JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عدم التطابق في الكريات البيض البشرية مستضد (هلا) تسلسل بين الهيئة المانحة والمتلقية أزواج هي السبب الرئيسي للرفض بوساطة الأضداد في زرع الأعضاء. نقدم هنا استخدام صفائف مستضد مخصصة تستند إلى هلا تسلسلات فرادى المانحين للتحقيق المضادة المانحين هلا اللوانتيبوديس في الجهاز المتلقين.

Abstract

في زرع الأعضاء، وظيفة وطول العمر للفساد خطيرة تعتمد على نجاح السيطرة على مفاعليه الرفض المناعية ضد مستضدات الكريات البيض البشرية (HLA). تستند المبادئ التوجيهية histocompatibility الاختبارات المعملية هلا مكافحة الحصانة، التي تقدم أما كالموجودة مسبقاً أو إنشاء حيثياته هلا الأجسام المضادة التي تشكل حاجزاً يحول دون زرع رئيسية. الاختبارات الحالية مبنية على منصة واحدة-مستضد خرز (SAB) باستخدام مجموعة ثابتة من المستضدات هلا المؤتلف المختارة ~ 100 للتحقيق الأمصال زرع. ومع ذلك، توجد في البشر مجموعة أكبر بكثير من أنواع هلا، مع لا اثنين من الأفراد عدا التوائم الذين يمكن أن تتقاسم نفس تركيبة من تسلسلات هلا. بينما التكنولوجيات المتقدمة لكتابة هلا ومباشرة يسلسل دقة التقاط أي عدم التطابق في تسلسل الحمض النووي بين المانحين وهلا المستلم، مقايسة صاب، نظراً لتنوع محدود في تسلسل التمثيل، غير قادر على الكشف عن الذات اللوانتيبوديس على وجه التحديد ضد عدم التطابق هلا الجهات المانحة. سعينا لتطوير طريقة تكميلية باستخدام تقنية مختلفة لكشف وتوصيف الأجسام المضادة هلا المضادة المانحين على أساس شخصي. أداة الفحص مجموعة ببتيد مخصصة من المانحين المستمدة من هلا تسلسلات لسبر سيرا بعد زرع جهاز المستلم لتقييم المخاطر لرفض جسم بوساطة. في صفيف مفرد لزوج مانح ومتلق واحد، ما يصل إلى 600 من الببتيدات فريدة من نوعها يتم على أساس تسلسل البروتين هلا الجهة المانحة، الببتيد كل حمل واحد على الأقل للمخلفات غير متطابقة في تسلسل الأحماض أمينية 15. في تجاربنا التجريبية لمقارنة أنماط مستضد للأمصال ما قبل وما بعد زرع الأعضاء على هذه المصفوفات، كنا قادرين على كشف الإشارات المضادة-هلا مع القرار أيضا تسمح لنا بتحديد [ابيتوبس] محصنة ضد المتورطين. وهذه شخصية صفائف مستضد تتيح كشف عالية الدقة الخاصة بالمانحين هلا [ابيتوبس] في زرع الأعضاء.

Introduction

الجهاز استبدال العلاج التي تتم بشكل روتيني عبر العالم قد أنقذ حياة الملايين. زرع الأعضاء الصلبة يحدث في المرضى حوالي 100 مليون نسمة في الولايات المتحدة سنوياً، بينما عدد أكبر لا تزال في ويتليستس لتلقي الهيئات المانحة بسبب نقص حاد في إمدادات (وفقا للمعلومات المقدمة من الهيئة المشتريات وزرع شبكة-اوبشن/الشبكة: optn.transplant.hrsa.gov). الغاية ينظم زرع الأعضاء بغية الحد من النفايات الجهاز وإنقاذ الأرواح، ولكن الأدوات العلمية المستخدمة لإعلام هذه الأنظمة محدودة الفعالية. على سبيل المثال، وتدرك الأوساط العلمية تماما الدول عالية متعددة الأشكال من جزيئات هلا ودقة الاختبارات الجينية للحمض النووي باستخدام كتابة الاستبانة، وتستند إلى تسلسل كتابة (السبط) قد وضعت في السنوات الأخيرة1، 2. بيد اللوانتيبودي طرق الاختبار لم قادرة على إنتاج تشكيلة واسعة من تسلسلات هلا الفردية كتحقيقات مستضد. يستخدم الاختبار القياسية في الوقت الحاضر فريق ثابت ~ 100 الاليلي المستضدات التي تتألف من المتغيرات الشائعة من هلا، ألف، باء وجيم, DQ, DP والدكتور تسلسل في المجموعات السكانية البشرية3،4،،من56. وكثيراً ما هلا تسلسلات الفعلية للمانحين غير مدرجة في لوحة الاختبار، مما اضطر زرع الأطباء والجراحين للاستدلال مفاعليه مانحة على حدة استناداً إلى أوجه التشابه المشتركة بين تسلسلات الفعلية للجهات المانحة والمقابلة "معايير" في اختبار تعيين7،8. ونتيجة لذلك، وأحيانا تحديا لجعل إجراء تقدير موثوق لمخاطر الرفض استناداً إلى جسم اختبار النتائج9،10،،من1112. ولذلك، جديدة شخصيا تجارب قابلة للتخصيص ل alloantibodies هي تشتد13،14.

