JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד על פגיעה תוך גרימת ויוו התכנות. שיטה זו מתאימה להעריך את התפקיד של הזדקנות ביולוגית הסלולר במהלך התחדשות רקמות, התכנות ויוו.

Abstract

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא תגובה מתח זה מאופיין על ידי מעצר צמיחה סלולרי יציב, וזה חשוב עבור תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון סרטן, הזדקנות. לאחרונה, הזדקנות ביולוגית גם היה מעורב רקמות תיקון והתחדשות. לכן, זה הפך קריטי יותר ויותר לזהות תאים senescent ויוו. הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל) assay הוא הבדיקה הנפוצה ביותר לזהות תאים senescent הן בתרבות והן ויוו. Assay הזה מבוסס על התכנים lysosomal מוגבר תאים senescent, מה שמאפשר זיהוי פתולוגיה lysosomal β-galactosidase פעילות ב- pH suboptimum (6 או 5.5). לעומת מבחני אחרים, כגון cytometry זרימה, זה מאפשר הזיהוי של תאים senescent בסביבתם תושב, המציע מידע בעל ערך כגון מיקום הנוגעים הארכיטקטורה רקמות, המורפולוגיה, ו האפשרות של צימוד עם סמנים אחרים באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC). המגבלה העיקרית של SA-β-גל וזמינותו היא הדרישה של דגימות טרי או קפוא.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מקדמת הסלולר פלסטיות ורקמות התחדשות בתוך vivo. אנו משתמשים SA-β-גל כדי לזהות תאים senescent בשריר השלד על פגיעה, אשר היא מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות. יתר על כן, אנו משתמשים IHC כדי לזהות Nanog, סמן של תאי גזע pluripotent, במודל של עכברים מהונדס. פרוטוקול זה מאפשר לנו לבחון ולכמת הזדקנות ביולוגית הסלולר בהקשר של פלסטיות הסלולר המושרה ואת ויוו התכנות.

Introduction

הזדקנות ביולוגית הסלולר היא צורה של התגובה לעקה מאופיין על ידי מעצר יציב של מחזור התא. בעשור האחרון, מחקר הקימה בחוזקה הזדקנות ביולוגית מזוהה עם תהליכים ביולוגיים ופתולוגיים שונים כולל התפתחות, פיברוזיס של האורגניזם בתהליך ההזדקנות1,2. הזדקנות ביולוגית הסלולר זוהה לראשונה ב fibroblasts האנושי בסוף על תוחלת החיים שלהם replicative המופעלות על-ידי טלומר קיצור3. מלבד הלחץ replicative, ישנם הרבה גירויים אחרים, זה יכול לגרום הזדקנות ביולוגית, כולל ה-DNA נזק, סטרס חמצוני, אותות oncogenic גנומית/epigenomic תיקונים קטנים, שכל אחד מהם יכול בסופו של דבר להפעיל המסלולים p53/p21 ו/או pRB כדי לבסס ולחזק את מעצרו של צמיחה קבוע1. אחד המאפיינים החשובים של תאים senescent הוא שהם נשארים פעילים סמויה ו robustly אקספרס (SASP) הזדקנות ביולוגית-הקשורים פנוטיפ הפרשה: הפרשת ציטוקינים דלקתיים רבים, גורמי גדילה ו מטריצה חוץ-תאית גורמים4. גורמים SASP הוצעו כדי לשחק תפקיד חשוב תיווכה ותגביר את אפקט הזדקנות ביולוגית, בגלל השפעתם חזק על משיכת תאים חיסוניים ושינוי המקומי ומערכתית רקמת milieus1. מעניין, הזדקנות ביולוגית הוצע לאחרונה להיות חשובה עבור רקמות תיקון והתחדשות5,6. בנוסף, נתונים מספר מעבדות, כולל שלנו, הציע כי רקמת נזק-induced הזדקנות ביולוגית יכול להגביר פלסטיות סלולרית, באמצעות SASPs, כדי לקדם התחדשות7–9. לכן, כל הנתונים המתעוררים להדגיש את החשיבות של לימוד הזדקנות ביולוגית בתוך vivo.

בעידן פוסט pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) פלסטיות הסלולר הוא הקיבולת של תא לרכוש זהות חדשה, לאמץ מגורל חלופי כאשר הם נחשפים לגירויים שונים ב- תרבות, אין ויוו10. זה ידוע כי התכנות מלאה יכולה להיות מושגת ויוו11,12, שבו הביטוי בקלטת המכיל ארבעה גורמים יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4ו- c-Myc (OSKM) יכול להיות מושרה ויוו לקדם היווצרות teratomas באיברים רבים. לכן, מודל העכבר reprogrammable (i4F) יכול לשמש מערכת חזקה כדי לזהות הרגולטורים קריטי מסלולים חשובים עבור הסלולר פלסטיות11.

מערכת מתאימה ורגיש ויוו הכרחי להבין איך הסלולר הזדקנות ביולוגית מסדיר פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. כאן, אנו מציגים מערכת איתנה, פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את הקשר בין הזדקנות ביולוגית פלסטיות הסלולר בהקשר של התחדשות רקמות. הנזק שריר שילוב של cardiotoxin (אקס) המושרה בקבוצה השריר השוקתי הקדמי (TA), מערכת מבוססת היטב ללמוד התחדשות רקמות, המודל העכבר i4F, מאפשר הזיהוי של הזדקנות ביולוגית הסלולר והן vivo התכנות במהלך התחדשות השרירים.

כדי להעריך את הקשר בין הסלולר פלסטיות הזדקנות ביולוגית, עכברים i4F נפגע עם אקס כדי לגרום לנזק חריפה הינם מטופלים עם דוקסיציקלין (0.2 מ"ג/מ"ל) במשך 7 ימים כדי לגרום ויוו התכנות. אמנם אקס המושרה לנזק חריפה התחדשות פרוטוקול כבר שפורסמו לאחרונה13, מסיבות מוסריות, הליך זה יושמט בפרוטוקול הנוכחי. TA שריר מדגמים ייאספו בגיל 10 ימים שלאחר פגיעה13, כאשר השיא של תאים senescent בעבר נצפו14. . הנה, פרוטוקול מפורט זה מתאר את כל הצעדים הדרושים כדי להעריך את רמת הזדקנות ביולוגית (דרך SA-β-גל) ואת התיכנות (דרך IHC צביעת של Nanog).

הזדקנות ביולוגית-הקשורים בטא-galactosidase (SA-β-גל) וזמינותו היא וזמינותו הנפוצות ביותר לזהות senescent התאים שניכם תרבות, אין ויוו15. לעומת מבחני אחרים, וזמינותו SA-β-גל מאפשר הזיהוי של התאים senescent בסביבה הטבעית שלהם האדריכלות רקמות ללא פגע, אשר חשוב במיוחד למחקר ויוו . יתר על כן, זה אפשרי זוג וזמינותו SA-β-גל עם סמנים אחרים באמצעות IHC. עם זאת, וזמינותו SA-β-גל לדרוש את דגימות טרי או קפוא, הנשאר מגבלה עיקרית. כאשר רקמות טרי או קפוא זמינות באופן שגרתי, כגון דגימות שריר ת א קפואים, SA-β-גל היא כמובן וזמינותו המתאימים ביותר כדי לזהות תאים senescent. Nanog הוא הסמן להשתמש כדי לזהות תאים reprogramed משתי סיבות: 1) זה סמן חיוני עבור pluripotency; 2) ויותר חשוב, הביטוי שלה לא מונעת על ידי דוקסיציקלין (dox), ולכן הוא מזהה pluripotency המושרה במקום הביטוי כפויה בקלטת יאמאנאקה.

חשוב לציין, הפרוטוקולים מכתימים שהוצגו במחקר זה יכול להתבצע בנפרד כדי לפשט את ההליך כמת, אך ניתן לבצע גם הליך שיתוף מכתימים כדי להמחיש את שניהם senescent, גזע pluripotent על אותו סעיף.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

חיות שטופלו לפי הנחיות הקהילה האירופית, ועדת האתיקה של הפרוטוקולים Institut Pasteur (CETEA) אישרה.

1. ההכנות של הפתרונות מניות

  1. להכין את החומרים לבניית השריר לדוגמה קיבוע. להמיס 0.5 ג'י tragacanth מסטיק עם 20 מ ל מים ב RT כדי להפוך המדיום הטבעה-הקפאה עבור שריר קיבעון.
  2. להכין את הפתרונות עבור צביעת SA-β-גל-
    1. להכין מלאי פתרונות של K 3 Fe(CN) 6 (100 מ מ), K 4 Fe(CN) 6 (100 מ מ), MgCl 2 (1 מ') על ידי המסת אבקות בהתאמה במים מזוקקים.
    2. להכין את הפתרון מניות של 0.2% C 20 H 6 Br 4 נה 2 O 5 (אאוזין) על-ידי לדלל אותה במים.
    3. להכין הפתרון מניות של C 14 H 15 BrClNO 6 (X-גל) (50 מ"ג/מ"ל) על ידי המסת אבקה X-גל ב- C 3 H 7 אין (dimethylformamide, DMF).
    4. K חנות 3 Fe(CN) 6 ו- K פתרונות 4 Fe(CN) 6-4 ° C, ו- MgCl 2-RT.
      הערה: X-גל ניתן לאחסן ב- aliquot ב-20 ° C, עד 6 חודשים. אאוזין הפתרון יכול להיות שמרו ב RT, לאחר סינון במידת הצורך. K-3-Fe(CN)-6 K 4 Fe(CN) 6 פתרונות protectedfromthe אור בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. X-גל פתרון אינו יציב במים והוא חייב להיות מוגן מפני האור.
  3. הכנה של הפתרונות Nanog מכתים: הפתרון permeabilization מכיל 0.1% נה 3 ג' 6 H 5 או 7 (ציטראט trisodium), 0.1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (טריטון X-100) במים מזוקקים, אשר צריך להיות מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס. להכין את הפתרון חסימה המכילה 5% סרום שור עוברית (FBS) בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), צריך להיות מאוחסן ב- RT.

2. Staining SA-β-גל בחלק שריר TA קפוא

  1. להכין החומר קיבוע עבור שריר ת א על ידי הנחת כמות קטנה של tragacanth מסטיק על חתיכת פקק.
  2. עכברים נפגע משני המינים (2 בן חודש, C57/B6) נפצעו 10 ימים לפני עם cardiotoxin (CDX) כפי שתואר לעיל 13. שימוש שאינו נפגע TA (הזרקת PBS) מן העכבר זהה של הפקד שלילי. אם אין ויוו התכנות רצוי, לטפל בכל עכבר עם Dox (1 מ"ג/מ"ל) במי השתייה באותו יום (מוגן מפני האור), מיד לאחר הפציעה אקס.
    הערה: הפתרון Dox צריך להיות שונה כל 3 ימים עבור משך הטיפול הכולל של 7 ימים.
    1. לבודד שני השרירים TA (נפגע ולשלוט) של עכברים כפי שתואר לעיל ( איור 1 א') 13. כדי להבטיח הסעיפים רוחבי, להכניס המסטיק tragacanth הגיד דיסטלי של שריר ת א ולא להשאיר בערך ¾ חלק השריר בחוץ ( איור 1B) ומקפיאים ישירות בחנקן נוזלי מקורר איזופנטאן עבור < 1 הגבלת
      הערה: ודא שלשריר ת א הוא מאונך, במרכז של הפקק. דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C, או ישירות cryosectioned בסעיפים 10 מיקרומטר.
  3. לעבד את השרירים TA כפי שמתואר על איור 1B.
    1. להפיץ 1 th st-10 סעיפים בסדר הנכון על גבי עשר שקופיות שונות במיקום השמאלי העליון של כל שקופית. למקם את המקטע th 11 סמוכים במקטע st 1 בשקופית הראשונה; בסעיף ה 12 יעברו באותו סדר למקם נכון חוץ בסעיף 2 nd על שקופית ראשונה. חזור על תהליך זה עד סעיפים 10/שקופית מתקבלים עבור שקופיות עשר (סעיפים 100 סה כ) כדי להבטיח מינימום 1 מ"מ המרחק בין החלק הראשון לבין המקטע האחרון.
  4. לתקן את הסעיפים במשך 4 דקות ב- PBS המכיל 1% paraformaldehyde ו- 0.2% גלוטראלדהיד. לשטוף עם PBS, 2 x 10 דקות. בשלב הבא, דגירה בסעיפים PBS (ה-pH = 5.5) במשך 30 דקות לבצע את כל השלבים ב RT.
    הערה: הקיבעון חייב להיות מתון כדי לשמור על פעילות אנזימטיות. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. ה-pH של מגניב הוא קריטי, הפתרון X-גל חייב להיות מוגן מפני האור.
  5. Incubate במקטעים המכילים X-גל פתרון: 4 מ מ K3Fe(CN) 6, 4 מ מ K4Fe(CN) 6, 2 מ מ MgCl2 ו 400 µg/mL X-גל ב- PBS, pH = 5.5. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 24h. לשטוף את השקופיות עם PBS, 3 x 10 דקות, ב- RT.
    הערה: הדגירה דורש מינימום של 24 שעות ביממה, יכול להימשך למשך 48 שעות על מנת למקסם את האות SA-β-גל. הפתרון צריך להיות שונה לאחר 24 שעות של דגירה. השקופיות צריכים להיות מוגנים מפני אור. אם רק מכתימה SA-β-גל היא הרצויה, המשך לשלב 2.5. אם צביעת במשותף עם Nanog רצוי, אנא דלג קדימה לשלב 3.1.
    6. Paraformaldehyde
  6. תיקון שקופיות 1% ב- PBS במשך 30 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 10 מינימלית Counterstain עם 0.2% אאוזין. לטבול את השקופיות הפתרון אאוזין עבור 1 דקות ולשטוף אותם עם מים מזוקקים בקצרה. לבסוף, לטעון את השקופיות מימית-שאינם-ואזוריט הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: זה חיוני לבצע את קיבוע שאחרי. לבצע שלב זה מתחת למכסה המנוע. כל הפעולות מבוצעות ב- RT.

3. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן Anti-Nanog

  1. לתקן את השקופיות עם PBS המכיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות לשטוף עם PBS, 2 x 10 דק להוסיף 200 µL של הפתרון permeabilization ישירות על השקופיות, תקופת דגירה של 5 דקות.
    1. שטיפת שקופיות עם PBS, 2 x 5 דקות, בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל 0.25% BSA ישירות על השקופיות. ביצוע כל הצעדים הללו-RT.
      התראה: בצע את שלב קיבוע מתחת למכסה המנוע.
  2. Incubate שקופיות עם נוגדן נגד ראשי-Nanog (ריכוז סופי: 1.25 ug/mL) לילה ב 4 ° C ב- PBS המכילה 5% FBS. שקופיות עם PBS, 2 x 10 דקות וקונטה בכביסה האחרונה, השימוש 200 µL PBS המכיל BSA 0.25% עבור 5 דק. בצע כל הכביסה מדרגות בכל RT.
    הערה: דגירה שקופיות בתוך קופסה עם מגבת נייר רטובה כדי למנוע אידוי.
    3. שקופיות
  3. Incubate עם µL 100 של נוגדנים משניים ראב-HRP מ מוכן לשימוש קיט (ראה טבלה של חומרים) במשך 45 דקות לשטוף שקופיות עם PBS, 3 x 5 דק ', כדי להסיר נוגדנים משניים. לבצע את כל השלבים ב RT עם הגנה מפני האור.
  4. ויזואליזציה
    1. תחילה, לדלל את 3,3 '-diaminobenzidine (ג 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), כי אמחה קלות) במאגר המצע מסופקים על ידי מוכן להשתמש ערכת (20 µL של DAB עבור 1 מ"ל של המצע בופר). להוסיף 100 µL של פתרון DAB ישירות על גבי כל שקופית ולאחר תקופת דגירה של לכל היותר 10 דקות ב- RT.
      הערה: הפתרון מדולל DAB צריך להיות מוכן טרי, ניתן לאחסן עד שבוע ב 4 º C. זמן הדגירה יכול להיות מותאם כדי למזער את האות רקע אבל חייב להישמר זהה עבור כל השקופיות.
    2. להסיר הפתרון DAB על ידי שטיפה עם מים. Counterstain השקופיות עם פתרון מהיר אדום (מוכן להשתמש, ראה את הטבלה של חומרים) במשך 20 דקות לשטוף את השקופיות עם מים שוב בקצרה.
    3. מייבשים אותם עם אתנול 95% עבור 5 מ'ואחריו 100% אתנול, 2 x 5 דקות. לבסוף, לטעון את השקופיות הקשחת מהיר הרכבה בינונית (ראה טבלה של חומרים).
    4. לצפות בשקופיות במיקרוסקופ בשדה בהיר בגיל 20 X כדי להימנע רקע.
      הערה: פתרון מהיר אדום יכול להיות שמרו ב RT ומשמש מחדש לאחר סינון.

4. ניתוח, כימות

  1. SA-β-גל כמת
    1. סרוק את השקופיות ובחרו הסעיפים הכי טוב בכל שקופית המבוסס על תמונות נרכשות. להשתמש לפחות 2 סעיפים/ת א עבור כימות. לשפוט את המקטע ' s איכות המבוססת על רקמות תקינות, איכות של צביעת, ו counterstaining. עבור כימות, לבחור בין שני המקטעים באיכות הגבוהה ביותר עם המרחק אפשרי המקסימלי בין דגימות, אשר מאפשר ייצוג טוב יותר של SA-β-גל כימות לאורך כל השריר TA-
    2. כימות של SA-β-גל חיובי תאים ( איור 2).
      1. לקבוע הדירוג של גודל פיקסל על-ידי בחירה ידנית הקטן ביותר, את התאים SA-β-גל חיובי הגדול.
        1. פתחו את התמונה הדיגיטלית של השקופית סריקה באמצעות תוכנת ImageJ.
        2. הממשק, לחץ על ' ניתוח ' > ' כלי ' > ' רועי מנהל ' > ' ניתוח ' > ' קבע מדידה ' > ' בחר אזור '. השתמש בכלי בחירה ולהקיף הקטן ביותר ואת הכי חיובי SA-β-גל תא ולהוסיף אותו למנהל רועי על ידי לחיצה על ' הוסף '. למדוד את גודל באמצעות ' מידה ' כפתור ולשמור את הערכים לשימוש מאוחר יותר.
      2. להתאים את הפרמטר סף כדי להבטיח כל התאים הגלויים חיובי נבחרו.
        1. להמיר התמונה סולם אפור על ידי לחיצה ' תמונות ' > ' סוג ' > ' 8 סיביות ' ( איור 2 א). בשלב הבא, ללכת ' תמונות ' > ' התאם ' > ' סף ', להזיז את הסמן השני עד כל התאים SA-β-גל חיובי מכוסים בצבע אדום ( איור 2B) ולאחר מכן לחץ ' החל '.
        2. ניתוח חלקיקים על-ידי לחיצה ' נתח ' > ' חלקיקים לנתח ' > ' גודל (פיקסל ^ 2) ', והחלת את הערך המוגדר בשלב 4.1.2.1, הזן ' מעגליות ': ' 0.00 1.00 ', לחץ על ' בסדר '; סיכום של כל מה חלקיקים שנספרו מוצג במנהל ROI ( איור דו-ממדי).
      3. להעביר את כל החלקיקים שנבחרו לתמונה המקורית. להתאים את הבחירה באופן ידני כדי להבטיח כימות מדויק. הוסף תאים חיוביים (חץ ירוק, איור 2E) ו/או להסיר תאים חיובי כוזב (חץ אדום, 2E איור). לבסוף, למדוד את השטח על ידי חלוקה לרמות באמצעות סעיף ( איור דו-ממדי) ' הכלי בחירה '. לחץ על ' רועי מנהל ' > ' הוסף ' > ' מידה '.
      4. חשוב, לנרמל את מספר התאים חיובי על-ידי האזור של המקטע.
  2. Nanog כמת
    1. לספור את התאים Nanog חיובי תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באופן ידני בהגדלה X 20-
      הערה: counterstaining מהר אדום מאפשר הערכה טובה של המורפולוגיה של שריר ת א. עם זאת, ההכתמה קלילה מאוד, חסר מתווה ברור של המקטע. הסורק לעיתים קרובות לא יצליח לזהות את הגבול של הסעיפים, לא יכול להתמקד כראוי. זה אפשרי להשתמש סמן בעיגול את הקצוות של הסעיפים לפני סריקה או להשתמש בסורק רגיש יותר לזהות את המקטע. עבור פרוטוקול הנוכחי, זה היעילה לספור את התאים חיובי Nanog באופן ידני.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

גילוי שריר הנוצרות על-ידי פגיעה הסלולר הזדקנות ביולוגית

זה לאחרונה הוכח כי פגיעה בשריר גורם הזדקנות ביולוגית הסלולר ארעי14. ב- 10 ימים לאחר פציעה (DPI), רוב myofibers פגום הם עוברים תהליך התחדשות עם גרעינים במיקום מרכזי, סימן היכר של רג?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לאתר את שניהם senescent, גזע pluripotent בשריר השלד של עכברים reprogrammable. ניתן להשתמש בשיטה זו להעריך לכמת בשני הזדקנות ביולוגית, זירוז פלסטיות הסלולר ויווושל לבחון את התפקיד של הזדקנות ביולוגית של רקמות תיקון והתחדשות.

בפרוטוקול הנוכחי, וזמינותו הזדקנות ביולו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgements

. אנחנו חבים Clemire Cimper לתמיכה טכנית מעולה שלה. העבודה במעבדה של מרגשת מומן על ידי מכון פסטר, מרכז לאומי pour la רשרש מדעי, ואת סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (d'Excellence Laboratoire Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), סוכנות הידיעות נאסיונאל דה לה רשרש (ANR-16-CE13-0017-01) ואת Fondation ארק (PJA 20161205028). . סיסי, איי. סי ממומנות על ידי Ph.d., פוסט דוקטורנטים מן האיחוד להחיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
K3Fe(CN)6Sigma13746-66-2For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6Sigma14459-95-1For SA-β Gal staining solution
MgCl2Sigma7786-30-3For SA-β Gal staining solution
X-GalSigmaB4252For SA-β Gal staining solution
DoxycyclineSigmaD3447For inducing in vivo reprogramming
CardiotoxinLotaxan Valence, FranceL8102For muscle injury
GlutaraldehydeSigma111-30-8For Fixation solution
ParaformaldehydeElectron microscopy science50-980-487For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		Sigma18996-35-5For permeabilization solution
TritonSigma93443For permeabilization solution
Bovine Serum AlbuminSigmaA3608Washing solution
Antibody anti- NanogCell signalling8822SRabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)DakoK4010For Nanog revelation
Eosin 1%Leica380159EOFCounterstainning
Fast redVector LaboratoriesH-3403Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-MountFisher scientific9990402Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt®Sigma25608-33-7Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectivesOlympusCKX41Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-AAbad et al., 2013N/AReprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide ScannerZeissAxio Scan Z1slides scanning

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528(2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128pluripotentreprogrammablecardiotoxingalactosidase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved