JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Dendrimer tabanlı yerel arginin-glisin-aspartik asit (RGD) yüzey yoğunluğu Nano yönetilsin düzensiz nanopatterns elde etmek için bir yöntem açıklanan ve hücre adezyon ve chondrogenic farklılaşması çalışma için uygulanmıştır.

Özet

Hücresel yapışma ve farklılaşma hücre dışı Matriks (ECM) bileşenleri, nano eğilim tarafından büyük bir etkiye sahip yerel konsantrasyonları ile klimalı. Burada büyük ölçekli düzensiz nanopatterns arginin-glisin-aspartik asit (RGD) elde etmek için bir yöntem mevcut-yerel RGD Nano yönetilsin functionalized dendrimers yüzey yoğunluğu. Nanopatterns dendrimers ilk farklı konsantrasyonlarda çözümlerinden yüzey adsorpsiyon tarafından kurulur ve su temas açısı tarafından (CA), x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS), ile karakterizedir ve tarama prob mikroskobu teknikleri gibi tünelleme mikroskobu (STM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) tarama. RGD yerel yüzey yoğunluğu en az interparticle mesafeler aracılığıyla olasılık kontur haritaları AFM görüntüleri kullanarak ve sonra hücre adezyon yanıt ve farklılaşma ile ilişkili ölçülür. Nanopatterning yöntemi burada sunulan geniş yüzey alanları için basit bir şekilde ölçeklendirilebilir basit bir işlemdir. Bu nedenle hücre kültür protokolleri ile tamamen uyumlu ve konsantrasyon bağımlı etkileri hücrelerde sarfetmek diğer ligandlar uygulanabilir.

Giriş

Burada biz Nano yerel adhesiveness kontrolünü sağlayan hücre kültür yüzeyler elde etmek için bir basit ve çok yönlü dendrimer tabanlı nanopatterning açıklayınız. 1,2,3 ve hücre adezyon yüzeyleri nanopatterning yapışma4' eilgili hücresel gereksinimleri içine derin anlayışlar sağlamıştır ECM organizasyon ayrıntılarını Nano bildirilmiştir, 5. Micellar nanopatterns litografi tabanlı kullanarak deneyler ortaya bir eşik değeri yaklaşık 70 nm RGD peptid nanospacing, hücre adezyon önemli ölçüde bu değer6,7,8 gecikmiş için ,9. Bu çalışmalar aynı zamanda büyük etkisi yerel küresel ligand yoğunluğu daha hücre adezyon9,10,11vurgulanır.

Morfogenez sırasında çevreye olan hücre etkileşimleri son karmaşık doku yapılar oluşturulmuştur kadar hangi devam ilk farklılaşma olayları tetikler. Bu çerçevede, nanopatterned yüzeyler ilk hücre yüzeyine etkileşimler morfogenez üzerinde etkisi mücadele için kullanılmaktadır. Litografi tabanlı RGD nanopatterns 68 yanal bir boşluk ile β-türü Ti-40Nb nm alaşımlar RGD nanospacings 95 ve 150 nm arasında bir farklılaşma geliştirmek iken sigara için kabul edilen kök hücreler12, farklılaşmamış fenotip korumak için yardım Adipojenik/Osteojenik13,14,15 chondrogenic kader ve16doğru Mezenkimal Kök hücre (MSCs). Ayrıca, sinyal bileşenlerle değiştiren Self montaj oluştururlar hücre adezyon ve farklılaşma Nano mimari düzenleme, sinyal gönderme ipuçları17sağlayarak doğrudan gösterilmiştir. Bu bağlamda, dendrimers yüzeyler üzerine onların dış küre18,19,20 moieties hücre etkileşim ile birikimi hücre adezyon21,22eğitim için kullanılan, Morfoloji23,24ve göç olayları25,26. Yine de, bu çalışmalarda yüzey karakterizasyonu eksikliği zor dendrimer yüzey yapılandırma ve hücre yanıt arasında herhangi bir ilişki kurmak için yapar.

Ne zaman dendrimers düşük ücret yüzeylere çözümleri ile düşük iyonik güçlü absorbe Dendrimer nanopatterns sıvı gibi sipariş ve tanımlanmış aralığı ile elde edilebilir. 27 bu özellik temelinde, burada büyük ölçekli düzensiz nanopatterns RGD functionalized dendrimers Nano yönetilsin yerel RGD yüzey yoğunluğu düşük ücret yüzeylerde, elde etmek için bir yöntem mevcut. Su temas açısı (CA), x-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) ve tarama prob mikroskobu teknikleri (STM ve AFM nanopatterns) gösteri çözümünde ilk dendrimer konsantrasyon değiştirme yerel ligand yoğunluğu ayarlanabilir. Yerel RGD yüzey yoğunluğu AFM görüntülerden en az interparticle mesafeler tarafından olasılık kontur haritaları sayısal ve hücre deneyleri ile ilişkili. Diğer nanopatterning teknikleri4ile karşılaştırıldığında, nanopatterning dendrimer tabanlı basit ve kolayca böylece hücre kültür uygulamaları ile tam olarak uyumlu olmak büyük yüzey alanlarını ölçeklendirilebilir. Nanopatterns biyoaktif yüzeylerde hücre adezyon28 ve yetişkin insan MSCs29chondrogenic indüksiyon yerel RGD yüzey yoğunluğu etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bizim sonuçlar RGD dendrimer tabanlı nanopatterns hücre büyümesini sürdürmek ve hücre adezyon tarafından yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu takviye edilmiştir gösterir. Farklılaşma deneylerde MSC yoğunlaşma ve erken chondrogenic farklılaşma hücre yüzeyler için ara adhesiveness tercih. Hangi dendrimer ile çevre grupları değiştirilebilir kolaylığı nedeniyle, burada açıklanan yöntemi daha fazla konsantrasyon bağımlı etkileri hücrelerde sarfetmek diğer ECM ligandlar için genişletilebilir.

Protokol

1. yüzey hazırlama

  1. 1.4 x 1.1 cm Au(111) Mika yüzeyler üzerinde tavlama.
    1. Cam seramik Ocak Au(111) substrat yerleştirin ve bir argon atmosfer altında soğutmak için belgili tanımlık substrate 3 dk. izin ver bir bütan alev ile TAV. Her Au(111) substrat için bu adımı yineleyin.
      Not: Au(111) yüzeylerde hemen tavlama sonra kullanılmalıdır.
  2. Poli (L-laktik asit) hazırlanması (PLLA)-cam yüzeylerde kaplı.
    1. Kesme ve cam slaytlar yıkayın.
      1. Mikroskopi slaytlar 1,25 cm x 1,25 cm bir elmas uçlu kesici ile 18 slaytlar içine kesti. Böylece üst ve alt tarafı daha sonra ayırt edilebilir küçük bir girinti her slaydın alt tarafında olun.
      2. Slaytları % 96 etanol tarafından takip deiyonize su ile iyice yıkayın. Onları kurumasını sağlar.
    2. % 2 PLLA çözüm hazırlamak.
      1. PLLA 200 mg 1,4-dioxane bir basınç tüp 10 mL ekleyin. Bir heyecan çubuğu eklemek ve tüp sıkıca kapatın.
      2. Gliserin banyo 24 h için nazik karıştırma altında 60 ° C'de sıcak tabakta basınç boru yerleştirin ve sonra çözüm 15 mL cam şişe aktarın.
    3. Cam slaytlar PLLA çözüm ile kaplama.
      1. Cam slaytlar ve şişeyi PLLA çözüm ile 60 ° C'de temiz sıcak bir tabak yerleştirin Yukarı bakacak şekilde slaytlar yerleştirdiğinizden emin olun ve onlara gerekli sıcaklık ulaşmak en az 10 dk kalmasını sağlar.
      2. Spin coater hazırlamak ve Tablo 1' de belirtilen program ayarla.
      3. Bir vakum sistemi kullanılarak spin coater üzerinde slaytlar yüzleri yukarı yerleştirin. Pasteur pipet ile 0.25 mL PLLA çözeltisi tüm yüzeyi kaplı emin slayda uygulanır. Kaplama programını çalıştırın. Her slayt için bu işlemi tekrarlayın.

2. Dendrimer Nanopatterning

  1. RGD-Functionalized Dendrimer (RGD-Cys-D1) 28 çözümleri hazırlanması.
    1. Dendrimer 6.494 mL deiyonize su içinde 5 mg geçiyoruz. Bu çözüm A. olduğunu
      Not: dendrimer hisse senedi çözüm hazırlık 6 ay içinde kullanın.
    2. Çözüm A 10 min için solüsyon içeren temizleyicide ve B ve C Tablo 2aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    3. Çözüm C 10 min için solüsyon içeren temizleyicide ve D, E ve F Tablo 2aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    4. Çözümler B, C, D, E ve F 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak. Çözüm A daha sonra kullanmak için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  2. Nanopatterning RGD-Cys-D1 Dendrimers yüzeyler üzerinde
    1. Bir doku kültürü başlık, onları 13 dk için UV ışığıyla irradiating yüzeylerde sterilize.
      Not: nanopatterned yüzeylerde hücre kültür yüzeyler kullanılmak üzere giderken bu adımı yalnızca gereklidir. Bu durumda, aşağıdaki adımları için steril koşullar (doku kültürü başlık, steril malzemeler, çözümleri ve teknikleri) korumak.
    2. Her substrat yüzünü onları dikkatle cımbız ile işleme bir tabak, kuyu yerleştirin.
    3. Çözümler B, C, D, E ve F 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.
    4. RGD-Cys-D1 dendrimer çözümleri yüzeylerde (2 mL/de) içeren wells doğrudan kullanarak 0,22-µm çapı filtre geçişi. Dendrimer konsantrasyonu başına en az üç yinelemeler tavsiye edilir. Kapatın ve plaka mühür ve oda sıcaklığında (RT) 16 h için bırakın.
    5. Kaldırmak ve çözümleri atın. Steril deiyonize su ile ve kuru yüzeylerde yıkayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın
      Not: Protokol burada duraklatılmış.

3. Denetim yüzeylerde hazırlanması

Not: Tüm adımları steril doku kültürü hood ve sadece steril malzemeler, çözümlerinde gerçekleştirilen ve teknikleri kullanılmıştır. En az altı yüzeylerde kullanılan (pozitif kontrol üç yineleme) ve negatif kontrol üç kopyaları kontrol.

  1. Bir doku kültürü başlık, onları 13 dk için UV ışığıyla irradiating yüzeylerde sterilize.
  2. Denetim yüzeylerde Fibroblast adezyon deney için.
    1. Alev komplementer Au(111) yüzeyler negatif kontrol kullanın. Altın Anti-hücre yapışkanlı özellikleri28confers bir iyi bilinen protein-denatürasyon etkiye sahiptir. Tüm çözümler solüsyon içeren temizleyicide ve substrat kuluçka önce filtre.
    2. Alev komplementer Au(111) yüzeylerde RGD-modified PEG thiol, Ac-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp-NH-ethylene glikol mono-11-mercaptoundecanamide (RGD-PEG-SH)30 ve triethylene glikol bir çözümde pozitif kontrol için bırakın Mono-11-mercaptoundecyl eter (PEG-SH) adlı bir 1: 100 molar oranı % 96'sı etanol RT. 16 h için
    3. Yüzeyler iyice etanol yıkayıp onları argon ile kurulayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın
  3. Denetim yüzeyler için Chondrogenesis.
    1. Bozulmamış PLLA yüzeyler negatif kontrol kullanın. Yüzey herhangi bir tedavi olmadan, PLLA canlı hücreler ile zavallı arabirim oluşturarak gösterir. 31
    2. Pozitif kontrollerin 5 mL serum fizyolojik (PBS) fosfat tamponlu 0.1 mg/mL fibronektin de hazırlamak ve her PLLA substrat 1.6 mL 1 h RT. fibronektin çözeltisi ile kuluçkaya
    3. Kaldırmak ve fibronektin çözüm atın ve yüzeylerde PBS ile yıkayın. Yüzeylerde 4 ° C'de depolayın

4. yüzey karakterizasyonu

  1. AFM görüntüleme
    1. PLLA yüzeylerde AFM görüntüleme için bir pürüzlülük çözümlemesi gerçekleştirin. Dendrimers 4-5 nm, pürüzlülük değerleri 1 çapında beri nm nanopatterns doğru görselleştirme için elde. Ayrıca, nanopatterns AFM görüntüleme gerçekleştirmek. Her iki durumda da hava modunda dokunarak AFM gerçekleştirin.
    2. Silikon konsol seçin bir bahar sürekli k = 40 N/m ve bir rezonans frekansı ν = 300 kHz ve AFM ekipman monte edin.
    3. Örnek Atomik kuvvet mikroskobu sahnede bağlayın. Aparatı up bağlı olarak ayarlama ve görüntüleme özellikleri farklı olabilir. Üreticinin el kitabı bakın.
    4. Örnek mikroskop ucu ile temas kadar yaklaşın.
    5. PLLA pürüzlülük analiz için görüntü için üç bağımsız yüzeylerde 20 x 20 µm substrat başına en az dört temsilcisi alanı seçin. Dendrimer nanopatterns resim, koşul (çözüm ilk dendrimer konsantrasyon) başına üç bağımsız yüzeylerde 5 × 5 mikron substrat başına en az üç temsilcisi görüntüleri seçmek için. Dendrimer katman görüntüleme sırasında zarar görmesini önlemek için en azından kuvvet tutmak için kullanılabilir ayar noktası ayarlayın.
      Not: Görüntüleme alanını seçim da piezoelektrik tarayıcı çalışma aralığına bağlıdır. Lütfen bu konuda araç kullanım kılavuzuna bakın.
    6. AFM yükseklik yaklaştırarak görüntüleri işlemi her işlevleri AFM cihaz üreticisine özel mülk yazılım kullanma tesviye polinom hattına inceden inceye gözden geçirmek ve bu yüzey pürüzlülüğü hesaplamak için PLLA analiz. Kök ortalama kare (RMS) analizi uygun bir seçenek sağlayabilir.
  2. Yerel RGD yüzey yoğunluğu ölçüm.
    1. Görüntü eşikleri işlenmiş AFM yükseklik görüntülerin yüzeyi dendrimers seçmek için edinin.
    2. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak parçacık konumları belirler ve en az interparticle mesafeler (ddk) elde etmek için kullanabilirsiniz.
    3. Dmin değerleri z ddkiçin olasılık kontur haritaları elde etmek için ilgili parçacık konumlara arsa. En yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu (ddk < 70 nm) bölgelerinde görselleştirmek için arsa renk ölçeğini ayarlama.
    4. Alan bölgelerin bir görüntü işleme yazılımı kullanarak en yüksek yerel RGD yüzey yoğunluğu ile ölçmek. Dendrimer toplamları alanlarında hesaplamaya dahil.
  3. STM görüntüleme.
    Not: STM görüntüleme sadece için nanopatterns iletken Au(111) yüzeyler üzerinde gerçekleştirilebilir. Ölçümler havada yapılır.
    1. Nanopatterned substrat yer STM ekipman örnek tutucu. Örnek ile sahibi arasındaki elektrik bağlantısı Sınayıcısı ile kontrol edin.
    2. Seçili sonda malzeme (i.e. ucu etch PT 0.8: Ir 0,2) başında STM ekipman uygun montaj sağlayan çapında. Gravür el ile kesme veya elektrokimyasal gravür tarafından gerçekleştirilebilir. 32
      Not: Elektrokimyasal gravür daha fazla simetrik ipuçları vermektedir.
    3. STM ekipman başkanı ipucunda bağlama ve örnek bağlanın.
    4. "Geribildirim kanalda geçerli" küme (bu tür ölçümü, geçerli bir geri bildirim ayarlama tarafından sürekli olacak). Önyargı voltaj ve geçerli ayar noktası ve ucu nişanlı bir kez de çözümlenmiş bir görüntü elde etmek için tarama boyutu ayarlayın.
      Not: Görüntüleme alanını seçim da piezoelektrik tarayıcı çalışma aralığına bağlıdır. Lütfen bu konuda araç kullanım kılavuzuna bakın.
    5. Polinom tesviye için her tarama satırı sığdırma tarafından STM topografik görüntüleri işlevleri STM cihaz üreticisine özel mülk yazılım kullanma işlemi.
  4. CA ölçümleri.
    1. Koşul (çözüm ilk dendrimer konsantrasyon) optik CA sistemle başına üç bağımsız yüzeyler üzerinde üç farklı pozisyonlarda sesil bırakma yöntem tarafından nanopatterned yüzeyler üzerinde ölçü CA.
    2. Microsyringe deiyonize su ile doldurun ve damla 1 µL üretmek için CA yazılımında parametreleri ayarlayın.
    3. Böylece örnek yüzeyinin açıkça görülebilir görüntüleme için bilgisayarda örnek sahne alanı'nda yerleştirin.
    4. Yüzeye yakın gelene micromanipulator şırınga taşımak ve damla yüzeyine dağıtmak. Kaydı hemen sonra damlacık sabitleme görüntü.
      Not: CA ölçümlerde bu tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için nem kontrol etmek çok önemlidir.
    5. CA cihaz üreticisine özel mülk yazılımla ölçülen CAs analiz. Uygun yöntemi kullanıcı gereksinimleri için ayarlanabilir. Eliptik uygun yöntem bir seçenek olabilir.

5. hücre kültürü

Not: Tüm adımları bir doku kültürü hood ve sadece steril malzemeler, çözümlerinde gerçekleştirilen ve teknikleri kullanılmıştır.

  1. Fibroblast adezyon deney.
    1. Kültür NIH 3T3 fare embriyonik fibroblastlar 37 ° C ve % 4.6 CO2 atmosfer Bazal ortamda erken pasajlar (< 10) üzerinden % 10 fetal sığır serum ile (FBS), takıma yüksek glikoz ile %1 L-glutamine, % 1 penisilin-streptomisin ve % 1 sodyum pyruvate (büyüme orta). T75 şişe toplam 500.000 hücre büyüme ortamının 10 mL şişeye başına tohum için tavsiye edilir.
    2. 2 günde bir 10 mL pipet ile eski orta kaldırın ve taze hazırlanmış büyüme orta 10 mL ile değiştirin.
    3. Kültür hücreler büyüme orta kadar %80 izdiham, sonra Kaldır orta ulaşmak ve tripsin şişe başına 5 mL ekleyin. Balonun altındaki uygun hücre dekolmanı emin olmak için 37 ° C'de 5 min için hücreleri temas tripsin çözüm korumak
    4. 5 mL şişe başına büyüme ortamının ekleyin ve bir santrifüj tüpü hücrelerde toplamak. 470 x g 5 dk. Kaldır, hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet büyüme orta 10 mL resuspend. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.
    5. Doku kültürü (yapışık olmayan) için tedavi değil tabak iyi yüzeylerde aktarın.
    6. 4.000 hücreler/cm2 büyüme Orta yoğunluk, yüzeylerde hücrelerdeyse tohum ve onları 4.5 h 37 ° C ve % 10 CO2 atmosfer için kuluçkaya.
  2. MSCs indüksiyon Chondrogenic.
    1. Kültür insan MSCs erken pasajlar üzerinden (< 5) 37 ° C ve % 4.6 CO2 atmosfer MSC büyüme orta. T75 şişe toplam 500.000 hücre büyüme ortamının 10 mL şişeye başına tohum için tavsiye edilir.
    2. Orta (5.1.2 içinde açıklandığı gibi) her 3 günde değiştirin.
    3. % 80 izdiham ulaştı ve santrifüj kapasitesi ve onları (5.1.3 içinde açıklandığı gibi) MSC büyüme aracı olarak resuspend önce hücreleri trypsinize. Bir hemasitometre kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.
    4. Hücreleri tekrar santrifüj kapasitesi ve onları 10 mL chondrogenesis-inducing orta resuspend.
    5. Yüzeylerde doku kültürü (yapışık olmayan) için tedavi değil yeni iyi tabak tabak aktarın. 3.000 hücreler/cm2yoğunluğu, yüzeylerde hücrelerdeyse tohum.
    6. Chondrogenic orta 3 günde (5.1.2 içinde açıklandığı gibi) değiştirin.

6. hücre fiksasyon ve Immunostaining

Not: Aşağıdaki adımları non-steril koşullarda gerçekleştirilir.

  1. Medyayı çıkarın ve hücreleri nazikçe PBS ile yıkayın. RT 20 dk için % 10 formalin çözüm ekleyerek düzeltmek
  2. Formalin kaldırmak ve PBS hücrelerle yıkayın.
  3. Serbest aldehit gruplarını PBS içinde bir 50 mM çözüm amonyum klorür (NH4Cl) ekleyerek engellemek. 20 dk RT. kaldırmak NH4Cl çözüm için hücre bıraktığınızdan ve PBS hücrelerle yıkayın.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. PBS mağaza örnekleri 4 ° C'de
  4. Ve saponin % 0,1 çözümünün engelleme çözümde (PBS %1 albümin) 10 dakika dik yıkamada PBS hücrelerle ekleyerek hücreleri permeabilize ve örnekleri için yeni bir iyi tabak transfer PBS çıkarın.
  5. Bir çözüm engelleme çözümde (Tablo 3) RT. 1 h için birincil antikorların hücrelerle kuluçkaya Daha sonra birincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS hücrelerle yıkayın.
  6. Kuluçkaya RT. 1 h için engelleme çözüm (Tablo 3) ikincil antikor içeren hücreler
    Not: ışık önlemek maruz kalma.
  7. İkincil antikor çözümü kaldırmak ve PBS ve kuru hücreleri yıkayın.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Örnekleri PBS karanlıkta 4 ° C'de depolayın.
  8. Örnek montaj için mikroskop gözlem: elmas uçlu kesici kullanarak, geçerli 50 µL 1,25 cm x 1,25 cm. orta örnekleri üzerine montaj mikroskopi coverslips oyulmuş ve onları hafifçe kesilmiş coverslips ile koruyun.
  9. Örnekler uygun bir alıcıya transfer, gözlem kadar alüminyum folyo ve mağaza içinde 4 ° C'de karanlık ile kapak.

7. hücre görüntüleme ve veri analizi

Not: opak Au(111) ve kalın microslide tabanlı yüzeyler için dik bir mikroskobu kullanılması gerekir.

  1. Fibroblast adezyon deney.
    1. Kullanım bir epifluorescence mikroskobu hedefleri bir dijital fotoğraf makinesi ve düşük (yani 10 X) ve yüksek (yani 40 X) büyütme ile donatılmıştır. Ölçümler havada gerçekleştirin.
    2. Örnek bir ultraviyole uyarma, Höchst/DAPI leke görselleştirmek için longpass emisyon filtre kullanarak 10 X amacı ile sahne ve görüntü hücre çekirdeği yerleştirin.
    3. Görüntü hücre sitoiskeleti ve odak yapışıklıklar (FAs) karşılık gelen antikor fluorochrome özellikleri ile eşleşen mikroskop filtre seçmek 40 X amacı ile.
    4. FA miktar için 8-bit görüntüleri dönüştürmek bir görüntü işleme yazılımı kullanın. İkili arka plan ve dönüştürmek resimlere bir eşik ayarlayarak kaldırın. En az 30 kare / örnek hesaplamak ve FAs 1 µm2 hesaplaması için düşünün.
  2. MSCs indüksiyon Chondrogenic.
    1. Görüntü hücre yoğunluğu chondrogenic indüksiyon (< 5 gün) ilk aşamalarında bir dijital fotoğraf makinesi ve düşük (Yani 10 X) ile donatılmış bir dik epifluorescence mikroskobu ile büyütme objektif. