דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

Ignasi Casanellas; Anna Lagunas; Iro Tsintzou; Yolanda Vida; Daniel Collado; Ezequiel Pérez-Inestrosa; Cristina Rodríguez-Pereira; Joana Magalhaes; Pau Gorostiza; José A. Andrades; José Becerra; Josep Samitier

doi:10.3791/56347

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.

Abstract

אדהזיה הסלולר ובידול הוא נעשים על ידי חיסול הננומטרי הרכיבים מטריצה חוץ-תאית (ECM), עם ריכוזים המקומי יש השפעה גדולה. כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של ארגינין-גליצין-אספרטית (RGD)-dendrimers functionalized, כי היתר שליטה ננו של RGD מקומיים על פני השטח צפיפות. Nanopatterns נוצרות על ידי משטח ספיחה של dendrimers של פתרונות בריכוזים שונים ראשונית מאופיינים זווית מגע מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), ועל סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות כגון מיקרוסקופ מינהור סריקה מנהור, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). הצפיפות השטח המקומי של RGD נמדד באמצעות AFM תמונות באמצעות הסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם התגובה אדהזיה תא ובידול. השיטה nanopatterning המובאת כאן היא הליך פשוט וניתן לשנותם ובצורה ישירה על פני אזורים נרחבים. הוא ולכן הוא תואם באופן מלא עם תא תרבות פרוטוקולים, ניתן להחיל על אחרים ליגנדים זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.

Introduction

כאן נתאר פרוצדורה פשוטה ופסיביות מבוססי דנדרימר nanopatterning להשיג משטחים התרבות תאים המאפשרים השליטה של adhesiveness המקומי ב הננומטרי... דווחו הננומטרי פרטים של ארגון ה-ECM,²^,¹^,³ ואת nanopatterning של התא אדהזיה משטחים סיפקה תובנות הדרישות הסלולר הקשורים הידבקות⁴^, ⁵. ניסויים באמצעות micellar nanopatterns מבוססי ליתוגרפיה חשף ערך סף של 70 nm עבור RGD פפטיד nanospacing, אדהזיה תא שעיכבו באופן משמעותי מעל זה ערך⁶^,⁷^,⁸ ^,⁹. מחקרים אלה מודגש גם השפעה גדולה של מקומיים יותר. צפיפות ליגנד הכללית תא אדהזיה⁹^,¹⁰^,¹¹.

במהלך מורפוגנזה, תא אינטראקציות עם הסביבה לעורר את האירועים בידול הראשון, אשר ממשיכים עד נוצר סופית רקמה מורכבת מבני. במסגרת זו, משטחים nanopatterned שימשו כדי להתמודד עם השפעת הגומלין תא-פני הראשונית על מורפוגנזה. מבוסס-ליתוגרפיה nanopatterns RGD עם ריווח לרוחב של 68 nm בβ-סוג Ti-40Nb סגסוגות עזרה לשמור על פנוטיפ מובחן של תאי גזע שאינו מחויב¹², בעוד nanospacings RGD של בין 95 ו 150 nm לשפר את הבידול של גזע mesenchymal (MSCs) כלפי adipogenic/osteogenic¹³^,¹⁴^,¹⁵ ו- chondrogenic הגורל¹⁶. גם מקרומולקולות וההספק עצמית ששינה עם איתות רכיבים הוכחו ישיר אדהזיה תא ובידול על-ידי מתן ויסות ה-רמזים איתות¹⁷אדריכלי ננו. בהקשר זה, נעשה שימוש בתצהיר של dendrimers עם אינטראקציה תא moieties שלהם בתחום החיצוני¹⁸^,¹⁹^,²⁰ על משטחי ללמוד תא אדהזיה²¹^,²², מורפולוגיה²³^,²⁴, הגירה אירועים²⁵^,²⁶. עם זאת, חוסר אפיון משטח במחקרים אלה מקשה להקים שום קורלציה בין תצורת משטח דנדרימר ותגובת התא.