ترميز الجينات هلا المستقبلات (MHC) histocompatibility الرئيسية المعقدة التي لها وظيفة رئيسية في الاستجابات المناعية6. هلا الجينات من المعروف أن جينات متعددة الأشكال الأكثر الجينوم البشري6. بسبب التقدم السريع في الحمض النووي تسلسل استراتيجيات للجينات هلا، المتغيرات الجينية الجديدة (أو يشار إليها ببساطة الآليلات) يجري اكتشافها في معدل متفجرة15،16. بحلول عام 2017 في آذار/مارس، أودع في إيمجت/هلا قاعدة البيانات (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html)، 16,755 الآليلات مصادق عليه من 12,351 التي كانت من فئة أنا وكانت 4,404 من الدرجة الثانية المجموعات. في تناقض صارخ، الآليلات متميزة إلا قليلاً ما يزيد على 100 ممثلة في مقايسة الخرز مستضد واحد قياسي (SAB)، التي تستخدم بشكل روتيني للكشف عن alloantibodies في زرع الأعضاء. الأسلوب صاب مبنية على منصة لوميناكس استخدام التدفق الخلوي. يمكن منذ المقايسة تستخدم مجموعة ثابتة من مولدات المضادات، وبصرف النظر عن التقلبات دفعة لدفعة طفيفة في الإنتاج، وتكون موحدة عبر الأفراد والمختبرات5قوة الاختبار antiserum. ولكن هذا الاختبار غير قادر على التقاط جميع اللوانتيبوديس وضعت على وجه التحديد ضد الآليلات المانحين، لا سيما عند تسلسل الجهات المانحة التي غائبة من الديوان تعيين. على الرغم من أن إنتاج مخصصة المستضدات الجهات المانحة استناداً إلى تسلسل صحيح المرغوب فيه، لا تزال هناك تحديات التقنية في ترشيد الإنتاج اللازمة وإجراءات الاختبار.

نحن مؤخرا وصف منهجية بديلة في إجراء دراسة جدوى لزرع الكلي مواضيع17. الأسلوب تستخدم مولدات الببتيد في صيغة صفيف لسبر ما قبل وما بعد زرع الأمصال لكل موضوع على حدة. كل مجموعة كانت مخصصة تم إنشاؤها باستخدام بقعة التوليف أسلوب18،19،20،21،22،23 التي تنتج المستضدات الببتيد، كل 15 الأحماض الأمينية في الطول، وتستند كلياً إلى هلا الآليلات الهيئة المعنية للمانحين أ، ب، ج، DQA1، DQB1 و DRB1. ويدار على غشاء السليولوز باستخدام معيار معتدلاً-الكيمياء22 توليف بقعة ويمكن أن تنتج مئات الببتيدات مخصصة بالتوازي مع19،نظام روبوتية مؤتمتة بالكامل21. يمكن أن تحمل الصفيف غشاء جولات متعددة من تجريد ودورات ريبروبينج. لدينا دراسة استعادية17، نحن الكشف عن التغييرات في أنماط مستضد مع أنتيسيرا زرع المخزن التي تم جمعها في سلسلة زمنية (أي، قبل وبعد زرع الأعضاء). هنا يصف لنا البروتوكول التقنية لسير العمل بما في ذلك تصميم مصفوفة، والصناعات التحويلية، antiserum السبر ونتيجة التحليل. الأسلوب المقصود للكشف عن alloantibodies ضد [ابيتوبس] خطية محددة على هلا الجزيئات زرع المانحين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "مجلس جامعة شمال غربي الاستعراض المؤسسي" (بروتوكول الاتحاد الدولي للرجبى #: STU00104680). سير العمل الإجمالي للبروتوكول ويتضح في الشكل 1-

1-تحليل بيوينفورماتيك للبلدان المانحة والمتلقية هلا متواليات

  1. استرداد تسلسل من قاعدة البيانات إيمجت/هلا 15.
    1. "هلا الحصول على" كتابة تقارير الهيئة المانحة والمتلقية صفحته/صفحتها.
      ملاحظة: تأكد من استخدام الإجراءات المناسبة لحماية سرية السجلات الطبية. عادة، مطلوب موافقة مجلس استعراض مؤسسي (IRB) على بروتوكول الدراسة أو الاختبار التجريبي كل المبادئ التوجيهية المؤسسية لمجلس الهجرة واللاجئين. إذا كانت التقارير هلا من القائم على بكر كتابة (من القرار أما عالية أو منخفضة) أو على أساس تسلسل كتابة (السبط)، انتقل مباشرة إلى الخطوة 1-1-3. إذا تم الحصول على تسلسل من تسلسل الجينوم/هلا، وإذا لم تكن كاملة، استخدم هذه التسلسلات مباشرة بدلاً من ذلك. في بعض الأحيان، عند كتابة فقط ناقصة أو تسلسل النتائج متوفرة، اتبع الخطوة الإضافية 1.1.2. لتعيين " مفقود " الآليلات عن طريق أداة ويب هو موضح في الخطوة 1.1.2.
    2. فتح تركيبات اليل غامضة بعد ويب ربط--http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html، والبحث باستخدام “ "غامضة اليل تركيبات أداة البحث" ” الدالة لاسترداد الآليلات افتراضية. بعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 1-1-3. لإدخال اسم اليل.
    3. فتح "نموذج الاستعلام" إيمجت/هلا اليل في ما يلي ارتباط ويب--http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html، وإدخال هذا الموضوع ’ s اليل أسماء (كل منها على حدة، كما هو مبين في الشكل 2) إلى “ البحث ل ” مربع. انقر فوق “ البحث عن الآليلات الآن ” زر. يجب استخدام أسماء اليل هلا نظم التسمية القياسية (أي، A * A * 01، A * 01:01:01:01، وأي من التسميات السابقة مثل A * 01010101).
    4. العثور على مطابقة اسم اليل المعروضة على الشاشة. انقر فوق الزر اليل.
    5. نسخة " تسلسل البروتين "، ثم لصقه في مستند نصي أسفل سطر رأس من " > اسم اليل ". فعلياً، نص المستند في شكل FASTA (سريعة-جميع) اسم اليل وتسلسل-
  2. أداء متعددة على أساس الجينات التحالفات من البلدان المانحة والمتلقية/المريض الآليلات. جين
    1. واحد (أي، DQB1 * 03:01:01:01) في كل مرة، نسخ ولصق كل الآليلات أربعة من التسلسلات FASTA المانحين والمريض (اثنان من الجهة المانحة) واثنين من المريض في مستند نص موحد. في هذه المرحلة، من المهم للدلالة على خلطات المانحة اليل الأسماء من أسماء اليل المريض (خيارات تشمل استخدام التفاضلية للأعلى مقابل انخفاض الحالات؛ أو إنشاء ملحق بادئة أو لاحقة مميزة لكل اسم اليل بمناسبة مقابل المانحين كل على حدة. الآليلات المريض). ترتيب التسلسل الإدخال ليس مهما لأنه بعد المحاذاة سوف تعديلاً بالترتيب وفقا لمستويات التشابه بين أي زوج من تسلسلات.
    2. نسخ ولصق تنسيق التسلسل في FASTA (كما يتضح في الشكل 3) من أعلاه إلى “ أدخل تسلسل الإدخال الخاص بك ” مربع على موقع "المجموعة أوميغا": http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
      3. انقر فوق
    3. في " يقدم عملك " استخدام الإعدادات القياسية للمعلمات: مثل " PROTEINŔ و " كلوستال ث/أرقام ". تنفيذ محاذاة عن طريق النقر على " إرسال ". يتم عرض محاذاة تسلسلات الأربعة على الشاشة ( الشكل 4).
  3. مارك الخاصة بالجهات المانحة عدم التطابق.
    ملاحظة: خصيصا تجدر أن متواليات الاليلي هنا مبنية على نتائج هلا كتابة، لا تسلسل. ولذلك، هناك خطر أن اختلاف تسلسل ذات الصلة في زوج مانح ومتلق معين قد تضيع. ستخف هذه المشكلة المحتملة كأكثر والمزيد من مراكز زرع اعتماد كتابة الاستبانة دقيقة ومباشرة تسلسل الحمض النووي.
    1. نسخ ولصق النص محاذاة إلى مستند نصي وإنشاء مستند جديد. إذا كان تنسيق الملف تمت محاذاته منزعجة، إصلاح التنسيق عن طريق تغيير نمط الخط والحجم: دائماً استخدام " Courier New " الخط في نوع صغير الحجم لتناسب الصفوف. حفظ المستند بعد حل مشاكل التنسيق.
    2. تفقد يدوياً في تسلسل تمت محاذاته تحديد جميع المخلفات غير متطابقة التي تنتمي فريد إلى الجهة المانحة. وضع علامة على كل من هذه المخلفات الخاصة بالمانحين باستخدام لون خط مميزة.
    3. تسطير كافة الأحرف في الجهة المانحة ' s التسلسلات الرقمية التي تمتد بقايا 14 حتى على حد سواء-والمتلقين للمعلومات من عدم التطابق الخاصة بالجهات المانحة ملحوظ (محسوبة ك 15 حمض أميني الببتيد ناقص 1 بقايا من عدم التطابق).
  4. اشتقاق 15-مير الببتيد تسلسل في سلسلة متداخلة.
    ملاحظة: سبب اختيار 15-مير الببتيدات يستند إلى المعرفة العامة من نموذجية [ابيتوبس] يجري الأحماض الأمينية 4-9 في الطول. ولذلك عندما قمنا بتطبيق " نافذة متحركة " الداخلي مع حجم خطوة 4 الأحماض الأمينية ( الشكل 1)، اختيارنا لمدة 15 من الأحماض الأمينية غادر 15-4 = 11 الأحماض الأمينية التداخل بين أي الببتيدات المجاورة في سلسلة. من الناحية النظرية، هذا التداخل 11 من الأحماض الأمينية كافية لتغطية جميع [ابيتوبس] محصنة من الأحماض الأمينية يصل إلى 9 في الطول، وحتى يكون لا حانمه عن غير قصد " تقسيم " في نصف مع فقط جزئية تسلسل في الصفيف.
    1. استخدام تسلسلات مسطر كقوالب لاشتقاق تسلسلياً قصيرة 15 تسلسل الأحماض الأمينية في سلسلة متراكبة بالمخلفات 4 بين أي تسلسلين المتاخمة مباشرة في السلسلة-
    2. نسخ ولصق هذه التسلسلات الأحماض الأمينية 15 في جدول بيانات في تنسيق عمود ( الشكل 5) مصحوبا بتدوين الأعمدة التي تتضمن الأسماء المطابقة من الآليلات المانحين. عمود إضافي لتشمل مراكز بقايا aa قد تكون مفيدة.
  5. كرر الخطوات من 1-1-3. 1.3. لكل اليل هلا (أي أ، ب، ج، DQA1، DQB1، DRB1 و DP) من الجهة المانحة وزوج المستفيدة لاشتقاق متواليات قصيرة aa 15 من الجهة المانحة-
  6. نسخ ولصق كافة الأعمدة في جدول بيانات رئيسي لإنشاء عمود مستمر منذ فترة طويلة لكل تسلسل 15 ألف من كل الآليلات من الجهة المانحة. كتابة إجمالي عدد الصفوف (بالنسبة لتسلسل الببتيد) في الوثيقة.

2. تصميم تخطيط مخصص الصفيف وإنتاج

callings
  1. إنشاء جدول بيانات من الببتيد تسلسل مع اليل المقابلة. الصفيف 20 الصفوف والأعمدة 30 ويتسع لما يصل إلى 20 × 30 = 600 البقع على الببتيدات. اعتماداً على العدد الإجمالي من الببتيدات المسجلة في الخطوة 1، 5 من إحدى الجهات المانحة خاصة، وعلى أساس تجربتنا الماضية مع اثنين من الأمثلة التي قد حاولنا في ليو وآخرون. 17، 600 الصفيف بقعة يمكن أن تعقد جميع التسلسلات المتولدة من حالات زرع منفصلة ~ 2.
    1. خطة عقلانية أكثر من هطريقة فيسينت لاحتواء مجموعات الببتيدات داخل صيغة الصفيف 600 بقعة.
    2. إذا كان أكثر من موضوع واحد يمكن أن تناسب مجموعة كاملة واحدة، قم بإدراج صفوف فارغة بعد أول مانح ' تسلسل s لتتناسب مع إجمالي عدد الصفوف التي يمكن أن يكون مقسوماً على 30 (عدد البقع في صف في المصفوفة).
    3. مباشرة بعد آخر صف فارغ لأول مجموعة من تسلسل، لصق في العمود بأكمله محتويات التسلسل من زرع الحالة الثانية-
    4. كرر هذه الخطوات حتى يتم تعبئة الصفيف وأية حالات أخرى يمكن أن تضاف دون تجاوز 600 البقع. إذا تركت صفوف فارغة بأكملها لملء في الجزء السفلي، " نقل " صف فارغ توضع بين مجموعات المانحين اثنين. يجعل هذا مساحة واسعة بين حالات قطع الغشاء بعد انتهاء تركيب أسهل-بعد الخطوة 3، 2. أدناه.
  2. البرنامج في تسلسل الببتيد في سياق تخطيط الصفيف. برنامج المزج بقعة يأخذ شكل نص تسلسل (تسلسل الببتيد واحدة صف واحد)، التي يمكن الحصول عليها مباشرة عن طريق حفظ جدول البيانات الناتجة من الخطوة 2.1.4 كمستند نصي بسيط (دون العمود (الأعمدة) إضافي لأسماء اليل، aa مواقف إلخ)-
    3. توليف
  3. التشغيل الآلي الببتيد المصفوفة عن طريق المزج بقعة. بالتفصيل العملية برمتها من التوليف في كوديثيبودي et al. 21. لاحظ أن يأخذ توليف معتدلاً من صفيفين ~ 4-5 أيام-

3. زرع المسبار وأنتيسيرا ريبروبي من سلسلة زمنية من الفرد المتلقي.

ملاحظة: يحتوي الصفيف غشاء 600 بقعة أبعاد ~ 7 سم × 13 سم. بعد التوليف، يمكن تخزين الصفيف في درجة حرارة الغرفة كالأغشية الجافة لمدة سنتين على الأقل سنوات عند محمية من الضوء المباشر. تجنب طي المفرط للغشاء للاحتفاظ طول العمر للاستخدام المتكرر-

  1. ترطيب الغشاء الصفيف مع الإيثانول ووضع تصور للبقع الببتيد ملطخة بونسياو س. مجموعة
    1. ترطيب الغشاء تحمل الببتيدات عقب إجراء تدريجي الأمثل في لي et al. 24-
      1. تزج الغشاء الصفيف في 20 مل إيثانول 100 ٪.
      2. إضافة 20 مل المقطر المياه تمييع الحل إلى الإيثانول 50% واحتضان في درجة حرارة الغرفة على 15 دقيقة
      3. تغيير الحل الغمر إلى 40 مل من الماء 100% ثلاث مرات واحتضان 15 دقيقة في كل مرة.
      4. المياه والصرف الصحي في مخزن عمل سليم، مثلاً، 20 مل تبسة (تريس مخزنة المالحة مع 0.1%)، ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل.
    2. بونسياو S تلطيخ الصفيف تصور الببتيدات الاصطناعية
      1. إضافة 20 مل من قبل صياغتها Ponceau S الحل مباشرة إلى الصفيف رطب واحتضانها ل ~ 30 s مع الهز.
      2. الماء المقطر تشغيل باستمرار خلال الغشاء إزالة وصمة عار الخلفية اللون S بونسياو. أثناء هذه العملية، الببتيد بقع من اللون الأحمر قد يصبح مرئياً.
      3. فصل أجزاء الصفيف لكل جهة مانحة بقطع بعناية بين فروع الصفيف للحالات الفردية. وضع علامة على التوجه لكل صفيف.
  2. كتلة قبل الصفيف. حل الحليب غير الدسم
    1. كتلة الغشاء في 20 مل من 5% في المخزن المؤقت تبست. هذا الحل على أساس الحليب سوف كذلك إزالة وصمة عار اللون S بونسياو. استبدال الحليب المخزن المؤقت عدة مرات بغية تحقيق أوضح الصور الببتيد.
    2. لأغراض مسك الدفاتر، التقاط صورة من صورة S بونسو الصفيف باستخدام كاميرا المحمولة باليد (على سبيل المثال في الشكل 6)-
    3. تواصل إعاقة من الغشاء في الحليب غير الدسم 5% في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو في درجة حرارة الغرفة ح 2 مع هزاز.
  3. إينكوباتي الصفيف مع زرع antiserum.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون لاحظت أن ظاهرة المعروفة باسم بروزوني أو تأثير هوك قد تنجم عن التدخل المعتمدة على تكملة في تحليل الأجسام المضادة في المصل. للتحايل على هذه المشكلة، يمكن اعتبار خطوة المعالجة المسبقة مصل اختياري مع المنظمة يدتا أو الحرارة من عينات المصل.
    1. إزالة المخزن المؤقت حظر ويغسل الغشاء مع 20 مل تبسة ثلاث مرات في اليوم التالي لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      2. الحليب في المخزن المؤقت تبسة
    2. إضافة 20 ميليلتر من المصل الخام المستلم إلى 20 مل من 2.5% واحتضان مع الغشاء ح 2-3 في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة من المستحسن في هذه الجولة الأولى من التحقيق، إلى أن يستخدم أولاً الماضي بعد زرع المصل (أو المصل المحتمل الأكثر وعي) في السلسلة الزمنية. ويستند هذا على افتراض أن تكون العينات السابقة في هذه السلسلة، ولا سيما من النقاط الزمنية قبل زرع، أقل مجموعة متنوعة من اللوانتيبوديس التي تميل إلى وضع على مر الزمن. وبهذه الطريقة، أي إمكانية تداخل الإشارات من " المرحل " بين السبر جولات يمكن التمييز بوضوح بين مفاعليه اللوانتيبودي المتقدمة حقاً سبب الاستجابات المناعية ضد الفساد.
  4. تغسل الصفيف باستخدام 20 مل تبسة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية-
    1. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.
    2. إينكوباتي مع الماعز الإنسان المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (الفجل البيروكسيديز) جسم الثانوية في إضعاف المضيفين في المخزن المؤقت تبسة تكملة مع حليب 1% لآخر 2 حاء
  5. المياه والصرف الصحي وتطوير وصمة عار.
    1. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع تبسة لمدة 10 دقائق في كل مرة.
    2. إجراء تعزيز تشيميلومينيسسينسي (القامة) باستخدام 5 مل من محلول لومينول طازجة مختلطة مع 5 مل من محلول بيروكسايد لتطوير الغشاء (ل 1 دقيقة)-
    3. إشارات "مسافنة تصور" استخدام تصوير مناسب (أي، نظم التصوير تشيميدوك أو C600 أزور).
  6. مسح وتحديد مقدار وصمة عار.
    1. حفظ الصور المتقدمة ( الشكل 7، صورة أقل)، والقيام بالتحديد الكمي لكثافة بقعة.

4. مقارنة مفاعليه Antiserum عبر سلسلة زمنية سريرية.

  1. تجريد الصفيف.
    1. في هذه النقطة، يبقى الغشاء الرطب في جميع الأوقات.
    2. قطاع الغشاء بحضانة مع 20 مل من المخزن المؤقت تجريد التجارية في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ومن ثم يغسل الغشاء مع تبسة ثلاث مرات لكل 10 دقائق. ثم كرر حظر (4.2) والسبر (الخطوة 4، 3) الخطوات باستخدام مصل مختلفة للمريض في نقطة زمنية مختلفة-
  2. كتلة جردت الغشاء.
    ملاحظة: بعد تجريد، يمكن إعادة استخدام الغشاء لجولة أخرى من التدقيق من المصل مختلفة من المريض نفسه في سلسلة زمنية.
    1. كتلة الغشاء باستخدام المخزن المؤقت للحليب 5% كما كان من قبل (راجع الخطوة رقم 3.2)-
  3. ريبروبي أنتيسيروم مختلفة من نفس السلسلة الزمنية (كرر الخطوات من 3، 3، 3-6؛ مثلاً في الشكل 7، الصورة العلوية).
    ملاحظة: تجريد الصفيف ثم استخدامها ريبروبي عينة مصل آخر. حيث يتم مترافق الببتيدات تساهمي للمصفوفة الداعمة للغشاء، أظهرنا أن الصفيف يمكن إعادة استخدامها ليصل إلى 20 طلقة من تجريد وريبروبينج دورات دون أن تفقد به perfoرمانسي-
  4. التخزين على المدى الطويل من الصفائف.
    1. تخزين الغشاء في المخزن المؤقت تبس تستكمل مع أزيد الصوديوم w/w 0.02% كحافظة. استخدام أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق للتخزين على المدى الطويل. في 4 درجات مئوية تحت حماية من الضوء المباشر، يمكن تخزين الغشاء الرطب لمدة سنتين على الأقل-

5. الحصول على البيانات والتحليل

  1. يدوياً إضافة تعليق توضيحي الببتيدات مستضد إيجابي.
    1. تحديد موقع بقع تظهر إشارات إيجابية الأجسام المضادة وتحديد كل من مواقعها في الشبكة-
    2. تمييز الصفوف المناظرة في ورقة العمل الرئيسية الببتيدات إيجابية.
  2. استرداد الببتيد تسلسل المدرجة في ورقة العمل الرئيسية ( الشكل 7، أسفل قائمة). وفقا لمبدأ التصميم المحددة في الخطوة 1.4.1.، البقع المسلسل المجاورة حصة متواليات متداخلة إلى حد كبير (15-4 = 11)، ولذلك يمكن تقاسمها رد الفعل [ابيتوبس] من الببتيدات في سلسلة متعاقبة.
    1. تسليط الضوء على أي النقاط الإيجابية التي تحدث في الخلافة.
  3. تحديد حانمه الحد الأدنى لطول كل الببتيد في سلسلة.
    1. تسليط الضوء على أي تسلسل حانمه المشتركة المحتملة استناداً إلى تداخل شرائح من الببتيدات المتفاعلة.
  4. النموذجي [ابيتوبس] مستضد هيكلياً.
    1. الحصول على نموذج هلا الكريستال هياكل من "مصرف بيانات البروتين" الذي عثر عليها في ما يلي رابط ويب: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do-
    2. عرض النموذج الأولى لهيكل هلا في بيمول (تنزيل من www.pymol.org).
    3. خريطة " أو نموذج اكتشف [ابيتوبس] المانحة المضادة للهياكل ثلاثية الأبعاد لجزيئات هلا أولى بتسليط الضوء على تسلسلات الببتيد رد الفعل ( الشكل 8). انقر فوق " عرض "، ثم " الأساسية "، وحدد " الأبيض ". لحفظ الصورة، انتقل إلى " ملف " و " "حفظ الصورة باسم" "، ثم حدد تنسيق الملف " بابوا غينيا الجديدة "-
  5. نتائج التقرير وتعيين رد الفعل [ابيتوبس] إلى الآليلات المقابلة.
  6. قارن صفيف النتائج إلى نتائج واحدة-مستضد الخرز (SAB)، إذا كانت متوفرة.
    ملاحظة: الاختبار الديوان باستخدام مولدات الاليلي واحد تدابير مفاعليه جسم نحو فريق ثابت من البروتينات هلا. الببتيدات الفردية التي تظهر الأجسام المضادة مفاعليه تنتمي إلى بعض الآليلات هلا تسمح، إذا أدرجت أيضا في لوحة صاب، مقارنة مباشرة بين المصفوفة ونتائج الديوان. وأظهرت لنا الدراسة السابقة 17 درجة عالية من الارتباط بين النتائج، مما يوحي بأن [ابيتوبس] هضميد يسهم إسهاما كبيرا في مفاعليه الشاملة للديوان وبالإضافة إلى ذلك، تكشف النتائج صفيف أيضا مستويات الأحماض الأمينية من خصوصية.
    1. الحصول على الديوان نتائج من مختبر هلا الذي يوفر معلومات حول ما إذا كان والاليلات المانحة التي هي رد الفعل ما بعد زرع الأمصال للمريض. النتائج من الخطوة 5.5. استناداً إلى الصفيف التحليل أيضا معلومات عن المقابلة الآليلات المانحة الإيجابية مفاعليه اللوانتيبودي.
    2. "صاب مقارنة" ومصفوفة النتائج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الدراسة الأصلية استخدام صفيف فحص أسلوب17، نحن المسجلين مجموع المواضيع زرع الكلي 5. حصلنا على هلا كتابة نتائج أعمالنا الأتراب والجهات المانحة ذات الصلة. تاريخهم الطبي والتتر الاليلي جسم من الاختبارات صاب كانت متاحة لنا أيضا. في هذه الدراسة التجريبية لهؤلاء...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تصميم الصفيف بقعة الموصوفة هنا للدراسة التجريبية لخصوصية اللوانتيبودي في زرع ضد المستضدات هلا مانحا الجهاز. على النقيض من مقايسة صاب القائمة المستخدمة على نطاق واسع في العيادة، لديه أسلوب صفيف مستضد ميزة كبيرة في التصميم المرنة التي يمكن أن تستوعب تسلسلات هلا الحقيقية للجهات المانحة ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وأعلن لا تضارب المصالح.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور شون لي ولي شينغ من جامعة ويسترن في كندا على مساعدتهم الطيبة مع بقعة صفيف الإنتاج. ونحن ممتنون للموظفين في "صلب هيستوكومباتيبيليتي" وفي جامعة "شاملة زرع مركز من شمال غرب" لتوفير خدمات عينة. تم دعم هذا العمل جزئيا "المجلس مساعدة من المستشفى التذكاري شمال غربي البلاد"، وصندوقا لبدء تشغيل كلية المقدمة من جامعة نورث وسترن لشئون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Peptide arrayINTAVIS Bioanalytical Instruments
EthanolSigma-AldrichE7023
Ponceau S solutionSigma-AldrichP7170
Non-fat milkBio Rad Laboratories1706404
TBSTSanta Cruz Biotechnology10711454001
Goat anti-human IgG–HRP ThermoFisher ScientificA18811
Clarity Western ECL SubstrateBio Rad Laboratories1705061
Restore Western Blot Stripping BufferThermo Scientifics21059
ChemiDoc gel imaging systemBio Rad Laboratories1708265 

References

  1. Bradshaw, R. A., Dunn, P. P. Unambiguous high resolution genotyping of human leukocyte antigens. J Immunol Methods. , (2017).
  2. Robinson, J., Halliwell, J. A., McWilliam, H., Lopez, R., Marsh, S. G. IPD--the Immuno Polymorphism Database. Nucleic Acids Res. 41, D1234-D1240 (2013).
  3. Tait, B. D. Solid phase assays for HLA antibody detection in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 21 (5), 573-577 (2009).
  4. Tait, B. D. Detection of HLA Antibodies in Organ Transplant Recipients - Triumphs and Challenges of the Solid Phase Bead Assay. Front Immunol. 7, 570(2016).
  5. Gebel, H. M., Bray, R. A. HLA antibody detection with solid phase assays: great expectations or expectations too great? Am J Transplant. 14 (9), 1964-1975 (2014).
  6. Horton, R., et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 5 (12), 889-899 (2004).
  7. Duquesnoy, R. J. HLAMatchmaker: a molecularly based algorithm for histocompatibility determination I. Description of the algorithm. Hum Immunol. 63 (5), 339-352 (2002).
  8. Duquesnoy, R. J., Marrari, M. HLAMatchmaker-based definition of structural human leukocyte antigen epitopes detected by alloantibodies. Curr Opin Organ Transplant. 14 (4), 403-409 (2009).
  9. Wedel, J., Bruneau, S., Kochupurakkal, N., Boneschansker, L., Briscoe, D. M. Chronic allograft rejection: a fresh look. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 13-20 (2015).
  10. Rostaing, L. P., Malvezzi, P. HLA-Incompatible Kidney Transplantation--Worth the Risk? N Engl J Med. 374 (10), 982-984 (2016).
  11. Gebel, H. M., Bray, R. A., Nickerson, P. Pre-transplant assessment of donor-reactive, HLA-specific antibodies in renal transplantation: contraindication vs. risk. Am J Transplant. 3 (12), 1488-1500 (2003).
  12. Haas, M. An updated Banff schema for diagnosis of antibody-mediated rejection in renal allografts. Curr Opin Organ Transplant. 19 (3), 315-322 (2014).
  13. Cecka, J. M., Reed, E. F., Zachary, A. A. HLA high-resolution typing for sensitized patients: a solution in search of a problem? Am J Transplant. 15 (4), 855-856 (2015).
  14. Tambur, A. R., Claas, F. H. HLA epitopes as viewed by antibodies: what is it all about? Am J Transplant. 15 (5), 1148-1154 (2015).
  15. Robinson, J., et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases. Nucleic Acids Res. 43, D423-D431 (2015).
  16. Gabriel, C., et al. HLA typing by next-generation sequencing - getting closer to reality. Tissue Antigens. 83 (2), 65-75 (2014).
  17. Liu, P., et al. A Novel Method for Anti-HLA Antibody Detection Using Personalized Peptide Arrays. Transplant Direct. 2 (11), (2016).
  18. Frank, R., Overwin, H. SPOT synthesis. Epitope analysis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol Biol. 66, 149-169 (1996).
  19. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  20. Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays. J Vis Exp. (93), (2014).
  21. Kudithipudi, S., Kusevic, D., Weirich, S., Jeltsch, A. Specificity analysis of protein lysine methyltransferases using SPOT peptide arrays. J Vis Exp. (93), e52203(2014).
  22. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat Protoc. 2 (6), 1333-1349 (2007).
  23. McBride, R., Head, S. R., Ordoukhanian, P., Law, M. Low-Cost Peptide Microarrays for Mapping Continuous Antibody Epitopes. Methods Mol Biol. 1352, 67-83 (2016).
  24. Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol Biol. 570, 67-76 (2009).
  25. Kaczmarek, I., et al. Donor-specific HLA alloantibodies: long-term impact on cardiac allograft vasculopathy and mortality after heart transplant. Exp Clin Transplant. 6 (3), 229-235 (2008).
  26. Claas, F. H. Clinical relevance of circulating donor-specific HLA antibodies. Curr Opin Organ Transplant. 15 (4), 462-466 (2010).
  27. Brown, N. K., Kheradmand, T., Wang, J., Marino, S. R. Identification and characterization of novel HLA alleles: Utility of next-generation sequencing methods. Hum Immunol. 77 (4), 313-316 (2016).
  28. Cino, E. A., Choy, W. Y., Karttunen, M. Conformational Biases of Linear Motifs. Journal of Physical Chemistry B. 117 (50), 15943-15957 (2013).
  29. Duquesnoy, R. J. Human leukocyte antigen epitope antigenicity and immunogenicity. Curr Opin Organ Transplant. 19 (4), 428-435 (2014).
  30. Lavinder, J. J., et al. Identification and characterization of the constituent human serum antibodies elicited by vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2259-2264 (2014).
  31. Kloetzel, P. M. Antigen processing by the proteasome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (3), 179-187 (2001).
  32. Filippone, E. J., Farber, J. L. The Humoral Theory of Transplantation: Epitope Analysis and the Pathogenicity of HLA Antibodies. J Immunol Res. 2016, 5197396(2016).
  33. Claas, F. H., Witvliet, M. D., Duquesnoy, R. J., Persijn, G. G., Doxiadis, I. I. The acceptable mismatch program as a fast tool for highly sensitized patients awaiting a cadaveric kidney transplantation: short waiting time and excellent graft outcome. Transplantation. 78 (2), 190-193 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

127 HLA Antigen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved