Персонализированные пептид массивы для обнаружения Alloantibodies HLA в трансплантации

Резюме

Несоответствия в человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) последовательности между органа доноров и получателей пары являются основной причиной антител опосредованной отторжения при трансплантации. Здесь мы представляем использование пользовательских антигена массивов, которые основаны на индивидуальных доноров HLA последовательности зондировать alloantibodies HLA анти доноров в орган получателей.

Аннотация

В трансплантации органов функции и долговечность трансплантат критически полагаются на успех управления иммунологические неприятие реактивностью против Человеческие лейкоцитарные антигены (HLA). Гистосовместимости руководящие принципы основаны на лабораторных испытаний анти HLA иммунитета, который представляет либо как существующие или de novo генерируется HLA антитела, которые представляют собой основные трансплантации барьер. Текущий тесты строятся на один антиген бусины (НКС) платформы, с помощью фиксированного набора ~ 100 предварительно рекомбинантных антигенов HLA зонда трансплантации сера. Однако в организме человека существует гораздо больше различных типов HLA, с не двух лиц за исключением однояйцевых близнецов, которые могут совместно использовать то же сочетание HLA последовательностей. В то время как передовые технологии для HLA набрав и сразу sequencing точно может захватить любые несоответствия в последовательности ДНК между донором и получателя HLA, SAB assay, благодаря его ограниченное разнообразие в последовательности представление, не может точно обнаружить alloantibodies специально против Хла несоответствия доноров. Мы стремились разработать дополнительный метод, используя различные технологии для обнаружения и характеризуют HLA антитела анти доноров на персональной основе. Средство проверки является массивом пользовательских пептидов доноров HLA-производные последовательностей для зондирования сыворотки после трансплантации органа получателя для оценки риска для антител опосредованной отказа. В одном массиве для одной пары донор реципиент до 600 уникальных пептиды принимаются на основании донора HLA белковых последовательностей, каждый пептид, проведение по крайней мере один из несовпадающие остатков в последовательности 15-амино кислоты. В наших экспериментальных экспериментов для сравнения антигена шаблоны для до и после трансплантации сывороток на эти массивы мы смогли обнаружить анти HLA сигналы с разрешением, что также позволило нам выявить иммунные epitopes участвующих. Эти персонализированные антигена массивы позволяют с высокой разрешающей способностью обнаружения доноров специфические epitopes HLA в трансплантации.

Введение

Заместительной терапии в орган, который регулярно проводится по всему миру позволила спасти миллионы человеческих жизней. Твердых трансплантации происходит в приблизительно 100 пациентов на миллион человек в США ежегодно, хотя большее число по-прежнему находятся на очереди для получения донорских органов из-за острой нехватки питания (согласно информации, представленной органом Закупки и трансплантации сети - OPTN/UNOS: optn.transplant.hrsa.gov). Трансплантации высоко регулируется с целью сокращения отходов органа и спасти жизни, но в эффективности ограничены научные инструменты, используемые для информирования этих правил. К примеру, научное сообщество полностью признает высоко полиморфный государства молекул HLA и точные генетические тесты ДНК с помощью разрешением ввод и ввод на основе последовательности (SBT) были разработаны в последние годы^{1, 2}. Однако, методы тестирования alloantibody пока не удалось производить огромное разнообразие индивидуальных последовательностей HLA как антиген зонды. Стандартный тест сегодня использует неизменный группа ~ 100 аллельные антигенов, которые состоят из общих вариантов HLA, A, B, C, DQ, DP и DR последовательностей в человеческие популяции^3,4,5,6. Часто, фактической доноров HLA последовательности не включаются в панели теста, заставляя трансплантации врачей и хирургов вывести доноров конкретных реактивности, основанные на общих сходство между фактической последовательности донора и соответствующих «стандарты» в тестовый набор^7,8. Следовательно иногда бывает сложно сделать надежную оценку неприятие риска на основе антител теста результаты^9,10,,1112. Таким образом, новые лично настраиваемые тесты для alloantibodies являются крайне необходимых^13,14.

HLA гены кодировать гистосовместимости комплекс (MHC) рецепторы, которые имеют ключевые функции в иммунных ответов⁶. Чтобы быть наиболее полиморфных генов в геноме человека⁶известны HLA гены. Из-за быстрого прогресса в ДНК секвенирования генов HLA, новые аллельные варианты стратегий (или просто называют аллели) в настоящее время обнаружены взрывные темпы¹⁵,¹⁶. По марта 2017 16,755 проверенных аллели был сдан в базе данных IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), из которых 12,351 были класса я и 4,404 были класса II групп. В противоположность только чуть более 100 различных аллелей представлены в assay Стандартный одноместный антиген бусины (НКС), который обычно используется для обнаружения alloantibodies в трансплантации. SAB метод построен на платформе Luminex, с помощью проточной цитометрии. Так как assay использует неизменный набор антигенов, помимо незначительных партии к партии вариативности в производстве, антисыворотка тест может быть энергично стандартизирована через отдельных лиц и через⁵лабораторий. Однако, этот тест не может захватить все alloantibodies разработаны специально против доноров аллелей, особенно при отсутствии последовательности доноров от САБ. Хотя пользовательские производства антигенов доноров на основе истинной последовательности желательны, остаются технические проблемы в рационализации необходимых производство и процедур тестирования.

Мы недавно описал альтернативной методологии в технико-пересадка почки субъектов¹⁷. Метод используется пептидные антигены в формате массива, который для зондирования до и после трансплантации сера отдельных субъектов. Каждый массив была специально построена с использованием местом синтеза метод^{18,19,20,21,22,23} , производит пептидные антигены, каждый 15 аминокислоты в длину, полностью основан на соответствующих органа доноров HLA аллелей a, B, C, DQA1, DQB1 и DRB1. ПЯТНО синтез эксплуатируется на мембрану целлюлозы с использованием стандартного Fmoc химия²² и может производить сотни пользовательских пептидов параллельно с полностью автоматизированной робототехническая система^19,21. Массив мембраны может выдержать несколько раундов зачистки и reprobing циклов. В нашем ретроспективное исследование¹⁷мы обнаружили изменения в структурах антигена с антисыворотками хранимых трансплантации, собранных в ряды (то есть, до и после трансплантации). Здесь мы описываем Технический протокол для рабочего процесса, включая массив дизайн, производство, антисыворотка зондирующего и результат анализа. Этот метод предназначен для обнаружения alloantibodies против конкретных линейных epitopes на молекулы HLA доноров трансплантации.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены Северо-Западного университета институциональных Наблюдательный Совет (IRB протокол #: STU00104680). Процесс общего протокола проиллюстрирован на рис. 1.

1. анализ Bioinformatic доноров и получателей HLA последовательности

1. извлекать последовательности из базы данных IMGT/HLA ¹⁵.
   1. Получить HLA набрав доклады органа доноров и его получателя.
      Примечание: Убедитесь, что используются надлежащие процедуры для защиты конфиденциальных медицинских записей. Как правило требуется утверждение институционального обзора Совет (IRB) протокол исследования или экспериментальные испытания за институциональные IRB руководящие принципы. Если HLA доклады на основе ПЦР типирование (высоким или низким резолюции) или на основе виртуализации ввода (SBT), перейдите к шагу 1.1.3. Если последовательности были получены из секвенирования геномных/HLA, и если они являются полными, используйте эти последовательности непосредственно, вместо этого. Иногда когда доступны только неполного ввода или последовательность результатов, выполните дополнительные шаг 1.1.2. Чтобы назначить " отсутствующих " аллели через веб-инструмент, описанный в шаге 1.1.2.
   2. Открыть неоднозначной комбинации аллелей, после веб ссылка - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html и поиск с использованием “ неоднозначной инструмент поиска комбинации аллелей ” функции для получения гипотетический аллелей. Затем перейдите к пункт 1.1.3. чтобы ввести имя аллеля.
   3. Откройте форму запроса IMGT/HLA аллелей на следующих веб-ссылку - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html и ввода тема ’ s аллеля имена (каждый индивидуально, как показано на рисунке 2) в “ Поиск для ” поле. Нажмите на “ Поиск аллели теперь ” кнопку. HLA аллелей имена следует использовать стандартные системы именования (то есть, A * A * 01, A * 01:01:01:01 и любые предыдущие обозначения как A * 01010101).
   4. Найти имя соответствующего аллеля, отображается на экране. Нажмите на кнопку аллеля.
   5. Копия " последовательности белка " и вставьте его в текстовый документ под строку заголовка " > аллеля имя ". Эффективно, текстовый документ находится в формате FASTA (FAST-All) аллеля имя и последовательности.
2. Выполнять на основе гена нескольких рядов доноров и получателей и пациентом аллелей.
   1. Один ген (т.е. DQB1 * 03:01:01:01) в то время, скопируйте и вставьте все четыре аллели донора и пациента FASTA последовательностей (два от донора) и два от пациента в комбинированных текстовый документ. На данный момент, это важно для дифференциально обозначения доноров аллеля имена от пациента аллеля имена (варианты включают дифференциального использование верхней против нижней случаях; или создать отличительный расширение префикса или суффикса к имени каждой аллеля отдельно пометить доноров против. пациент аллели). Порядок входных последовательностей не важен, потому что после выравнивания, порядок будет перетасовываются по уровням сходство между любой парой последовательностей.
   2. Копирование и вставка последовательности в FASTA формат (как видно на рисунке 3) сверху в “ введите ваш входной последовательности ” поле на веб-сайте кластера Омега: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
   3. Нажмите на " представить вашу работу " с помощью стандартных настроек параметров: такие, как " PROTEINŔ и " Clustal ж / номера ". Выполнить выравнивание, нажав на " отправить ". Выравнивание четырех последовательностей отображается на экране ( Рисунок 4).
3. Марк доноров конкретных рассогласований.
   Примечание: Следует особо отметить что аллельные последовательности, здесь были основаны на результатах HLA набрав, не виртуализации. Таким образом существует риск, что соответствующей последовательности вариации в конкретной паре доноров и получателей помощи могут быть пропущены. Эту потенциальную проблему будет смягчаться как больше и больше центров трансплантации принять точным разрешением ввода и прямого секвенирования ДНК.
   1. Копировать и вставить выравнивания текста в текстовом документе и создайте новый документ. Если формат файла соответствие нарушается, исправьте формат, изменив стиль шрифта и размер: всегда используйте " Courier New " шрифт в небольших тип размер по размеру строки. Сохраните документ после того, как решаются проблемы форматирования.
   2. Вручную проверять соответствие последовательности для определения всех несоответствующих остатков, которые однозначно относятся к донора. Марк каждого из этих конкретных доноров остатков с помощью отличительный цвет шрифта.
   3. Подчеркнуть все буквы в донора ' s последовательностей, которые расширяют 14 остатков оба вверх - и ниже по течению отмеченные несоответствия конкретных доноров (рассчитывается как 15 аминокислот пептидной минус 1 остатков несоответствия).
4. Получают 15-mer пептид последовательностей в серии перекрывающихся.
   Примечание: Причина для выбора 15-mer пептиды была основана на общие знания о типичных epitopes, будучи 4-9 аминокислот в длину. Поэтому, когда мы применили " скользящее окно " процедура с размером шаг 4 аминокислот ( рис. 1), наш выбор длины 15 аминокислот осталось 15-4 = 11 перекрываются аминокислоты в любой соседней пептидов в серии. В теории, это перекрытие 11 аминокислотных достаточно для покрытия всех иммунных epitopes до 9 аминокислот в длину, так что не epitope будет случайно " разделить " пополам с только частичные последовательности в массиве.
   1. Использовать подчеркнутые последовательности как шаблоны последовательно получить краткое 15 аминокислот в серии перекрывающихся по 4 остатков между любые две последовательности непосредственно в серии.
   2. , Копировать и вставить эти 15 аминокислот в таблицу ( рис. 5) в формате столбцов в сопровождении нотации столбцы, которые включают соответствующие имена доноров аллелей. Дополнительный столбец включить aa остатков позиции может быть полезным.
5. Повторите шаги от 1.1.3. 1.3. для каждой HLA аллелей (т.е. A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 и DP) стран-доноров и получателей пара для получения 15 aa коротких последовательностей донора.
6. Копирование и вставить все столбцы в таблицу мастер для создания длинный непрерывный столбец всех 15 aa последовательностей из всех аллели донора. Запишите общее количество строк (для последовательностей пептида) в документе,.

2. Дизайн макета пользовательского массива и производства

1. создать таблицу пептид последовательностей с соответствующего аллеля призвания. Массив имеет 30 столбцов и 20 строк и может вместить до 20 х 30 = 600 мест для пептидов. В зависимости от общего количества пептиды, записанная в 1,5 от одного конкретного донора и на основе нашего прошлого опыта с двумя примерами, которые мы пытались в Лю и др. ¹⁷ 600 пятно массив может содержать все последовательности, генерируемые ~ 2 отдельных трансплантации случаев.
   1. Рационально планировать наиболее eОперативная способ соответствовать наборы пептидов в пределах 600-пятно формат массива.
   2. Если более чем один предмет может поместиться в одном весь массив, вставка пустых строк после первого доноров ' s последовательности соответствует общее количество строк, которые можно разделить на 30 (количество мест в строке в массиве).
   3. Сразу же после последнюю пустую строку для первого набора последовательностей, вставьте весь столбец последовательности содержимого из второй случай пересадки.
   4. Повторить эти шаги до тех пор, пока массив заполняется и не больше случаев могут быть добавлены без превышения 600 мест. Если пустые строки целиком заполнить внизу, " двигаться " пустую строку, чтобы располагаться между наборами двух доноров. Это широкое пространство между случаями делает резки мембраны после завершения синтеза проще - после шаг 3.2. ниже.
2. Программа пептид последовательностей в контексте структуры массива. Программа SPOT синтезатор принимает текстовый формат последовательностей (одна строка один пептид последовательности), которые могут быть непосредственно получены путем сохранения результирующей таблицы из шага 2.1.4 как простой текстовый документ (без дополнительных столбцов для аллеля имена, aa позиции и т.д.).
Синтез
3. Запуск автоматизированных пептид массив через синтезатор пятно. Вся операция синтеза подробно в Kudithipudi et al. ²¹. Обратите внимание, что Fmoc синтез двух массивов ~ 4-5 дней.

3. Зонд и иммунные Reprobe от временных рядов индивидуума трансплантации получателя.

Примечание: 600-пятно мембраны массив имеет размеры ~ 7 см x 13 см. После синтеза массивы могут храниться при комнатной температуре как сухость оболочек для по крайней мере двух лет, когда защищены от прямого света. Избегайте чрезмерного складывания мембраны для сохранения ее долговечность для многократного использования.

1. Увлажняет мембраны массив с этанолом и визуализировать пептид пятна, окрашенных с Понсо S. Массив
   1. Регидратационный мембраны, перевозящих пептиды после поэтапная процедура оптимизированы в Li et al. ²⁴.
      1. погружают массив мембрану в 20 мл 100% этанола.
      2. Добавить 20 мл дистиллированной воды, чтобы разбавить раствор 50% этанола и инкубации при комнатной температуре 15 мин
      3. Изменить решение, погружение на 40 мл воды 100% три раза и инкубировать 15 мин каждый раз и.
      4. Мыть в надлежащей рабочей буфер, например, 20 мл TBST (Tris амортизированное saline с 0,1%), три раза за 5 мин.
   2. Понсо S пятнать массива для визуализации синтетических пептидов
      1. добавить 20 мл раствора предварительно разработанных Пуансо непосредственно в массиве гидратированных и проинкубируйте ~ 30 s встряхивании.
      2. Запуск дистиллированной воды постоянно над мембраной для исключения пятен фоновый цвет Пуансо. Во время процесса, пептид пятна красного цвета может стать видимыми.
      3. Отдельные части массива для каждого донора тщательно разрубом между разделами массива для отдельных случаев. Марк ориентации каждого массива.
2. До блока массива.
   1. Блок мембрану в 20 мл 5% обезжиренное молоко растворить в TBST буфер. Это решение на базе молока будет далее де пятно Пуансо цвет. Заменить молоко буфер несколько раз для получения ярких изображений пептид.
   2. Для целей учета, сделать снимок изображения Пуансо массива с помощью ручной камеры (например, на рис. 6).
   3. По-прежнему блокирует мембраны в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C на ночь или при комнатной температуре на 2 ч с качания.
3. Инкубировать массив с трансплантации антисыворотки.
   Примечание: Он должен быть отметил, что явление, известное как прозона или крюк эффект может быть результатом дополнение-зависимых от вмешательства в сыворотке антител анализа. Чтобы обойти эту проблему, предварительной обработки шаг необязательный сыворотки можно рассматривать с ЭДТА или тепловой инактивации образцов сыворотки.
   1. Удалить блокирующий буфер и промойте мембрану с 20 мл TBST три раза на следующий день для 5 минут каждый раз.
   2. Добавить 20 мкл сырой сыворотке крови получателя до 20 мл 2,5% молока в TBST буфер и инкубировать с мембраной для 2-3 ч при комнатной температуре. Обратите внимание, что в этот первоначальный раунд зондирование, рекомендуется сначала используется последний после трансплантации сыворотки (или вероятно наиболее сенсибилизированных сыворотки) временных рядов. Это основано на предположении, что ранее образцов в этой серии, особенно от момента времени до трансплантации, имеют менее разнообразных alloantibodies, которые имеют тенденцию развиваться с течением времени. Таким образом, любую возможность помех сигнала от " перенос " между зондирующего раундов может быть четко отличать от действительно развитые alloantibody реактивность вследствие иммунного ответа против трансплантата.
4. Мыть массив с помощью 20 мл TBST и инкубировать с вторичные антитела и.
   1. Мыть каждый раз мембраны три раза за 10 мин.
   2. Инкубировать с Коза античеловеческие IgG-ПХ (пероксидазы) Вторичное антитело на мэм разрежения в TBST буфер с 1% молока для еще 2 h.
5. Мыть и развивать блот.
   1. Мыть мембраны три раза с TBST 10 минут каждый раз.
   2. Выполнять усиленной хемилюминесценции (ЭСЛ) с 5 мл раствора luminol свежезаваренным смешанного с 5 мл раствора перекиси развивать мембраны (за 1 мин).
   3. Визуализировать ECL сигналов с помощью подходящего тепловизор (т.е., ChemiDoc систем обработки изображений или Azure C600).
6. Сканирования и количественно блот.
   1. Сохранить развитых изображения ( рис. 7, ниже изображения) и выполнять количественная оценка пятно интенсивности.

4. Сравнивать антисыворотка реактивности по клинической временных рядов.

1. Стрип массива.
   1. В этот момент, держите мембрану мокрой во все времена.
   2. Полосы мембраны при инкубации с 20 мл коммерческих зачистки буфера при 37 ° C в течение 20 минут и затем промойте мембрану с TBST три раза за 10 мин. Затем повторить блокировки (шаг 4.2) и проверки (шаг 4.3) шаги, с помощью различных сыворотке пациента, принятых в разное время точке.
2. Блок раздели мембраны.
   Примечание: После зачистки, мембрана может быть повторно использован для еще один раунд зондирующего различных сыворотки из той же пациентки в временных рядов.
   1. Блокировать мембраны, используя буфер молоко 5%, как раньше (см. шаг 3.2).
3. Reprobe различных антисыворотка из той же время серии (повторите шаги от 3,3-3,6; пример на рис. 7, верхнее изображение).
   Примечание: Раздели массив затем может использоваться для reprobe другого образца сыворотки. Так как пептиды ковалентно конъюгированных вспомогательную матрицу мембраны, мы показали, что массив может быть повторно использован для до 20 раундов зачистки и reprobing циклов без потери его performance.
4. Длительного хранения массивов.
   1. Магазин мембраны в буфере TBS дополнена азид 0,02% w/w натрия в качестве консерванта. Используйте запечатанный пластиковый пакет для долгосрочного хранения. При температуре 4 ° C под защита от прямого света, мокрой мембраны могут быть сохранены для по крайней мере 2 лет.

5. Сбора и анализа данных

1. вручную добавлять аннотации позитивные антигена пептиды.
   1. Найти пятна, показаны антитела положительных сигналов и определить каждый из их позиции сетки.
   2. Выделить соответствующие строки основного листа для положительных пептиды.
2. Получить пептидные последовательности, перечисленных в основной лист ( рис. 7, внизу списка). По словам принцип проектирования, изложенных в шаге 1.4.1., соседних серийный пятна доля значительно перекрытие последовательностей (15-4 = 11), поэтому реактивной epitopes может разделяться пептидов в серию последовательных.
   1. Выделить любые позитивные пятна, происходящих в преемственности.
3. Определить минимальные epitope длину для каждого пептида в серии.
   1. Выделить любой потенциально общей epitope последовательности на основе перекрывающихся сегментов реактивной пептидов.
4. Структурно модель epitopes антигена.
   1. Получить прототип HLA кристаллических структур из банка данных белков, найти на следующих Web-ссылку: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
   2. Отобразить прототип HLA структуры в Pymol (скачать с www.pymol.org).
   3. Карта " или модель обнаружил анти доноров epitopes в 3D структуры молекул HLA прототип, выделив реактивной пептид последовательности ( рис. 8). Нажмите на " экран ", затем " фон " и выберите " белый ". Чтобы сохранить изображение, перейдите на " файл " и " сохранить изображение как " и выберите формат файла " png ".
5. Результаты и назначить соответствующее аллели реактивной epitopes.
6. Сравнить массив результатов с результатами одного антиген бусины (НКС), если доступно.
   Примечание: SAB тест, с помощью единого аллельные антигены меры реактивности антитела к фиксированной группа HLA белков. Отдельные пептиды, которые показывают антитела реактивности принадлежат к определенным HLA аллелей, которые, если также включены в панели SAB, позволяют прямое сравнение между результатами САБ и массив. Наши предыдущие исследования ¹⁷ показали высокий уровень корреляции между результатами, предполагая, что пептид epitopes значительный вклад общей реактивности SAB. Кроме того массив результатов также выявить аминокислоты уровни специфичности.
   1. Получить SAB результаты из лаборатории для HLA который предоставляет сведения о том, следует ли и какие аллели доноров реагировать после пересадки сера пациента. Результаты от шага 5.5. на основе массива анализ также предоставляют информацию о соответствующих доноров аллели позитивный для реактивностью alloantibody.
   2. Сравнить САБ и массив результатов.

Результаты

В первоначальном исследовании, используя массив, скрининг метод¹⁷мы поступил в общей сложности 5 предметов трансплантации почек. Мы получили HLA набрав результаты нашей когорты и их соответствующих доноров. Их истории болезни и титры аллельные антитела от S...

Обсуждение

Дизайн месте массива, описанный здесь является для экспериментального изучения alloantibody специфичность в пересадке против антигенов HLA органа доноров. В отличие от существующих пробирного SAB, широко используется в клинике метод массива антигена имеет большое преимущество в его гибкий ди...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170
Non-fat milk	Bio Rad Laboratories	1706404
TBST	Santa Cruz Biotechnology	10711454001
Goat anti-human IgG–HRP	ThermoFisher Scientific	A18811
Clarity Western ECL Substrate	Bio Rad Laboratories	1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer	Thermo Scientifics	21059
ChemiDoc gel imaging system	Bio Rad Laboratories	1708265