ניתן להשיג דנדרימר nanopatterns עם נוזל דמוי סדר ומרווח מוגדר כאשר dendrimers לספוח משטחים טעון-נמוך מפתרונות עם עוצמות יוניים נמוך. ²⁷ על בסיס מאפיין זה, כאן אנו מציגים שיטה להשיג בקנה מידה גדול nanopatterns לא אחידה של RGD-functionalized dendrimers על משטחים נמוכה טעונה היתר שליטה ננו של צפיפות המשטח RGD מקומיים. זווית מגע של מים (CA), photoelectron הספקטרומטריה (XPS), סריקת בדיקה מיקרוסקופיית טכניקות (nanopatterns ה-STM, AFM) הצג כי צפיפות ליגנד מקומי יכול להיות מותאם שינוי הריכוז ההתחלתי דנדרימר בפתרון. צפיפות המשטח RGD המקומי לכמת AFM תמונות מאת ההסתברות ומפות מתאר של מרחקים interparticle מינימלי, ואז בקורלציה עם ניסויים התא. לעומת שיטות אחרות nanopatterning⁴, nanopatterning מבוססי דנדרימר פשוטה, ניתן בקלות לשנות פני שטחים גדולים, ובכך להיות תואם באופן מלא עם יישומים התרבות תאים. Nanopatterns משמשים בשם דיאלקטריים ביו כדי להעריך את השפעת הצפיפות השטח המקומי RGD תא אדהזיה²⁸ וממשיך את אינדוקציה chondrogenic של MSCs אדם מבוגר²⁹. התוצאות שלנו מראים כי RGD מבוססי דנדרימר nanopatterns לקיים את צמיחת תאים כי התא אדהזיה זה מתחזק גבוהה מקומיים RGD צפיפות המשטח. בניסויים בידול, adhesiveness ביניים של תאים סובסטרטים העדיף MSC עיבוי ובידול chondrogenic המוקדמות. בשל הקלות עם דנדרימר אשר ניתן לשנות קבוצות היקפיים, השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב הלאה כדי אחר ליגנדים ECM זה להפעיל תלויי-ריכוז השפעות על תאים.

Protocol

1. הכנת הרקע

חישול 1.4 x 1.1 ס מ Au(111) על מישה סובסטרטים.
1. מניחים את המצע Au(111) על כיריים זכוכית קרמיקה, anneal זה עם להבה בוטאן במשך 3 דקות אפשר את המצע להתקרר תחת אווירה ארגון. חזור על שלב זה עבור כל המצע Au(111).
  הערה: Au(111) סובסטרטים אמור לשמש מיד לאחר חישול.
הכנת פוליפוני (חומצה לקטית-L) (PLLA)-מצופה זכוכית סובסטרטים.
1. לחתוך ולשטוף את השקופיות זכוכית.
  1. חותכים שקופיות מיקרוסקופ לתוך שקופיות 18 של 1.25 ס מ x 1.25 ס מ עם חותך עצה היהלומים. להפוך כניסה קטן בצד התחתון של כל שקופית, כך הצד העליון והתחתון ניתן להבחין מאוחר יותר.
  2. לשטוף את השקופיות ביסודיות עם מים יונים ואחריו אתנול 96%. לאפשר להם מילה נהדרת...
2. הכינו את הפתרון PLLA של 2%.
  1. להוסיף 200 מ ג של PLLA 10 מ של 1, 4-dioxane צינור לחץ. הוספת סרגל מערבבים וסגור את הצינור בחוזקה.
  2. למקם את צינור לחץ אמבט גליצרין על פלטה חמה ב 60 מעלות צלזיוס תחת ערבוב עדין במשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את הפתרון כדי בקבוקון זכוכית 15-mL.
3. ציפוי בשקופיות זכוכית עם הפתרון PLLA.
  1. למקם את שקופיות זכוכית, את המבחנה עם הפתרון PLLA על פלטה חמה נקי ב 60 מעלות צלזיוס. הקפידו למקם את השקופיות פונה כלפי מעלה, לאפשר להם להישאר לפחות 10 דקות להגיע הטמפרטורה הדרושים.
  2. להכין את coater ספין ולהגדיר את תוכנית המצוינים בטבלה 1.
  3. במקום אחד של הפנים שקופיות למעלה על coater ספין, באמצעות מערכת ואקום. עם פיפטה פסטר, להחיל 0.25 mL של הפתרון PLLA על השקופית, כדי לוודא כי המשטח כולו מכוסה. הפעל את התוכנית ציפוי. חזור על שלב זה עבור כל שקופית.

2. דנדרימר Nanopatterning

הכנת דנדרימר RGD-Functionalized (RGD-Cys-D1) ²⁸ פתרונות.
1. להמיס 5 מ"ג של דנדרימר ב 6.494 מ ל מים יונים. זהו פתרון א
  הערה: השתמש פתרון מניות דנדרימר בתוך 6 חודשים של הכנה.
2. Sonicate פתרון A 10 דקות והכן פתרונות B ו- C בעקבות בטבלה 2.
3. Sonicate פתרון C עבור 10 דקות והכן פתרונות D, E ו- F בעקבות בטבלה 2.
4. לאחסן פתרונות B, C, D, E ו- F-4 ° C עד השימוש. פתרון A ניתן לאחסן ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
Nanopatterning של Dendrimers RGD-Cys-D1-מצעים
1. בשכונה תרביות רקמה, לעקר את סובסטרטים מאת בין אותם עם אור UV עבור 13 דקות.
  הערה: שלב זה נחוץ רק כאשר nanopatterned סובסטרטים עומדים לשמש תא תרבות סובסטרטים. במקרה זה, לשמור על התנאים סטרילי (תרביות רקמה הוד, חומרים סטרילי, פתרונות וטכניקות) עבור השלבים הבאים.
2. מקם כל הפנים המצע את הבארות של צלחת, מטפל בהם בזהירות עם פינצטה.
3. Sonicate פתרונות B, C, D, E ו- F עבור 10 דקות.
4. עוברים את הפתרונות דנדרימר RGD-Cys-D1 קוטר 0.22-מיקרומטר מסנן באמצעות מזרק ישירות הבארות המכיל את מצעים (2 מ ל/טוב). לפחות שלושה העתקים לכל דנדרימר ריכוז מומלץ. לסגור, לסגור את הצלחת ולהשאיר אותה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 16 h.
5. להסיר ולמחוק את הפתרונות. לשטוף את מצעים עם מים יונים סטרילי ויבש. חנות מצעים ב 4 º C.
  הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.

3. הכנת מצעים שליטה

הערה: כל השלבים בוצעו בפתרונות תרביות רקמה סטרילי הוד, רק חומרים סטרילי, ושימשו בטכניקות. . לפחות שש לשלוט סובסטרטים היו בשימוש (שלושה העתקים של הפקד חיובי), שלושה העתקים של הפקד שלילי.

בשכונה תרביות רקמה, לעקר את סובסטרטים מאת בין אותם עם אור UV עבור 13 דקות.
שליטה סובסטרטים לניסוי אדהזיה פיברובלסט.
1. השתמש annealed להבה Au(111) סובסטרטים של הפקד שלילי. זהב יש השפעה ידועה דנטורציה של חלבונים זה מקנה מאפייני דבק אנטי-תא²⁸. Sonicate כל הפתרונות ולסנן לפני המצע הדגירה.
2. עבור הפקדים חיובית, לטבול annealed להבה Au(111) סובסטרטים בפתרון של פג RGD-השתנה תיול, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene גליקול מונו-11-mercaptoundecanamide (RGD-פג-SH)³⁰ , triethylene גליקול מונו-11-mercaptoundecyl אתר (פג-SH) ביחס של שן טוחנת מטריים אתנול 96% עבור 16 h RT.
3. לכבס מצעים ביסודיות אתנול, לייבש אותם עם ארגון. חנות מצעים ב 4 º C.
מצעים הבקרה עבור Chondrogenesis.
1. השתמש סובסטרטים PLLA הבתוליים של הפקד שלילי. ללא טיפול פני שטח, PLLA מראה עניים ממשק עם תאים חיים. ³¹
2. עבור הפקדים חיובית, להכין 5 מ של 0.1 mg/mL fibronectin בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS), דגירה לכל סובסטרט PLLA מ ל 1.6 של הפתרון fibronectin עבור h 1-RT.
3. להסיר, למחוק את הפתרון fibronectin, לשטוף את מצעים עם PBS. חנות מצעים ב 4 º C.

4. אפיון משטח

AFM הדמיה
1. בצע AFM הדמיה של סובסטרטים PLLA עבור ניתוח חספוס. מכיוון dendrimers בקוטר של 4-5 nm, בערכי חספוס של 1 ננומטר צריכה להתקבל עבור החזיית נכונה nanopatterns. כמו כן, לבצע AFM הדמיה של nanopatterns. בשני המקרים, לבצע AFM הקשה מצב באוויר.
2. בחר שלוחה של סיליקון עם האביב קבוע k = 40 N/m וν לתדר המתאים של = 300 kHz, הר זה על הציוד AFM.
3. הר המדגם על הבמה של מיקרוסקופ כוח אטומי. בהתאם הסידור של המנגנון, כוונון של הדמיה מפרטים עשויות להשתנות. התייעץ עם המדריך של היצרן.
4. גישת המדגם עם קצה המיקרוסקופ עד מגע.
5. לשיקוף PLLA לניתוח חספוס, בחר לפחות ארבעה תחומי 20 x 20 מיקרומטר לכל המצע נציג שלושה סובסטרטים עצמאית. תמונה דנדרימר nanopatterns, לבחור לפחות שלושה להחליפן בתמונות של 5 × 5 מיקרומטר לכל סובסטרט של שלושה סובסטרטים עצמאית לכל תנאי (דנדרימר הראשונית ריכוז בתמיסה). כדי למנוע נזק לשכבת דנדרימר תוך הדמיה, להתאים את שנקבעה מראש כדי לשמור על הכוח לכל הפחות.
  הערה: הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם טווח עבודה של הסורק פיזואלקטריים. נא עיין במדריך כלי בהקשר זה.
6. תהליך הגובה AFM תמונות על-ידי הזזת כל סריקת קו פולינום החלקה פונקציות שימוש בתוכנה קניינית של היצרן של המנגנון AFM, לנתח את אלה של PLLA לחישוב חספוס פני השטח. שורש-ממוצע מרובע (RMS) ניתוח עשוי לספק אופציה מתאימה.
מדידת צפיפות המשטח RGD מקומיים.
1. להשיג את הסף תמונה של גובה מעובד AFM תמונות כדי לבחור את dendrimers על פני השטח.
2. לקבוע את מיקומי החלקיקים באמצעות תמונה בתוכנת עיבוד ולהשתמש בהם כדי להשיג את המרחקים interparticle מינימלי (d_דקות).
3. מגרש d_דקות ערכי z למיקומים חלקיקים המתאימים כדי לקבל את מפות קונטור ההסתברות עבור d_דקות. להתאים את קנה המידה של צבע של העלילה להמחיש את האזורים של מקומיים RGD משטח בצפיפות הגבוהה (d_דקות < 70 ננומטר).
4. לכמת את האזור של האזורים עם מקומיים RGD משטח בצפיפות הגבוהה באמצעות תמונה בתוכנת עיבוד. כוללים את תחומי דנדרימר אגרגטים בחישוב.
הדמיית ה-STM.
הערה: ניתן לבצע הדמיה STM רק עבור nanopatterns על מוליך Au(111) סובסטרטים. המדידות נעשות באוויר.
1. מקם את המצע nanopatterned בעל מדגם של ציוד ה-STM. בדוק את חיבור חשמלי בין מדגם לבין מחזיק עם בודק.
2. לחרוט טיפ של החומר הנבחר בדיקה (כלומר. Pt 0.8: Ir 0.2) בקוטר המבטיח התאמה נכונה על ראשו של ציוד ה-STM. ניתן לבצע חריטה חיתוך ידני או באמצעות תחריט אלקטרוכימי. ³²
  הערה: תחריט אלקטרוכימי רינדור עוד טיפים סימטרי.
3. הר העצה בראש של ציוד ה-STM וחבר את הדגימה.
4. הגדר "זרם" בערוץ משוב (זה סוג המדידה, הנוכחי יהיה קבוע על-ידי כיוונון משוב). להתאים את הסטייה מתח ואת הנוכחית שנקבעה מראש, גודל סריקה כדי לקבל תמונה טוב נפתרה פעם הטיפ עוסק.
  הערה: הבחירה של אזור ההדמיה תלויה גם טווח עבודה של הסורק פיזואלקטריים. נא עיין במדריך כלי בהקשר זה.
5. תהליך הדימויים הטופוגרפי STM על-ידי הזזת כל קו סריקה לשם החלקת פולינום פונקציות שימוש בתוכנה קניינית של היצרן של מנגנון ה-STM.
מדידות CA.
1. מדד CA ב- מצעים nanopatterned בשיטת ושחרור sessile לעבר עמדות שונות שלוש על שלוש סובסטרטים עצמאית לכל תנאי (דנדרימר הראשונית ריכוז בתמיסה) עם מערכת אופטית CA.
2. למלא את microsyringe במים יונים, קבע את הפרמטרים בתוכנה CA לייצר טיפות של 1 µL.
3. המקום המדגם על הבמה, כך השטח של המדגם הוא נראה בבירור על המחשב עבור הדמיה.
4. הזז את המזרק עם micromanipulator עד שיהיה קרוב לפני השטח, לוותר על הירידה על גבי המשטח. להקליט את התמונה מיד לאחר ייצוב droplet.
  הערה: במדידות CA, חשוב מאוד לשלוט לחות על מנת להשיג תוצאות לשחזור.
5. לנתח את CAs נמדד עם התוכנה הקניינית של היצרן של המנגנון CA. ניתן להתאים את שיטת התאמה לדרישות המשתמש. שיטת המדידה אליפטית יכולה להיות אופציה.

5. תרבית תאים

הערה: כל הפעולות בוצעו בפתרונות הוד תרביות רקמה וחומרים רק סטרילי, ושימשו בטכניקות.

פיברובלסט אדהזיה הניסוי.
1. תרבות NIH 3T3 העכבר מתחלקים fibroblasts מתוך פסקאות מוקדמות (< 10) 37 ° C, כ- 4.6% CO₂ אווירה במדיום הבזליים עם גלוקוז גבוהות בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו 1% נתרן פירובט (מדיום הגידול). מבחנות T75 עבור זריעה סך של 500,000 תאים לכל בקבוק של 10 מ"ל של מדיום הגידול מומלצים.
2. הסר בינוני הישן עם פיפטה 10 מ ל כל יומיים והחלף 10 מ"ל של מדיום הגידול המוכנים באופן טרי.
3. התרבות תאים במצע הגידול עד להגיע בסביבות 80% הנהרות ולאחר מכן הסר המדיום הוסף 5 מ של טריפסין לאדם את הבקבוק. כדי להבטיח ניתוק התא הנכון מהחלק התחתון של הבקבוק, לשמור על הפתרון טריפסין בקשר עם התאים עבור 5 דקות ב 37 º C.
4. הוסף 5 מ של מדיום הגידול לכל הבקבוק ולאסוף את התאים בתוך שפופרת צנטרפוגה. Centrifuge התאים ב 470 x גרם במשך 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום הגידול. לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות של hemocytometer.
5. העברה של סובסטרטים טוב צלחות אינה מטופלת עבור תרביות רקמה (שאינו חסיד).
6. זרע התאים על סובסטרטים-צפיפות של תאים/ס מ 4,000² במדיום הגידול, תקופת דגירה אותם של 4.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו-10% CO₂ אווירה.
Chondrogenic אינדוקציה של MSCs.
1. תרבות MSCs האנושי של פסקאות מוקדמות (< 5)-37 ° C ו- 4.6% CO₂ האווירה מדיום הגידול MSC. מבחנות T75 עבור זריעה סך של 500,000 תאים לכל בקבוק של 10 מ"ל של מדיום הגידול מומלצים.
2. שנה את בינוני כל 3 ימים (כפי שמתואר 5.1.2).
3. Trypsinize התאים לפני 80% הנהרות מתמלאת, צנטריפוגה ו resuspend אותם בתוך מדיום הגידול MSC (כפי שמתואר 5.1.3). לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות של hemocytometer.
4. Centrifuge התאים שוב, resuspend אותם ב 10 מ"ל של chondrogenesis בתדר בינוני.
5. להעביר את סובסטרטים הלוחות לוחיות הרישוי טוב אינה מטופלת עבור תרביות רקמה (שאינו חסיד). זרע התאים על סובסטרטים-צפיפות של תאים/ס מ 3,000².
6. לשנות את המדיום chondrogenic כל 3 ימים (כפי שמתואר 5.1.2).

6. התא קיבוע Immunostaining

הערה: ניתן לבצע את הפעולות הבאות בתנאי שאינו סטרילי.

מסיר את המדיה ולשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לתקן אותם על-ידי הוספת 10% הפתרון פורמלין במשך 20 דקות ב- RT.
הסר את פורמלין, לשטוף את התאים עם PBS.
לחסום את הקבוצות אלדהיד חופשית על-ידי הוספת פתרון 50 מ מ של אמוניום כלוריד (NH₄Cl) ב- PBS. להשאיר את התאים עבור 20 דקות ב- RT. להסיר NH4Cl פתרון ולשטוף את התאים עם PBS.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. דוגמאות לחנות ב- PBS ב 4 º C.
הסר PBS permeabilize בתאים על-ידי הוספת פתרון 0.1% של סאפונין הפתרון חסימה (1% אלבומין ב- PBS) 10 דקות בשטיפת RT. התאים עם PBS, העברת דגימות צלחת טוב חדש.
דגירה התאים עם פתרון של נוגדנים העיקרי בפתרון חסימה (טבלה 3) עבור h 1-RT. לאחר מכן, להסיר את הפתרון נוגדן ראשוני, לשטוף את התאים עם PBS.
דגירה התאים עם נוגדנים משניים בפתרון חסימה (טבלה 3) עבור h 1-RT.
הערה: להימנע אור חשיפה.
הסר את הפתרון נוגדנים משניים ולשטוף את התאים עם PBS ויבש.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. אחסן את הדגימות PBS ב 4 ° C בחושך.
הרכבה דגימה להסתכלות במיקרוסקופ: שימוש בחותך עצה היהלומים, חותכים coverslips 1.25 ס מ x 1.25 ס מ. µL 50 להחיל של מיקרוסקופיית הרכבה בינונית על הדגימות ואת לכסות אותם בעדינות עם coverslips לחתוך.
העברת הדגימות לנמען נוח, לכסות אותו. עם רדיד אלומיניום וחנות בחושך ב 4 ° C עד התצפית.

7. תא הדמיה וניתוח נתונים

הערה: אטום Au(111), מצעים מבוסס-microslide עבה, מיקרוסקופ זקוף יש להשתמש.

פיברובלסט אדהזיה הניסוי.
1. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence מצויידים מצלמה דיגיטלית, נמוך (כלומר 10 X), הגדלה גבוהה (כלומר X 40) מטרות. לבצע מדידות באוויר.
2. מניחים את הדגימה על גרעינים תא הבמה ואת התמונה עם המטרה X 10 שימוש של עירור אולטרה סגול, longpass מסנן פליטה כדי להמחיש את הכתם Hoechst/דאפי.
3. התמונה תא שלד התא, מוקד הדבקויות (FAs) עם המטרה X 40, בחירת המסנן מיקרוסקופ התואמת את מפרטי fluorochrome נוגדנים המתאימים.
4. על כימות פא, להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי להמיר תמונות לקבצים 8 סיביות. להסיר את תמונות הרקע ולהמיר בינארי על-ידי הגדרת סף. לחשב לפחות 30 תמונות לכל דגימה ולשקול FAs מיקרומטר 1² עבור חישוב.
Chondrogenic אינדוקציה של MSCs.
1. תמונה עיבוי התא בשלבים ההתחלתיים של אינדוקציה chondrogenic (< 5 ימים) עם מיקרוסקופ epifluorescence זקוף מצויד במצלמה דיגיטלית נמוך (כלומר 10 X) המטרה ההגדלה. השתמש מסנן פליטה אולטרה סגול של עירור ו- longpass כדי להמחיש את הכתם Hoechst/דאפי.
2. למדידת לאזור מעובה, להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה של, להמיר תמונות 8 סיביות, להסיר את הרקע ובחר סף מדגיש את קווי המתאר צבירה. לחשב את השטח של החלקיקים.
3. Immunostained דגימות FAs, סיבי אקטין שלד התא של הסחוס ספציפיים קולגן סוג II אלפא 1 (COL2A1) עם מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף בהגדלה (כלומר X 40-60). איסוף מקטעים במרווח נציג (כלומר 1-0.5 מיקרומטר).
4. כדי לעבד את המחסנית, השתמש בתוכנת עיבוד תמונה. להמיר תמונות 8 סיביות, להסיר את הרקע, ולהפוך אותם בינארית על-ידי הגדרת סף. להתייחס לכל הפחות שלושה עיבוי התא לכל תנאי של שלוש דוגמאות עצמאית.
5. לכמת החלבון פא צבעונית שטחים מהאזור הבזליים של עיבוי התא ולבטא אותם כאחוז המקביל של אזור לחלק למספר של גרעין התא בתמונה.
6. כדי למדוד COL2A1 מכתים, להשתמש z קונאפוקלית-תחזיות ולכמת את הסכום של האזור המתוכנן (מקסימום שטח COL2A1 עבור דגימה). לנרמל את הערך אזור שהושג נגד האזור של עיבוי התואם.

8. כמותיים הפוכה תמלול-פולימראז תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) ניתוח

הערה: כדי למנוע זיהום RNase, להשתמש וואר פלסטיק חד פעמיות, סטרילי, ללבוש כפפות חד פעמיות לטיפול ריאגנטים ו- RNA. תמיד להשתמש נכונה טכניקות aseptic מיקרוביולוגית ולהשתמש פתרון טיהור המתאים כדי להסיר RNase זיהום משטחי עבודה ופריטים שאינם חד פעמיים כגון צנטריפוגות, פיפטות.

לבודד את סך ה-RNA, pulverize זה ב disrupter RNA. מתייחסים RNA דגימות עם DNase ולהחלפתן cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA.
התנהלות לרביעיית-PCR באמצעות תחל הפקטור שעתוק SOX9. Beta-2-microglobulin (B2M) וחלבון ribosomal L13a (RPL13a) יכול לשמש גנים משק בית.
לחשב את רמות הביטוי, לנרמל אותם נגד הפקד שלילי (PLLA).

תוצאות

אנו מציגים שיטה nanopatterning המאפשר משטח adhesiveness לטפל בבית ננו (איור 1). המבנה הכימי של RGD-Cys-D1 מוצג איור 1A. Dendrimers היו בדוגמת על משטחים Au(111) מוליך חשמל ברזולוציה גבוהה אפיון STM. דנדרימר נמוך הריכוזים בתמיסה (עד 10^-5% w/w) שניתנו dendrimers מבודדים ש...

Discussion

במהלך הפיתוח של הפרוטוקול המתואר, יש לשקול מספר צעדים קריטיים. הראשון מתייחס nanopattern אפיון בסריקת טכניקות בדיקה במיקרוסקופ. כדי להמחיש את nanopatterns, השטח שבו מופק המתבנת חייב להיות ערך חספוס מתחת הקוטר אכזרי של dendrimers, אשר הוא סביב 4-5 nm כפי שנמדד על-ידי ה-STM (איור 1B). כמו כן, זה צריך לקחת בח...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מכירים מן גופן-באך ו אלברט ג'י Castaño על עזרתם ביישוב d_דקות כמת. הם גם מכירים יחידת מתקדמות מיקרוסקופ דיגיטלי במכון לחקר וההתערבות (ברצלונה IRB) לתת המחברים להקליט הוידאו המקומית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי רשת ביו מחקר מרכז (CIBER), ספרד. CIBER הוא שיוזמה ממומן על ידי את השישי הלאומית R & D & אני תוכנית 2008-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider התוכנית, CIBER פעולות, דה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי, עם התמיכה של הקרן לפיתוח אזורי אירופה. עבודה זו היא נתמכה על ידי הנציבות אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה של חדשנות, אוניברסיטאות, ארגוני של Generalitat דה קטלוניה (2014 SGR 1442). זה היה גם במימון הפרויקטים OLIGOCODES (מס ' MAT2012-38573-C02) ו- CTQ2013-41339-P, מוענק על ידי משרד הכלכלה הספרדית תחרותיות, בנוסף INTERREG V-A ספרד-פורטוגל 2014-2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E). C.R.P. מודה תמיכה כספית מ ספרדי משרד הכלכלה ואת התחרותיות המענק (מס ' IFI15/00151).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm	Spi Supplies	466PS-AB
Glass micro slides, plain	Corning	2947-75x25
Deionized water	Millipore		18MΩ cm
Ethanol 96%	PanReac	131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymer	Corbion		95/05 molar ratio
1,4 - dioxane	Sigma-Aldrich	296309-1L
Silicone oil, high temperature	Acros Organics	174665000
Spinner	Laurell	WS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hood	Telstar	Bio II Advance	Class II biological safety cabinet
Filter unit	Millex-GP	SLGP033RB	0.22 µm
Syringe 10 mL	Discardit	309110
Atomic Force microscope	Veeco Instruments	Dimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probes	Budget Sensors	Tap300AI-G	Resonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscope	Molecular Imaging	PicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wire	Advent	PT671012	Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 software	Nanotec electronica
Optical contact angle (CA) system	Dataphysics
SCA20 software	Dataphysics
X-ray photoelectron spectrometer	Physical Electronics	Perkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	F1141-1MG	1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)	Gibco	21600-10	Powder
Mouse embryo fibroblasts	ATCC	ATCC CRL-1658	NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucose	Gibco	11960044	liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	16000044	500 mL
L-Glutamine	Invitrogen	25030	200 mM (100X)
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360039	100 mL
T75 culture flasks	Nunclon	156499
Trypsin	Life Technologies	25200072	0,25% EDTA
Centrifuge	Hermle Labortechnik	Z 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 well	Falcon	351143	Non-adherent
Adipose-derived hMSCs	ATCC	ATCC PCS-500-011	Cell vial 1 mL
MSC basal medium	ATCC	ATCC PCS-500-030
MSC growth kit	ATCC	ATCC PCS-500-040	Low serum
Chondrocyte differentiation tool	ATCC	ATCC PCS-500-051
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT5011-15ML	neutral buffered, 10%
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434-500G	for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F	for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibody	Abcam	ab32084	Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain	Acris Antibodies	AM00212PU-N	Diluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A10667	2 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11036	2 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H3570 10ML	10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mm	Deltalab	D102424
Fluoromount	Sigma-Aldrich	F4680-25ML
Epifluorescence Microscope	Nikon	Eclipse E1000 upright microscope	with a CCD camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems		Leica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freeware	http://imgej.nih.gov/ij
MATLAB software	The MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software	OriginLab Coorporation

References

Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 Nanopattern RGD AFM Mesenchymal Mscs Chondrogenesis

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: