JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем подробный протокол обнаружения оба стареющей и плюрипотентных стволовых клеток в скелетных мышцах после травмы во время склонение в vivo перепрограммирования. Этот метод подходит для оценки роли клеточного старения во время регенерации тканей и перепрограммирования в естественных условиях.

Аннотация

Клеточного старения является стресс ответ, который характеризуется стабильной клеточного роста арест, который имеет важное значение для многих физиологических и патологических процессов, таких как рак и старения. Недавно старение также был вовлечен в ткани ремонт и регенерации. Таким образом становится все более важной для выявления стареющей клетки в естественных условиях. Пробирного связанные старения β-галактозидазы (SA-β-Gal) является наиболее широко используемым проба для выявления стареющей клетки в культуре и в естественных условиях. Этот assay основан на увеличение лизосомальных содержимое в стареющей клетки, что позволяет гистохимические обнаружение активности лизосомальных β-галактозидазы в suboptimum рН (6 или 5.5). По сравнению с другие анализы, например проточной цитометрии, это позволяет идентификации стареющей клеток в их среде резидентов, который предлагает ценную информацию, как местоположение, касающимся ткани архитектуры, морфология и возможность сопряжения с другими маркеры через иммуногистохимия (IHC). Основным ограничением SA-β-Гал пробирного является требование о свежих или замороженных образцов.

Здесь мы представляем подробный протокол понять как клеточного старения способствует клеточных тканей и пластичности регенерации в естественных условиях. Мы используем SA-β-Гал для обнаружения стареющей клетки в скелетных мышцах после травмы, которая является хорошо отлаженная система для изучения регенерации тканей. Кроме того мы используем IHC для обнаружения Nanog, маркер плюрипотентных стволовых клеток, в модели трансгенные мыши. Этот протокол позволяет нам изучить и количественной оценки клеточного старения в контексте индуцированных клеточных пластичности и в естественных условиях перепрограммирования.

Введение

Клеточного старения является формой реакции на стресс характеризуется стабильной цикла клетки ареста. В течение последнего десятилетия исследования твердо установлено, что старение связано с различных биологических и патологических процессов, включая эмбриональное развитие фиброза и организм старения1,2. Клеточного старения была впервые выявлена в фибробластов в конце их репликативной жизни, вызванные теломер, укорочение3. Помимо репликативной стресс существуют многие другие стимулы, которые могут вызвать старения, включая повреждения ДНК, оксидативный стресс, онкогенные сигналов и геномной/epigenomic изменения, любой из которых в конечном итоге может активировать p53/p21 или pRB пути к установить и укрепить постоянный рост арест1. Одна из важных характеристик стареющей клетки является, что они остаются метаболически активные и энергично выразить старение связанные секреторной фенотип (SASP): секрецию многих воспалительных цитокинов, факторы роста и внеклеточного матрикса 4факторы. SASP факторов было предложено играть важную роль в качестве посредника и усиливая эффект старения, из-за их мощных эффектов на привлечении иммунные клетки и изменяя местных и системных ткани кругах1. Интересно, что старение недавно предлагается иметь важное значение для ткани ремонт и восстановление5,6. Кроме того данные из нескольких лабораториях, в том числе наша, предложил, что старение-индуцированного повреждения ткани могут повысить сотовой пластичности, через SASPs, способствовать регенерации7–9. Таким образом все новые данные подчеркивают важность изучения старение в естественных условиях.

В эпоху пост индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) сотовой пластичность является способность ячейки для приобретения новой идентичности и принять альтернативные судьба при воздействии различных раздражителей в культуре и в естественных условиях10. Известно, что полного перепрограммирования может быть достигнуто в vivo11,12, где выражение кассеты, содержащий четыре Яманака факторов: Oct4, Sox2, Klf4и c-Myc (OSKM) может быть индуцированные в естественных условиях содействовать тератомы формирования в нескольких органов. Таким образом модель перепрограммируемые мыши (i4F) может использоваться как мощная система для выявления критических регуляторы и пути, которые важны для сотовых пластичности11.

Подходит и чувствительных в естественных условиях системы важно понять как клеточного старения регулирует сотовой пластичности в контексте регенерации тканей. Здесь мы представляем надежные системы и подробный протокол для оценки взаимосвязи между старение и клеточных пластичности в контексте регенерации тканей. Сочетание cardiotoxin (СТХ) индуцированного повреждения мышц в группе мышц передней Tibialis (TA), хорошо отлаженная система для изучения регенерации тканей и i4F модель мыши, позволяет обнаруживать сотовой старение и в естественных условиях Перепрограммирование во время регенерации мышц.

Чтобы оценить связь между сотовой пластичности и старения, i4F мышей с CTX побудить острые мышечные ущерб ранения и получавших доксициклин (0,2 мг/мл) более 7 дней навести в vivo перепрограммирования. В то время как CTX индуцированных повреждений острые мышечные и регенерации протокол был недавно опубликованный13, по этическим соображениям, эта процедура будет пропущен в текущем протоколе. ТА проб мышцы будут собраны на 10 дней поста травмы13, когда пик стареющей клетки ранее наблюдались14. Здесь этот подробный протокол описывает все шаги, необходимые для оценки уровня старения (через SA-β-Gal) и перепрограммирования (через IHC окрашивание Nanog).

Пробирного старение связанные бета галактозидазы (SA-β-Gal) является наиболее часто используемых проба для выявления стареющей клетки как в культуре и в vivo15. По сравнению с другими анализов, SA-β-Гал assay позволяет идентифицировать стареющей клетки в их родной среде с неповрежденной ткани архитектуры, которая имеет особенно важное значение для изучения в естественных условиях . Кроме того возможна пара пробирного SA-β-Гал с другими маркеры с помощью IHC. Однако SA-β-Гал assay требуют свежих или замороженных образцов, которая остается одним из основных ограничений. Когда свежие или замороженные ткани обычно доступны, такие как замороженные TA мышцы образцы, SA-β-Гал, очевидно, наиболее подходящим проба для выявления стареющей клетки. Nanog является маркер, используемый для определения reprogramed клетки по двум причинам: 1) это необходимым маркер для плюрипотентности; 2) более того ее выражение не управляется доксициклин (dox), поэтому он обнаруживает индуцированных плюрипотентности вместо принудительного выражение Яманака кассеты.

Важно отметить, пятная протоколы, представленные в этом исследовании может проводиться отдельно для упрощения процедуры количественной оценки, но также может быть сделано в совместно пятная процедуру визуализировать как стареющей и плюрипотентных стволовых клеток на том же разделе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

животных были обработаны согласно принципам Европейского сообщества и Комитет по этике Институт Пастера (CETEA) утвержденных протоколов.

1. Подготовка решений фондовой

  1. подготовить материалы для фиксации мышц образца. Растворяют камедь траганта с 20 мл воды на RT для встраивания замораживание среднего для фиксации мышц 0,5 г.
  2. Подготовить решения для окрашивания SA-β-Гал.
    1. Подготовить акций решения K 3 Fe(CN) 6 (100 мм), K 4 Fe(CN) 6 (100 мм), MgCl 2 (1 M), растворяя соответствующих порошков в дистиллированной воде.
    2. Подготовить раствор 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (эозина) путем разбавления в воде.
    3. Подготовить Стоковый раствор С 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 мг/мл) путем растворения порошка X-гал в C 3 H 7 нет (диметилформамид, DMF).
    4. Магазин K 3 Fe(CN) 6 K 4 Fe(CN) 6 решений и на 4 ° C и 2 MgCl на RT.
      Примечание: X-Гал может храниться в Алиготе при-20 ° C, до 6 месяцев. Раствор эозина может храниться на RT и повторно после фильтрации при необходимости. K 3 Fe(CN) 6 и K 4 Fe(CN) 6 решения являются protectedfromthe свет. X-Гал решение не является стабильным в воде и должна быть защищена от света.
  3. Приготовления растворов для окрашивания Nanog: permeabilization решение содержит 0.1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (цитрат натрия), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Тритон X-100) в дистиллированной воде, который следует хранить при 4 ° C. подготовить блокировки раствор, содержащий 5% плода бычьим сывороточным (ФБС) фосфат амортизированное saline (PBS), которые должны храниться на RT.

2. SA-β-Гал окрашивания на замороженных секции мышцы TA

  1. подготовить фиксации материал для мышц TA, поместив небольшое количество траганта резинки на кусочек пробки.
  2. Потерпевшего мышей обоих полов (2 месяца, C57/B6) получили ранения 10 дней с cardiotoxin (CDX) до, как описано ранее, 13. Используйте-ранения (PBS инъекций) та же мыши как отрицательный контроль. Если в естественных условиях перепрограммирования, лечить каждый мышь с Dox (1 мг/мл) в питьевой воде в тот же день (защищенный от света), сразу после травмы CTX.
    Примечание: Dox решение необходимо меняться каждые 3 дня всего лечения продолжительностью 7 дней.
    1. Изолировать обе мышцы TA (ранения и контроль) от мышей, как описано выше ( Рисунок 1A) 13. Для обеспечения поперечной разделы, вставьте камедь траганта дистального сухожилия мышцы TA и оставить примерно ¾ частью мышц вне ( рис. 1B) и заморозить непосредственно в жидком азоте охлаждением изопентана для < 1 мин
      Примечание: Убедитесь, что та мышца находится в перпендикулярном положении и в самом центре города Корк. Образцы можно хранить при-80 ° C или непосредственно cryosectioned в разделах 10 мкм.
  3. Обрабатывать TA мышцы, как описано в Рисунок 1B.
    1. Распределить 1 st -10 й секции в правильном порядке на десяти различных слайды в верхней левой позиции каждого слайда. Разместить рядом с разделе 1 st 11 й раздел на первом слайде; 12 th Секция будет следовать же порядке размещаться права помимо 2-й раздел на втором слайде. Повторите этот процесс до 10 разделов/слайд получаются для десяти слайдов (100 секций в общей сложности) обеспечить минимум 1 мм расстояние между Секцией первый и последний раздел.
  4. Исправить разделы для 4 мин в PBS, содержащих параформальдегида 1% и 0,2%-го раствора. Вымойте с PBS, 2 x 10 мин. Далее, инкубировать разделы в PBS (рН = 5,5) для 30 мин выполнить все шаги на RT.
    Примечание: Фиксация должна быть легкой для поддержания ферментативную активность. Выполните этот шаг под капотом. РН PBS является критической и X-Гал решения должны быть защищены от света.
  5. Разделы инкубировать в X-Гал раствор, содержащий: 4 мм K3Fe(CN) 6, 4 мм K4Fe(CN) 6, 2 мм MgCl2 и 400 мкг/мл X-гал в PBS, рН = 5,5. В темноте при 37 ° C не менее 24 ч. мыть инкубировать слайды с PBS, 3 x 10 мин, на RT.
    Примечание: Инкубации требуется минимум 24 часа и может длиться в течение 48 часов, чтобы максимизировать SA-β-Гал сигнала. Решение должно быть изменено после 24 часов инкубации. Слайды должны быть защищены от света. Если только SA-β-Гал окрашивание желательно, по-прежнему с шагом 2.5. Если совместно окрашивание с Nanog, пожалуйста перейти к шагу 3.1.
  6. Исправить слайды в 1% параформальдегида в PBS на 30 мин мыть слайды с PBS, 3 x 10 мин изображение с 0,2% эозина. Погружать слайды в раствор эозина за 1 мин и промойте их кратко дистиллированной водой. Наконец, монтировать слайды с водной среде флуоресцирующих монтажа (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Важно для выполнения после фиксации. Выполните этот шаг под капотом. Все действия выполняются на RT.

3. Иммуногистохимии с использованием антител анти-Nanog

  1. исправить слайды с PBS, содержащих параформальдегида 4% за 10 мин мыть с PBS, 2 x 10 минут добавить 200 мкл раствора permeabilization непосредственно на слайды и инкубировать в течение 5 мин.
    1. Мыть слайды с PBS, 2 x 5 мин и в прошлом мыть, использования 200 мкл PBS, содержащий 0,25% BSA прямо на слайдах. Выполнить все эти шаги на RT.
      Внимание: Выполнение шага фиксации под капотом.
  2. Инкубировать слайды с первичной анти Nanog антитела (конечная концентрация: 1,25 мкг/мл) на ночь при 4 ° C в PBS, содержащих 5% FBS. Вымойте слайды с PBS, 2 x 10 мин и в прошлом стирка, использования 200 мкл PBS, содержащий 0,25% BSA на 5 мин выполнять все мойки шагает на RT.
    Примечание: Инкубировать слайды в коробку с влажной салфеткой для предотвращения испарения.
  3. Инкубировать слайды с 100 мкл rAb ПХ вторичные антитела от готовой к использованию комплекта (см. Таблицу материалы) для 45 мин мыть слайды с PBS, 3 x 5 мин, чтобы удалить вторичное антитело. Выполните все шаги в RT с защитой от света.
  4. Визуализация
    1. во-первых, разбавить 3,3 '-Диаминобензидин (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) в буфере субстрата предоставляемые готовы использовать комплект (20 мкл DAB на 1 мл буферного раствора субстрата). 100 мкл КАПЛЮ раствора непосредственно на каждый слайд и инкубировать в течение максимум 10 мин на RT.
      Примечание: Разбавленный раствор DAB должен быть подготовлен свежезаваренным и может храниться до одной недели при 4 ° C. Время инкубации можно отрегулировать для минимизации фонового сигнала, но должны быть одинаковы для всех слайдов.
    2. Удаление решения DAB Ополоснуть водой. Counterstain слайды с быстро Красного раствора (готов использовать, см. Таблицу материалов) для 20 min. мыть слайды с водой снова кратко.
    3. Обезвоживает их с этанола 95% для 5 mв после 100% этанола, 2 x 5 мин. Наконец, монтировать слайды с быстрой закалки монтажа средней (см. Таблицу материалы).
    4. Наблюдать слайды под микроскопом в яркие области на 20 X, чтобы избежать фона.
      Примечание: Быстро красный раствор может быть сдержаны на RT и повторно использоваться после фильтрации.

4. Анализ и количественная оценка

    1. са β-Гал количественной сканирования слайдов и выбрать лучшие разделы на каждом слайде, основанный на полученных изображений. Используйте по крайней мере 2 секции/TA для количественной оценки. Судья секции ' s качество на основе ткани целостность, качество окрашивания и counterstaining. Для количественного определения, выберите две секции высокого качества с максимально возможное расстояние между образцы, который позволяет лучше представительства СА β-Гал количественной оценки на протяжении всей мышечной TA.
    2. Количественная оценка позитивных клеток SA-β-Gal ( Рисунок 2).
      1. Определить ранг размер пикселя, вручную выбрав наименьшее и крупнейший позитивные клетки SA-β-Гал.
        1. Открыть цифровое изображение отсканированного слайда с помощью программного обеспечения ImageJ.
        2. В интерфейсе, нажмите ' анализ ' > ' средства ' > ' ROI менеджер ' > ' анализ ' > ' задать измерение ' > ' выберите область '. Используйте инструмент «Выделение» и окружают маленьких и больших положительных SA-β-Гал ячейки и добавить его к диспетчеру ROI, нажав на ' добавить '. Измерить размеры с помощью ' меры ' и сохранить значения для последующего использования.
      2. Настроить параметр порога обеспечить выбраны все видимые ячейки позитивные.
        1. Преобразование изображения в оттенки серого, нажав ' изображение ' > ' типа ' > ' 8-бит ' ( рис. 2A). Далее, перейдите на ' изображение ' > ' Настройка ' > ' порог ', второй курсор до тех пор, пока все положительные SA-β-Гал клетки покрыты красным цветом ( рис. 2B), а затем нажмите ' применить '.
        2. Анализ частиц, нажав ' анализ ' > ' анализ частиц ' > ' Размер (пиксель ^ 2) ' и применить значение, определенное на шаге 4.1.2.1, введите ' цикличность ': ' 0,00-1,00 ', нажмите ' ОК '; резюме всех подсчитанный частиц показано в менеджере ROI ( Рисунок 2D).
      3. Передачи всех отдельных частиц в исходное изображение. Отрегулируйте выбор вручную, чтобы гарантировать точную количественную оценку. Добавьте положительных клеток (зеленая стрелка, Рисунок 2E) и/или удаления ложных положительных клеток (красная стрелка, Рисунок 2E). Наконец, измерить площадь путем изложения раздела ( Рисунок 2D) с использованием ' инструмент выделения '. Нажмите кнопку ' ROI менеджер ' > ' добавить ' > ' мера '.
      4. Главное, нормализует количество положительных клеток на площадь секции.
  2. Nanog количественной оценки
    1. граф Nanog позитивные клетки под микроскопом в светлые области вручную при 20-кратном.
      Примечание: Быстро красные counterstaining позволяет хорошие оценки морфологии TA мышцы. Однако окрашивание очень легкий и отсутствует четкое изложение секции. Сканер часто не удается определить границы участков и не может фокус правильно. Это позволяет использовать маркер обведите края разделов перед сканированием или использовать более чувствительных сканер для определения секции. Для текущего протокола, он является наиболее эффективным для подсчета Nanog позитивные клетки вручную.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Обнаружение мышечной травмы индуцированной клеточного старения

Недавно было продемонстрировано, что повреждения мышц побуждает переходных сотовой старение14. На 10 суток после травмы (DPI) большинство поврежденных myofibers прох...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы представляем метод для обнаружения оба стареющей и плюрипотентных стволовых клеток в скелетных мышцах перепрограммируемые мышей. Этот метод может использоваться для оценки и количественно обе старение и побудить сотовой пластичности в естественных условияхи изучить р?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы в долгу перед Clemire Cimper за ее отличную техническую поддержку. Работа в лаборатории H.L. финансировался Институтом Пастера, Национальный центр pour la Recherche научных и Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, практический будущее; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (АНР-16-CE13-0017-01) и Фонд дуги (PJA 20161205028). C.C. и A.C. финансируются кандидатских и докторской стипендии от возродить консорциума.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
K3Fe(CN)6Sigma13746-66-2For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6Sigma14459-95-1For SA-β Gal staining solution
MgCl2Sigma7786-30-3For SA-β Gal staining solution
X-GalSigmaB4252For SA-β Gal staining solution
DoxycyclineSigmaD3447For inducing in vivo reprogramming
CardiotoxinLotaxan Valence, FranceL8102For muscle injury
GlutaraldehydeSigma111-30-8For Fixation solution
ParaformaldehydeElectron microscopy science50-980-487For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		Sigma18996-35-5For permeabilization solution
TritonSigma93443For permeabilization solution
Bovine Serum AlbuminSigmaA3608Washing solution
Antibody anti- NanogCell signalling8822SRabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+)DakoK4010For Nanog revelation
Eosin 1%Leica380159EOFCounterstainning
Fast redVector LaboratoriesH-3403Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-MountFisher scientific9990402Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt®Sigma25608-33-7Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectivesOlympusCKX41Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-AAbad et al., 2013N/AReprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide ScannerZeissAxio Scan Z1slides scanning

Ссылки

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528(2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128cardiotoxin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены