على أساس ديندريمير نانوباتيرنس متفاوتة إلى محلياً مراقبة سطح أدهيسيفينيس: أسلوب لتوجيه التمايز تشوندروجينيك

Ignasi Casanellas; Anna Lagunas; Iro Tsintzou; Yolanda Vida; Daniel Collado; Ezequiel Pérez-Inestrosa; Cristina Rodríguez-Pereira; Joana Magalhaes; Pau Gorostiza; José A. Andrades; José Becerra; Josep Samitier

doi:10.3791/56347

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

أسلوب للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على أساس ديندريمير التي تسمح بمراقبة النانو المحلية ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك حمض (إدارات) السطحية الكثافة الموصوفة وتطبيقها لدراسة الخلية التمايز الالتصاق وتشوندروجينيك.

Abstract

الالتصاق الخلوي والتمايز مرهون بالتصرف النانو عناصر المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مع تركيزات المحلي أثرا كبيرا. هنا نقدم طريقة للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على نطاق واسع من حمض ارجينين-جليكاين-الأسبارتيك (إدارات)-ديندريميرس فونكتيوناليزيد التي تسمح بمراقبة النانو إدارات محلية السطحية الكثافة. نانوباتيرنس هي التي شكلتها الامتزاز السطحي من ديندريميرس من الحلول بتركيزات مختلفة الأولى وتتميز بالمياه زاوية الاتصال (CA)، مطيافية الأشعة السينية النانومترية (XPS)، ومسح التحقيق تقنيات مجهرية مثل الميكروسكوب النفقي المسح (STM) ومجهر القوة الذرية (AFM). يتم قياس كثافة السطحية المحلية إدارات استخدام صور فؤاد عن طريق خرائط كِفافية الاحتمالية للحد الأدنى من المسافات إينتيربارتيكلي وثم يرتبط باستجابة التصاق الخلايا وتمايزها. الأسلوب نانوباتيرنينج المقدمة هنا هو إجراء بسيط يمكن الارتقاء بطريقة مباشرة للمساحات الكبيرة. هكذا هو متوافقة تماما مع خلية ثقافة بروتوكولات ويمكن تطبيقها على يغاندس الأخرى التي تعتمد على تركيز تأثيراً على الخلايا.

Introduction

هنا يصف لنا إجراء نانوباتيرنينج على أساس ديندريمير بسيطة ومرنة للحصول على أسطح ثقافة الخلية التي تتيح التحكم في أدهيسيفينيس المحلية في النانو. سجلت تفاصيل النانو للمنظمة إدارة المحتوى في المؤسسة،¹^،²^،³ ونانوباتيرنينج خلية التصاق الأسطح قدمت رؤى عميقة في متطلبات الخلوية المتصلة بانضمام⁴^، ⁵. كشفت تجارب ميسيلار نانوباتيرنس على أساس الطباعة الحجرية باستخدام قيمة عتبة لحوالي 70 نانومتر لإدارات الببتيد نانوسباسينج، التصاق الخلية يتأخر كثيرا فوق هذه القيمة⁶^،^،من⁷⁸ ^،⁹. وأبرزت هذه الدراسات أيضا تأثير أكبر من المحلية من كثافة يجند العالمية على خلية التصاق⁹^،^،من¹⁰¹¹.

خلال morphogenesis، تؤدي التفاعلات الخلية مع البيئة المحيطة أحداث التفرقة الأولى، التي تستمر حتى تم تشكيل هياكل الأنسجة المعقدة النهائية. وفي هذا الإطار، استخدمت الأسطح نانوباتيرنيد للتصدي لتأثير التفاعلات سطح الخلية الأولى في morphogenesis. نانوباتيرنس إدارات القائم على الطباعة الحجرية مع تباعد أفقي من 68 سبائك نانومتر في بيتا من نوع تي-40Nb تساعد على الحفاظ على النمط الظاهري غير متمايزة من الخلايا الجذعية غير ارتكب¹²، بينما نانوسباسينجس إدارات من بين 95 و 150 نانومتر تعزيز التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) نحو أديبوجينيك/أوستيوجينيك¹³^،^،من¹⁴¹⁵ وتشوندروجينيك الأقدار¹⁶. أيضا، أظهرت الذاتي تجميع الجزيئات تعديل مع مكونات إشارات مباشرة التصاق الخلايا والتمايز بتقديم لائحة معمارية نانوية العظة مما يشير إلى¹⁷. وفي هذا الصدد، ترسب ديندريميرس مع التفاعل خلية مويتيس في هذه المجال الخارجي¹⁸^،^،من¹⁹²⁰ على الأسطح قد استخدمت لدراسة الخلية التصاق²¹^،²²، مورفولوجيا²³^،²⁴، و²⁵^،أحداث الهجرة²⁶. ومع ذلك، عدم وجود توصيف السطحية في هذه الدراسات يجعل من الصعب إقامة أي علاقة بين التكوين السطحي dendrimer واستجابة الخلايا.

يمكن الحصول على نانوباتيرنس ديندريمير مع النظام مثل السائل والتباعد المعرفة عند ديندريميرس الجسميات على أسطح مشحونة بالمنخفض من الحلول مع انخفاض القوة الأيونية. ²⁷ على أساس هذه الخاصية، نقدم هنا طريقة للحصول على نانوباتيرنس متفاوتة على نطاق واسع من إدارات فونكتيوناليزيد ديندريميرس على أسطح مشحونة المنخفضة التي تسمح بمراقبة النانو الكثافة السطحية إدارات محلية. زاوية الاتصال المياه (CA)، مطيافية الأشعة السينية النانومترية (XPS) والمسح المسبار المجهري تقنيات (تحقيق الاستقرار والانتساب وفؤاد نانوباتيرنس) إظهار أنه يمكن ضبط كثافات يجند المحلية تعديل تركيز ديندريمير الأولى في حل. الكثافة السطحية إدارات محلية كمياً من صور فؤاد بخرائط كِفافية الاحتمالية للحد الأدنى من المسافات إينتيربارتيكلي وثم يرتبط مع تجارب الخلية. بالمقارنة مع سائر تقنيات نانوباتيرنينج⁴، نانوباتيرنينج على أساس ديندريمير واضحة ويمكن الارتقاء بسهولة إلى المناطق السطحية الكبيرة، وبالتالي يجري متوافقة تماما مع تطبيقات ثقافة الخلية. نانوباتيرنس تستخدم كركائز النشطة بيولوجيا لتقييم تأثير الكثافة السطحية إدارات محلية في خلية التصاق²⁸ وتعريفهم تشوندروجينيك الكبار البشرية MSCs²⁹. إظهار النتائج التي توصلنا إليها أن نانوباتيرنس على أساس ديندريمير إدارات الحفاظ على نمو الخلايا وأن تعززه التصاق الخلايا عالية الكثافة السطحية إدارات محلية. في تجارب التمايز، يفضل أدهيسيفينيس الوسيطة من الخلايا إلى ركائز MSC التكثيف والتمايز تشوندروجينيك المبكر. نظراً للسهولة مع ديندريمير التي يمكن تعديل الفئات الهامشية، الأسلوب الموصوفة هنا ويمكن تمديد لغيرها يغاندس إدارة المحتوى في المؤسسة التي تعتمد على تركيز تأثيراً على الخلايا.

Protocol

1-إعداد الركيزة

الصلب Au(111) 1.4 x 1.1 سم على ركائز ميكا.
1. ضع الركيزة Au(111) على حب السيراميك الزجاجية ويصلب مع لهب غاز بوتان للحد الأدنى 3 السماح الركيزة لتبريد تحت جو أرجون. كرر هذه الخطوة لكل الركيزة Au(111).
  ملاحظة: يجب استخدام ركائز Au(111) فورا بعد الصلب.
إعداد بولي (حمض لاللبن) (ذات)-المغلفة ركائز الزجاج.
1. قطع ويغسل الشرائح الزجاجية.
  1. قطع شرائح مجهرية إلى شرائح 18 من 1.25 × 1.25 سم مع قطع الماس-تلميح. جعل من المسافة بادئة صغيرة على الجانب السفلي لكل شريحة، بحيث يمكن تمييز الطرفين العلوي والسفلي في وقت لاحق.
  2. يغسل الشرائح جيدا مع المياه تليها الإيثانول 96%. تسمح لهم أيردري.
2. إعداد الحل ذات 2%.
  1. إضافة 200 مغ ذات إلى 10 مل من 1، 4-ديوكساني في أنبوب ضغط. إضافة شريط ضجة وإغلاق الأنبوب محكم.
  2. وضع أنبوب الضغط في حمام الجليسرين على لوحة الساخن عند 60 درجة مئوية تحت التحريك لطيف ح 24 ومن ثم نقل الحل إلى قنينة زجاج 15 مل.
3. طلاء الشرائح الزجاجية ذات للحل.
  1. ضع الشرائح الزجاجية والقنينة مع الحل ذات على لوحة الساخن نظيفة عند 60 درجة مئوية. تأكد من وضع الشرائح الأعلى والسماح لهم بالبقاء لمدة 10 دقيقة على الأقل للوصول إلى درجة الحرارة اللازمة.
  2. إعداد المغطى تدور وتعيين البرنامج المحدد في الجدول 1.
  3. مكان واحد لمواجهة الشرائح على المغطى تدور، باستخدام نظام الشفط. مع ماصة باستور، تنطبق 0.25 مل الحل ذات الشريحة، مع التأكد من أن تغطي السطح كله. قم بتشغيل برنامج طلاء. كرر هذه الخطوة لكل شريحة.

2-ديندريمير نانوباتيرنينج

إعداد حلول ²⁸ إدارات فونكتيوناليزيد Dendrimer (إدارات-Cys-D1).
1. حل 5 ملغ ديندريمير في 6.494 مل مياه. هذا الحل أ
  ملاحظة: استخدم الحل ديندريمير الأسهم في غضون 6 أشهر إعداد.
2. Sonicate الحل أ لمدة 10 دقائق وإعداد الحلول B و C بعد الجدول 2.
3. Sonicate الحل ج لمدة 10 دقائق وإعداد الحلول دال وهاء وواو بعد الجدول 2.
4. تخزين الحلول ب، ج، د، ه وو عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. ويمكن تخزين الحل A في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
نانوباتيرنينج ديندريميرس إدارات-Cys-D1 على ركائز
1. في غطاء زراعة الأنسجة، تعقيم ركائز من الإشعاعية لهم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 13 دقيقة.
  ملاحظة: هذه الخطوة ضروري فقط عندما تسير ركائز نانوباتيرنيد تكون بمثابة ركائز ثقافة الخلية. وفي هذه الحالة، المحافظة على ظروف معقمة (هود زراعة الأنسجة والمواد المعقمة، والحلول والتقنيات) للخطوات التالية.
2. ضع كل مواجهة الركيزة في الآبار للوحة، التعامل معها بعناية مع ملاقط.
3. Sonicate الحلول ب، ج، د، ه وو لمدة 10 دقائق.
4. تمرير الحلول dendrimer إدارات-Cys-D1 من خلال مرشح قطر 0.22 ميكرومتر استخدام حقنه مباشرة في الآبار التي تحتوي على ركائز (2 مل في البئر). يوصي بالنسخ المتماثلة على الأقل ثلاثة كل تركيز ديندريمير. إغلاق وختم اللوحة وتركها في درجة حرارة الغرفة (RT) ح 16.
5. إزالة وتجاهل الحلول. أغسل ركائز مع المياه معقمة وجافة. ركائز مخزن في 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

3-إعداد ركائز السيطرة

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الخطوات في حلول هود زراعة الأنسجة المعقمة، ومواد تعقيم فقط، وقد استخدمت تقنيات. على الأقل، مراقبة ست ركائز المستخدمة (ثلاثة المتماثلة في مراقبة إيجابية) وثلاث نسخ متماثلة من مراقبة سلبية.

في غطاء زراعة الأنسجة، تعقيم ركائز من الإشعاعية لهم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 13 دقيقة.
ركائز السيطرة لتجربة التصاق تنتجها الخلايا الليفية.
1. استخدام ركائز Au(111) تعتيق اللهب كعنصر سلبي. الذهب له تأثير تمسخ بروتين معروفة التي يمنحها خصائص الخلية المضادة التصاق²⁸. Sonicate جميع الحلول وتصفية قبل الحضانة الركازة.
2. لعناصر إيجابية، تزج ركائز Au(111) تعتيق اللهب في حل ثيول شماعة تعديل لإدارات وأكجليارججلياسبسيراسبنهيثيليني جليكول مونو-11-ميركابتونديكاناميدي (إدارات-شماعة-ش)³⁰ تريثيليني غليكول مونو-11-ميركابتونديسيل خماسي البروم ثنائي الفينيل (شماعة ش) بنسبة 1: 100 مولى في الإيثانول 96% ح 16 في الرايت
3. يغسل ركائز جيدا في الإيثانول وتجفيفها مع الأرجون. ركائز مخزن في 4 درجات مئوية.
ركائز السيطرة على تشوندروجينيسيس.
1. استخدام البكر ذات ركائز كعنصر سلبي. دون أي المعالجة السطحية، يظهر ذات سوء التواصل مع الخلايا الحية. ³¹
2. لعناصر إيجابية، تعد 5 مل فيبرونيكتين 0.1 مغ/مل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) واحتضان كل ذات الركيزة مع 1.6 مل حل ح 1 في الرايت فيبرونيكتين
3. إزالة وتجاهل حل فيبرونيكتين، وتغسل ركائز مع برنامج تلفزيوني. ركائز مخزن في 4 درجات مئوية.

4-سطح توصيف

تصوير فؤاد
1. إجراء تصوير فؤاد من ركائز ذات تحليل خشونة. منذ ديندريميرس وقد يبلغ قطرها 4-5 نانومتر، قيم خشونة من 1 نانومتر ينبغي الحصول عليها للتصور السليم نانوباتيرنس. أيضا، إجراء تصوير فؤاد نانوباتيرنس. وفي كلتا الحالتين، أداء فؤاد في استغلال الوضع في الهواء.
2. حدد ناتئ من سيليكون مع k ثابت ربيع = 40 N/m و ν تردد مدوية = 300 كيلو هرتز وجبل على المعدات فؤاد.
3. جبل العينة على مرحلة مجهر القوة الذرية. اعتماداً على إعداد الجهاز، قد يختلف التصوير المواصفات وضبط. راجع الكتيب الخاص بالشركة المصنعة.
4. نهج عينة بطرف المجهر حتى الاتصال.
5. إلى صورة ذات التحليل خشونة، حدد مالا يقل عن أربعة مجالات الممثل 20 x 20 ميكرومتر الواحدة الركيزة من ثلاث ركائز مستقلة. صورة نانوباتيرنس ديندريمير، واختر على الأقل ثلاث صور الممثل من 5 × 5 ميكرومتر الواحدة الركيزة من ثلاث ركائز مستقلة كل شرط (تركيز ديندريمير الأولية في الحل). لتجنب إتلاف طبقة ديندريمير أثناء التصوير، ضبط النقطة المحددة الإبقاء على القوة كحد أدنى.
  ملاحظة: اختيار مجال التصوير يعتمد أيضا على نطاق عمل الماسح الضوئي كهرضغطية. الرجاء مراجعة دليل الصك في هذا الصدد.
6. عملية ارتفاع فؤاد الصور باحتواء كل مسح خط لتسوية المهام باستخدام البرمجيات المسجلة الملكية من الشركة المصنعة للجهاز فؤاد متعدد الحدود، وتحليل تلك من ذات لحساب خشونة السطح. جذر متوسط مربع (RMS) التحليل قد توفر خياراً مناسباً.
قياس الكثافة السطحية إدارات محلية.
1. الحصول على عتبات صورة من الصور الارتفاع فؤاد المجهزة لتحديد ديندريميرس على السطح.
2. تحديد مواقف الجسيمات باستخدام برامج معالجة صور واستخدامها للحصول على المسافات إينتيربارتيكلي الحد الأدنى (د_دقيقة).
3. ارسم د_دقيقة القيم في z إلى مواقف الجسيمات المقابلة للحصول على خرائط كِفافية احتمال مد_دقيقة. ضبط مقياس اللون من الأرض لتصور مناطق أعلى المحلية إدارات السطحية الكثافة (nm < 70_دقيقة د).
4. تحديد حجم المنطقة من المناطق مع أعلى المحلية إدارات السطحية كثافة استخدام برامج معالجة صور. وتشمل مجالات المجاميع ديندريمير في الحساب.
التصوير بتحقيق الاستقرار والانتساب.
ملاحظة: يمكن إجراء التصوير بتحقيق الاستقرار والانتساب فقط نانوباتيرنس على ركائز Au(111) موصلة. وتتم القياسات في الهواء.
1. ضع الركيزة نانوباتيرنيد في حامل عينة من المعدات الموحدة. تحقق من اتصال الكهربائية بين العينة وحامل مع مختبر.
2. أحفر تلميح من مواد التحقيق المحدد (أي. Pt 0.8: Ir 0.2) مع قطر الذي يضمن المناسب السليم على رأس هذه المعدات الموحدة. يمكن أن يؤديها النقش بالقطع اليدوي أو بالنقش الكهروكيميائية. ³²
  ملاحظة: النقش الكهروكيميائية يجعل المزيد من النصائح متماثل.
3. جبل التلميح في رأس المعدات الموحدة والاتصال العينة.
4. تعيين "الحالي" في قناة التغذية المرتدة (في هذا نوع من القياس، الحالية سوف تكون ثابتة بضبط ردود الفعل). ضبط الجهد التحيز والنقطة المحددة الحالية وحجم المسح الضوئي للحصول على صورة حلها مرة واحدة تعمل نصيحة.
  ملاحظة: اختيار مجال التصوير يعتمد أيضا على نطاق عمل الماسح الضوئي كهرضغطية. الرجاء مراجعة دليل الصك في هذا الصدد.
5. عملية الصور الطبوغرافية الموحدة باحتواء كل سطر التفحص للتسوية متعدد الحدود وظائف باستخدام البرمجيات المسجلة الملكية من الشركة المصنعة للجهاز على تحقيق الاستقرار والانتساب.
القياسات المرجع المصدق.
1. قياس المرجع المصدق على ركائز نانوباتيرنيد بواسطة الأسلوب لاطئة قطره في ثلاثة مواقع مختلفة على ثلاث ركائز مستقلة كل شرط (تركيز ديندريمير الأولية في الحل) مع نظام CA بصري.
2. تعبئة في ميكروسيرينجي بالمياه. وتعيين المعلمات في برنامج CA لإنتاج قطرات من 1 ميليلتر.
3. ضع العينة على المسرح حيث تكون مرئية بوضوح على الكمبيوتر من أجل تصوير سطح العينة.
4. نقل المحاقن مع ميكرومانيبولاتور حتى يحصل قريبة من السطح، والاستغناء عن الهبوط على السطح. سجل الصورة مباشرة بعد استقرار الحبرية.
  ملاحظة: في القياسات المرجع المصدق، مهم جداً للتحكم في الرطوبة من أجل تحقيق النتائج استنساخه.
5. تحليل قياس مع البرمجيات المسجلة الملكية من الشركة المصنعة للجهاز CA الأكاديمية الصينية للعلوم. ويمكن تعديل الأسلوب المناسب لمتطلبات المستخدم. يمكن أن يكون الأسلوب المناسب الإهليلجية خياراً.

5-خلية ثقافة

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الخطوات في حلول هود زراعة الأنسجة، ومواد تعقيم فقط، وقد استخدمت تقنيات.

تجربة التصاق تنتجها الخلايا الليفية.
1. الثقافة المعاهد الوطنية للصحة 3T3 الماوس الليفية الجنينية من الممرات (< 10) في وقت مبكر في 37 درجة مئوية و 4.6% CO₂ الغلاف الجوي في متوسطة القاعدية مع ارتفاع الجلوكوز وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% ل الجلوتامين، بيروفات صوديوم البنسلين والستربتوميسين و 1% 1% (متوسط النمو). ويوصي بقوارير T75 لبذر مجموع الخلايا 500,000 كل قارورة في 10 مل متوسطة النمو.
2. إزالة المتوسطة القديمة مع ماصة 10 مل كل يومين واستبدالها مع 10 مل متوسط النمو الطازجة.
3. خلايا الثقافة في الأجلين المتوسط والنمو حتى تصل إلى حوالي 80% التقاء، ثم إزالة المتوسطة وإضافة 5 مل التربسين كل قارورة. للتأكد من خلية سليمة مفرزة من أسفل قارورة، الحفاظ على الحل التربسين على اتصال بالخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. إضافة 5 مل متوسط النمو في قارورة وجمع الخلايا في أنبوب الطرد مركزي. الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لأدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة النمو. تحديد تركيز الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
5. نقل ركائز جيدا لوحات لا تعامل لزراعة الأنسجة (غير ملتصقة).
6. الخلايا على ركائز في كثافة 4,000 الخلايا/سم² في متوسط نمو البذور واحتضانها لهم ح 4.5 في 37 درجة مئوية و 10% من الغلاف الجوي₂ CO.
تشوندروجينيك تحريض MSCs.
1. الثقافة البشرية MSCs من الممرات في وقت مبكر (< 5) في جو₂ CO 37 درجة مئوية و 4.6 في المائة في متوسط النمو ماجستير. ويوصي بقوارير T75 لبذر مجموع الخلايا 500,000 كل قارورة في 10 مل متوسطة النمو.
2. تغيير المتوسطة كل 3 أيام (كما هو موضح في 5.1.2).
3. تريبسينيزي الخلايا قبل التقاء 80% هو الذي تم التوصل إليه، والطرد المركزي وريسوسبيند لهم في لجنة السلامة البحرية النمو المتوسطة (كما هو موضح في 5.1.3). تحديد تركيز الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
4. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وريسوسبيند لهم في 10 مل متوسط الذي يحفز تشوندروجينيسيس.
5. نقل ركائز من اللوحات للوحات الجديدة جيدا لا تعامل لزراعة الأنسجة (غير ملتصقة). بذور الخلايا على ركائز في كثافة 3,000 الخلايا/سم².
6. تغيير المتوسطة تشوندروجينيك كل 3 أيام (كما هو موضح في 5.1.2).

6-الخلية وتثبيت وإيمونوستينينج

ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات التالية في ظل ظروف غير معقمة.

قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا بلطف مع برنامج تلفزيوني. إصلاح لهم عن طريق إضافة حل فورمالين 10% لمدة 20 دقيقة في الرايت
إزالة في الفورمالين وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
حظر الجماعات ألدهيد مجاناً عن طريق إضافة حل 50 مم من كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) في برنامج تلفزيوني. ترك الخلايا لمدة 20 دقيقة في حل الرايت NH4Cl إزالة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
إزالة برنامج تلفزيوني وبيرميبيليزي الخلايا عن طريق إضافة حل 0.1% من صابونين في حل حظر (الزلال 1% في برنامج تلفزيوني) لمدة 10 دقائق في غسل الرايت الخلايا مع برنامج تلفزيوني ونقل العينات إلى لوحة جديدة تماما.
احتضان الخلايا مع إيجاد حل للأجسام المضادة الأساسي في حل حظر (الجدول 3) ح 1 في الرايت ثم إزالة الحل جسم الأولية وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية في حل حظر ح 1 في الرايت (الجدول 3)
ملاحظة: تجنب الضوء التعرض.
إزالة الحل جسم الثانوية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني والجافة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية في الظلام.
تركيب نموذج للمراقبة المجهر: استخدام قاطع تلميح الماس، قطع كوفيرسليبس إلى 1.25 سم × 1.25 سم. تطبيق 50 ميليلتر من تصاعد المتوسطة على العينات مجهرية وتغطيتها برفق مع كوفيرسليبس قطع.
نقل العينات إلى مستلم مريحة، وتغطي برقائق الألومنيوم ومخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى المراقبة.

7-الخلية تصوير وتحليل البيانات

ملاحظة: Au(111) مبهمة وركائز سميكة على أساس ميكروسليدي، يجب استخدام مجهر منتصبة.

تجربة التصاق تنتجها الخلايا الليفية.
1. استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مجهزة بكاميرا رقمية ومنخفضة (أي 10 X) والتكبير عالية (أي 40 س) الأهداف. إجراء القياسات في الهواء.
2. ضع العينة في نواة الخلية المرحلة والصورة مع الهدف X 10 باستخدام إثارة الأشعة فوق البنفسجية، تصفية الانبعاثات الفلترات لتصور وصمة عار هويشت/DAPI.
3. صورة خلية سيتوسكيليتون والالتصاقات المحورية (فاس) بهدف س 40، تحديد عامل التصفية المجهر الذي يطابق المواصفات fluorochrome جسم المقابلة.
4. للتحديد الكمي فا، استخدام برامج معالجة صور لتحويل الصور إلى ملفات 8 بت. إزالة صور الخلفية وتحويله إلى ثنائي بتحديد عتبة. حساب الصور على الأقل 30 كل عينة وتنظر منظمة تضامن النساء الأفريقيات من 1 ميكرومتر² للحساب.
تشوندروجينيك تحريض MSCs.
1. صورة المتكثفات الخلية في المراحل الأولى من تشوندروجينيك التعريفي (< 5 أيام) مع مجهر ابيفلوريسسينسي تستقيم مجهزة بكاميرا رقمية ومنخفضة (أي 10 X) الهدف التكبير. استخدام الأشعة فوق البنفسجية تصفية الانبعاثات الإثارة والفلترات لتصور وصمة عار هويشت/DAPI.
2. لقياس منطقة المكثفات، استخدام برامج معالجة صور وتحويل الصور إلى ملفات 8-بت، وإزالة الخلفية وتحديد عتبة يسلط الضوء على كفاف التجميعية. حساب منطقة الجسيمات.
3. عينات إيمونوستينيد صورة لمنظمة تضامن النساء الأفريقيات، وألياف الأكتين سيتوسكيليتون والكولاجين الغضروف محددة النوع الثاني ألفا 1 (COL2A1) مع مجهر [كنفوكل] تستقيم في تضخم عالية (أي 40-60 س). تجميع المقاطع في فاصل تمثيلي (أي 0.5 – 1 ميكرون).
4. لمعالجة المكدس، استخدم برامج معالجة صور. تحويل الصور إلى ملفات 8 بت وإزالة الخلفية وجعلها ثنائي بتحديد عتبة. علاج الحد أدنى من ثلاثة المتكثفات الخلية الواحدة شرط لثلاث عينات مستقلة.
5. تحديد كمية البروتين فا الملون المناطق من منطقة المتكثفات الخلية القاعدية والتعبير عنها بالنسبة المئوية المقابلة لمنطقة مقسوماً على عدد نواة الخلية في الصورة.
6. لقياس تلطيخ COL2A1، استخدم z [كنفوكل]-الإسقاطات والتحديد الكمي لمجموع المنطقة المتوقعة (الحد الأقصى للمساحة COL2A1 كل عينة). تطبيع قيمة المنطقة حصلت ضد منطقة المكثفات المقابلة.

8-الكمية عكس النسخ-بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (قرة-PCR) التحليل

ملاحظة: لمنع التلوث رناسي، استخدم ير البلاستيك القابل للتصرف، والعقيمة وارتداء القفازات المتاح أثناء التعامل مع المواد الكاشفة، والجيش الملكي النيبالي. دائماً استخدم تقنيات العقيم الميكروبيولوجية السليم واستخدام حلاً تطهير مناسب لإزالة التلوث رناسي من أسطح العمل والعناصر غير القابل للتصرف مثل أجهزة الطرد المركزي والماصات.

عزل الحمض النووي الريبي مجموع ويطحنون عليه في ديسروبتير الجيش الملكي النيبالي. تعامل مع الدناز عينات الحمض النووي الريبي وتحويلها إلى استخدام عدة توليف كدنا كدنا.
إجراء qRT PCR استخدام كبسولة تفجير لعامل النسخ SOX9. بيتا-2-ميكروجلوبولين (B2M) والبروتين ريبوسومال L13a (RPL13a) يمكن أن تستخدم كالجينات التدبير المنزلي.
حساب مستويات التعبير، وتطبيع هذه ضد سيطرة سلبية (ذات).

النتائج

نحن نقدم طريقة نانوباتيرنينج التي تسمح أدهيسيفينيس السطحية التي ستعالج في النانو (الشكل 1). ويبين الشكل 1Aالتركيب الكيميائي لإدارات-Cys-D1. ديندريميرس كانت منقوشة على السطوح Au(111) الموصلة الكهربائية لعاليه الدقة وصف تحقيق الاستقرار والانتساب...

Discussion

أثناء تطوير البروتوكول وصف، ينبغي اتخاذ عدد من الخطوات الحاسمة. الأول يشير إلى توصيف نانوباتيرن مع المسبار المجهري تقنيات المسح. تصور نانوباتيرنس، يجب أن يكون السطح حيث يتم إنتاج الزخرفة قيمة خشونة أدناه القطر يعني من ديندريميرس، وحول 4-5 نانومتر مقاسا بتحقيق الاستقرار والانتساب (الش...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

الكتاب يعترف أوريول الخط-باخ وألبرت زاي كاستانيو للمساعدة في مد_دقيقة التحديد الكمي. وهي تعترف أيضا "وحدة الفحص المجهري رقمية متقدمة" في معهد للبحوث في الطب الحيوي (برشلونة مجلس الهجرة واللاجئين) للسماح للمؤلفين تسجيل الفيديو في أماكن عملهم. وأيد هذا العمل بالشبكات الطبية الحيوية البحوث مركز (سيبير)، إسبانيا. سيبير مبادرة تمولها R الوطني السادس & د & أنا خطة الفترة 2008-2011، Iniciativa إنجينيو 2010، تدعيم الإجراءات سيبير والبرنامج دي معهد الصحة كارلوس الثالث، بالدعم من "الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية". تم دعم هذا العمل من خلال لجنة الجامعات والبحوث إدارة الابتكار، والجامعات، والمؤسسة من محافظة في كاتالونيا (2014 SGR 1442). وقد مولت أيضا مشاريع أوليجوكوديس (رقم MAT2012-38573-C02) و CTQ2013-41339-P، تمنحها وزارة الاقتصاد الإسبانية، والقدرة التنافسية، بالإضافة إلى ذلك إلى الأقاليمي فى إسبانيا والبرتغال عام 2014-2020 "بوكتيب" (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. وتسلم الدعم المالي من المنحة الإسبانية وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية (رقم IFI15/00151).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm	Spi Supplies	466PS-AB
Glass micro slides, plain	Corning	2947-75x25
Deionized water	Millipore		18MΩ cm
Ethanol 96%	PanReac	131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer	Corbion		95/05 molar ratio
1,4 - dioxane	Sigma-Aldrich	296309-1L
Silicone oil, high temperature	Acros Organics	174665000
Spinner	Laurell	WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood	Telstar	Bio II Advance	Class II biological safety cabinet
Filter unit	Millex-GP	SLGP033RB	0.22 µm
Syringe 10 mL	Discardit	309110
Atomic Force microscope	Veeco Instruments	Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes	Budget Sensors	Tap300AI-G	Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope	Molecular Imaging	PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire	Advent	PT671012	Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software	Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system	Dataphysics
SCA20 software	Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer	Physical Electronics	Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Gibco	21600-10	Powder
Mouse embryo fibroblasts	ATCC	ATCC CRL-1658	NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose	Gibco	11960044	liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044	500 mL
L-Glutamine	Invitrogen	25030	200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360039	100 mL
T75 culture flasks	Nunclon	156499
Trypsin	Life Technologies	25200072	0,25% EDTA
Centrifuge	Hermle Labortechnik	Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well	Falcon	351143	Non-adherent
Adipose-derived hMSCs	ATCC	ATCC PCS-500-011	Cell vial 1 mL
MSC basal medium	ATCC	ATCC PCS-500-030
MSC growth kit	ATCC	ATCC PCS-500-040	Low serum
Chondrocyte differentiation tool	ATCC	ATCC PCS-500-051
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011-15ML	neutral buffered, 10%
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434-500G	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F	for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody	Abcam	ab32084	Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain	Acris Antibodies	AM00212PU-N	Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A10667	2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11036	2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570 10ML	10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm	Deltalab	D102424
Fluoromount	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse E1000 upright microscope	with a CCD camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems		Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware	http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software	The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software	OriginLab Coorporation

References

Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 AFM Mscs

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: