبوبي الأمامي (تا)، نظام راسخ لدراسة تجديد الأنسجة، ونموذج الماوس i4F، يتيح الكشف عن الشيخوخة الخلوية و في فيفو إعادة برمجة أثناء تجديد العضلات.

تقييم العلاقة بين اللدونة الخلوية والشيخوخة، أصيب مع CTX للحث على تلف العضلات الحاد الفئران i4F وتعامل مع الدوكسي (0.2 مغ/مل) أكثر من 7 أيام حمل في فيفو إعادة برمجة. في حين CTX الناجم عن تلف العضلات الحاد وتجديد البروتوكول قد نشرت مؤخرا¹³، لأسباب أخلاقية، سوف يحذف هذا الإجراء في البروتوكول الحالي. جمع عينات العضلات تا في 10 أيام بعد إصابة¹³في عند ذروة مسن الخلايا وقد لوحظ سابقا¹⁴. هنا، يصف هذا البروتوكول مفصلاً جميع الخطوات المطلوبة لتقييم مستوى الشيخوخة (عن طريق سا-β-غال) وإعادة برمجة (عن طريق تلطيخ المدينة من نانوج).

التحليل المرتبطة بالشيخوخة بيتا-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) هو التحليل الأكثر استخداماً للكشف عن خلايا مسن على حد سواء في الثقافة و في فيفو¹⁵. مقارنة بالاختبارات الأخرى، مقايسة سا-β-غال يسمح تحديد الخلايا مسن في بيئتها الأصلية مع هندسة الأنسجة سليمة، الذي يكتسي أهمية خاصة للدراسة في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن الزوجين المقايسة سا-β-غال مع علامات أخرى استخدام المدينة. ومع ذلك، تتطلب المقايسة سا-β-غال العينات الطازجة أو المجمدة، الذي يبقى قيداً رئيسيا. عندما الأنسجة الطازجة أو المجمدة متوفرة بشكل روتيني، مثل عينات العضلات تا المجمدة، سا-β-غال من الواضح أن التحليل الأكثر مناسبة للكشف عن خلايا مسن. نانج هي علامة تستخدم للكشف عن الخلايا ريبروجراميد لسببين: 1) علامة أساسية بلوريبوتينسي؛ 2) والأهم التعبير عن عدم تحركها الدوكسي (دوكس)، ولذلك يكشف المستحث بلوريبوتينسي بدلاً من التعبير القسري من كاسيت ياماناكا.

من المهم أن نلاحظ، البروتوكولات المصبوغة المعروضة في هذه الدراسة يمكن أن تجري بشكل منفصل تبسيط إجراء التقدير الكمي، ولكن يمكن أيضا أن يتم في إجراء المشترك المصبوغة لتصور كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في نفس القسم.

Protocol

تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية "الاتحاد الأوروبي"، ولجنة الأخلاقيات البروتوكولات معهد باستور (سيتا) وافق.

1-الأعمال التحضيرية "الحلول الأسهم"

إعداد المواد اللازمة لتثبيت عينة العضلات. حل 0.5 غ صمغ تراجاكانث مع المياه 20 مل في الرايت جعل المتوسطة تضمين تجميد لتثبيت العضلات.
إعداد الحلول لتلطيخ سا-β-غال-
1. إعداد المخزون الحلول ك ₃ Fe(CN) ₆ (100 ملم)، ك ₄ Fe(CN) ₆ (100 ملم)، مجكل ₂ (م 1) بإذابة مساحيق كل منهما في الماء المقطر.
2. إعداد الحل الأسهم من 0.2 ٪ ج ₂₀ ح ₆ ر ₄ غ ₂ س ₅ (ويوزين) باذابته في المياه-
3. إعداد حل الأسهم بركلنو ₆ ج ₁₄ ح ₁₅ (X-غال) (50 ملغم/مل) بإذابة مسحوق X-غال في ج ₃ ح ₇ لا (dimethylformamide، DMF).
4. "ك مخزن" ₃ Fe(CN) ₆ وحلول ₄ Fe(CN) ₆ ك في 4 درجات مئوية، و مجكل ₂ في الرايت
  ملاحظة: X-غال يمكن تخزينها في قاسمة في-20 درجة مئوية، تصل إلى 6 أشهر. يمكن الإبقاء على RT حل ويوزين واستخدامها بعد التصفية إذا لزم الأمر. ك ₃ Fe(CN) ₆ وحلول ₄ Fe(CN) ₆ كيلو من الضوء بروتيكتيدفرومثي. الحل العاشر-غال ليست مستقرة في المياه، ويجب أن تكون محمية من الضوء.
إعداد الحلول لتلطيخ نانج: الحل بيرميبيليزيشن يحتوي على 0.1% Na ₃ ج ₆ ح ₅ س ₇ (سترات صوديوم)، 0.1% C ₁₄ ح ₂₂ س (ج ₂ ح ₄ س) _n (n = 9-10) (Triton X-100) في الماء المقطر، التي يجب تخزينها في 4 ° C. إعداد عرقلة الحل الذي يحتوي على 5% مصل بقرى الجنين (FBS) في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، التي ينبغي أن تكون مخزنة في الرايت

2. ستينينج سا-β-غال في "تجميد قسم العضلات تا"

إعداد مواد التثبيت للعضلات تا عن طريق وضع كمية صغيرة من تراجاكانث الصمغ على قطعة من الفلين.
إصابة الفئران من كلا الجنسين (2 الشهر القديمة، C57/B6) أصيب قبل عشرة أيام مع كارديوتوكسين (CDX) كما هو موضح سابقا ¹³. استخدام غير مضرورة تا (برنامج تلفزيوني حقن) من الماوس نفسه كعنصر سلبي. إذا كان المطلوب هو في فيفو إعادة برمجة، تعامل كل الماوس مع دوكس (1 ملغ/مل) في مياه الشرب في اليوم نفسه (محمية من الضوء)، الحق بعد إصابة CTX.
ملاحظة: الحل دوكس يحتاج إلى تغيير كل 3 أيام لمدة 7 أيام علاج التام.
1. عزل كلا العضلات تا (أصيب بجروح والتحكم) من الفئران كما هو موضح سابقا ( الشكل 1A) ¹³. لضمان مقاطع عرضية، إدراج وتر القاصي عضلة تا الصمغ tragacanth واترك جزء تقريبا ¾ عضلة خارج ( الشكل 1B) وتجميد مباشرة في نيتروجين سائل تبريد إيسوبينتاني عن < 1 الحد الأدنى
  ملاحظة: تأكد من العضلات تا في وضع عمودي وفي وسط الفلين. يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية، أو مباشرة كريوسيكتيونيد في 10 ميكرون المقاطع.
معالجة العضلات تا كما هو موضح في الشكل 1B.
1. توزيع 1 ^st-10 ^th المقاطع بالترتيب الصحيح على عشر شرائح مختلفة في الموضع الأيسر العلوي لكل شريحة. ضع الجزء ^ال 11 المجاورة إلى قسم ^ش 1 على الشريحة الأولى؛ وسيتابع الجزء ^ال 12 بنفس الترتيب لتوضع الحق إلى جانب القسم 2 ^nd على الشريحة الثانية. كرر هذه العملية حتى يتم الحصول على 10 أقسام/الشريحة للشرائح العشر (المقاطع 100 في المجموع) لضمان الحد الأدنى 1 مم المسافة بين المقطع الأول والمقطع الأخير-
إصلاح المقاطع لمدة 4 دقائق في برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 1% و 0.2 ٪ glutaraldehyde. يغسل مع برنامج تلفزيوني، 2 × 10 دقيقة. بعد ذلك، احتضان المقاطع في برنامج تلفزيوني (pH = 5.5) 30 دقيقة لتنفيذ كافة الخطوات في الرايت
ملاحظة: التثبيت يجب أن تكون خفيفة للمحافظة على النشاط الأنزيمي. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة. الرقم الهيدروجيني لبرنامج تلفزيوني أمر بالغ الأهمية ويجب حماية الحل X-غال من الضوء.
الأقسام إينكوباتي في احتواء حل غال س: 4 مم K3Fe(CN) ₆ مم 4 K4Fe(CN) ₆، 2 مم MgCl2 و 400 ميكروغرام/مل س-غال في برنامج تلفزيوني، pH = 5.5. احتضان في الظلام في 37 درجة مئوية على الأقل ليغسل 24 h. الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 3 × 10 دقيقة، في الرايت
ملاحظة: يتطلب حدا أدنى لمدة 24 ساعة الحضانة ويمكن أن تستمر لمدة 48 ساعة تكبير إشارة سا-β-غال. الحل يحتاج إلى تغيير بعد 24 ساعة حضانة. وينبغي حماية الشرائح من الضوء. إلا إذا كان المطلوب هو تلطيخ سا-β-غال، تابع مع الخطوة 2.5. إذا كان المطلوب هو تلطيخ يشترك مع نانج، الرجاء القفز إلى الأمام للخطوة 3.1.
الشرائح الإصلاح في 1% في برنامج تلفزيوني عن 30 دقيقة يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 3 × 10 دقيقة كونتيرستين مع ويوزين 0.2%. تزج الشرائح في الحل ثم لمدة 1 دقيقة وشطف لهم مع الماء المقطر بإيجاز. أخيرا، جبل الشرائح مع مائي متوسط التركيب غير الاستشعاع (انظر الجدول للمواد)-
ملاحظة: من الضروري إجراء التثبيت فيما بعد. تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة. يتم تنفيذ كافة الخطوات في الرايت

3. جسم نانج مكافحة استخدام إيمونوهيستوتشيميستري

إصلاح الشرائح مع برنامج تلفزيوني يتضمن بارافورمالدهيد 4% للغسيل 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني، 2 x 10 كحد أدنى إضافة 200 ميليلتر من محلول بيرميبيليزيشن مباشرة على الشرائح واحتضان لمدة 5 دقائق.
1. يغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني، 2 × 5 دقيقة وفي الغسيل الأخير، استخدام 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% جيش صرب البوسنة مباشرة على الشرائح. القيام بكافة هذه الخطوات في الرايت
  تنبيه: قم بإجراء خطوة التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-
إينكوباتي الشرائح مع جسم نانج مكافحة الأولية (التركيز النهائي: 1.25 ميكروغرام/مل) في ليلة وضحاها 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% FBS. تغسل شرائح مع برنامج تلفزيوني، 2 × 10 دقيقة وفي الغسيل الأخير، استخدام 200 ميليلتر برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.25% جيش صرب البوسنة لأدنى 5 إجراء غسل جميع الخطوات في الرايت
ملاحظة: احتضان الشرائح في مربع مع منشفة ورقية مبللة لمنع تبخر.
إينكوباتي مع 100 ميليلتر من جسم الثانوي rAb-برنامج الصحة الإنجابية من استعداد لاستخدام (انظر الجدول للمواد) للشرائح يغسل 45 دقيقة مع برنامج تلفزيوني، 3 x 5 دقيقة، إزالة الأجسام المضادة الثانوية. تنفيذ كافة الخطوات في الرايت مع الحماية من الضوء.
التصور
1. 3,3 '-ديامينوبينزيديني (ج ₁₂ ح ₁₄ ن ₄ ج ₁₂ ح ₁₈ Cl ₄ ن ₄ (₄ HCl)، الدأب) في المخزن المؤقت للركيزة قدمتها جاهز لاستخدام طقم (20 ميليلتر من الدأب على 1 مل من محلول المخزن المؤقت الركازة). إضافة 100 ميليلتر من محلول الدأب مباشرة على كل شريحة، واحتضان لمدة أقصاها 10 دقائق في الرايت
  ملاحظة: الحل الدأب المخفف ينبغي أن تعد طازجة ويمكن تخزينها لفترة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجات مئوية. فترة حضانة المرض يمكن تعديلها لتقليل الإشارات الخلفية ولكن يجب أن يبقى نفسه بالنسبة لكافة الشرائح.
2. إزالة الحل الدأب قبل الشطف بالماء. كونتيرستاين الشرائح مع حل سريع أحمر (جاهز لاستخدام، انظر الجدول للمواد) على 20 دقيقة يغسل الشرائح مع المياه مرة أخرى بإيجاز-
3. يذوي لهم مع الإيثانول 95% م 5تليها في الإيثانول 100 ٪، 2 × 5 دقيقة. أخيرا، جبل الشرائح مع تصلب سريعة التركيب المتوسطة (انظر الجدول للمواد)-
4. مراقبة الشرائح تحت المجهر في الميدان مشرق على 20 X لتجنب الخلفية.
  ملاحظة: حل سريع الأحمر يمكن الإبقاء على RT وإعادة استخدامها بعد تصفية.

4. التحليل والتقدير الكمي

SA-β-غال التقدير الكمي
1. مسح الشرائح واختيار الأقسام أفضل على كل شريحة استناداً إلى الصور المكتسبة. استخدام المقاطع على الأقل 2/تا للقياس الكمي. القاضي المقطع ' s الجودة استناداً إلى سلامة الأنسجة، نوعية تلطيخ، وكونتيرستينينج. للتحديد الكمي، اختر فرعين جودة أعلى مع أقصى مسافة ممكنة بين العينات، الذي يتيح تمثيلاً أفضل للقياس الكمي سا-β-غال في جميع أنحاء العضلات تا كله.
2. التقدير الكمي للخلايا إيجابية سا-β-غال ( الشكل 2).
  1. تحديد رتبة حجم بكسل عن طريق يدوياً تحديد أصغر وأكبر الخلايا سا-β-غال إيجابية.
    1. بفتح الصورة الرقمية للشريحة الممسوحة ضوئياً باستخدام برنامج إيماجيج-
    2. في الواجهة، انقر فوق ' تحليل ' > ' أدوات ' > ' دوروا مدير ' > ' تحليل ' > ' تعيين القياس ' > ' حدد منطقة '. استخدم أداة التحديد وتحيط أصغر وأكبر إيجابية سا-β-غال الخلية وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق النقر على ' إضافة '. قياس الأحجام تستخدم ' قياس ' زر وحفظ القيم لاستخدامها في وقت لاحق.
  2. ضبط المعلمة العتبة إلى تأكد من تحديد كافة الخلايا المرئية إيجابية.
    1. تحويل الصورة إلى تدرج الرمادي بواسطة النقر فوق ' صورة ' > ' نوع ' > ' 8 بت ' ( الشكل 2A). بعد ذلك، انتقل إلى ' الصورة ' > ' ضبط ' > ' عتبة '، حرك المؤشر الثاني حتى يتم تغطية كافة الخلايا سا-β-غال إيجابية باللون الأحمر ( الشكل 2)، ثم انقر فوق ' تطبيق '.
    2. تحليل الجزيئات بواسطة النقر فوق ' تحليل ' > ' "تحليل الجزيئات" ' > ' الحجم (بكسل ^ 2) '، وتطبيق القيمة المحددة في الخطوة 4.1.2.1، أدخل ' التدوير ': ' 0.00-1.00 '، انقر فوق ' طيب '؛ وملخص لكل ويرد الجسيمات التي تم جردها في إدارة العائد على الاستثمار ( الشكل 2D).
  3. نقل جميع الجسيمات المحدد للصورة الأصلية. ضبط التحديد يدوياً لضمان دقة القياس الكمي. إضافة خلايا إيجابية (السهم الأخضر، الشكل 2E) و/أو إزالة الخلايا إيجابية كاذبة (سهم أحمر، الشكل 2E). وأخيراً، قياس المنطقة التي تبين استخدام القسم ( الشكل 2D) ' أداة التحديد '. انقر فوق ' دوروا مدير ' > ' إضافة ' > ' قياس '.
  4. تطبيع عدد الخلايا إيجابية بمجال القسم الأهم من ذلك-
الكمي نانوج
1. عد الخلايا إيجابية نانوج تحت المجهر في الميدان مشرق يدوياً عند التكبير X 20-
  ملاحظة: كونتيرستاينينج حمراء سريعة يسمح التقييم الجيد مورفولوجية العضلات تا. ومع ذلك، تلطيخ خفيف جداً ويفتقر إلى مخطط واضح من المقطع. الماسح الضوئي غالباً ما يفشل لتحديد خط الحدود للمقاطع ولا تركز بشكل صحيح. فمن الممكن استخدام علامة لدائرة حواف المقاطع قبل المسح الضوئي أو استخدام ماسح ضوئي أكثر حساسية للكشف عن المقطع. للبروتوكول الحالي، الأكثر كفاءة عد الخلايا إيجابية نانج يدوياً.

النتائج

الكشف عن الشيخوخة الخلوية المستحثة بإصابة العضلات

وقد ثبت مؤخرا أن إصابة العضلات يدفع الشيخوخة الخلوية عابر¹⁴. في 10 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة)، تشهد غالبية ميوفيبيرس التالفة التجدد مع مركزي النوى، سمة مميزة لتجديد ميوفي...

Discussion

هنا، نحن نقدم وسيلة للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية من الفئران ريبروجرامابل. يمكن استخدام هذا الأسلوب تقييم وتقدير كلا الشيخوخة وحمل اللدونة الخلوية في فيفو، ودراسة دور الشيخوخة في إصلاح الأنسجة وتجديدها.

في البروتوكول الحالي، يتم استخدام ...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونحن مدينون إلى سيمبير كليمر لها الدعم التقني الممتاز. تم تمويل العمل في مختبر H.L. من معهد باستور، "المركز الوطني" "البحوث العلمية"، وفي الوكالة الوطنية للبحث (مختبر d'Excellence أحياء، دعفينير Investissement؛ ANR-10-LABX-73)، الوكالة الوطنية للبحث (ANR-16-CE13-0017-01) ومؤسسة قوس (بيا 20161205028). جيم وميلان تمول بدرجة الدكتوراه وزمالات ما بعد الدكتوراه من "الكونسورتيوم أحياء".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
K₃Fe(CN)₆	Sigma	13746-66-2	For SA-β Gal staining solution
K₄Fe(CN)₆	Sigma	14459-95-1	For SA-β Gal staining solution
MgCl₂	Sigma	7786-30-3	For SA-β Gal staining solution
X-Gal	Sigma	B4252	For SA-β Gal staining solution
Doxycycline	Sigma	D3447	For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin	Lotaxan Valence, France	L8102	For muscle injury
Glutaraldehyde	Sigma	111-30-8	For Fixation solution
Paraformaldehyde	Electron microscopy science	50-980-487	For Fixation solution
NaCitrate : Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre	Sigma	18996-35-5	For permeabilization solution
Triton	Sigma	93443	For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3608	Washing solution
Antibody anti- Nanog	Cell signalling	8822S	Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)	Dako	K4010	For Nanog revelation
Eosin 1%	Leica	380159EOF	Counterstainning
Fast red	Vector Laboratories	H-3403	Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount	Fisher scientific	9990402	Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt®	Sigma	25608-33-7	Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives	Olympus	CKX41	Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A	Abad et al., 2013	N/A	Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner	Zeiss	Axio Scan Z1	slides scanning

References

Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence?. Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128 pluripotent

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: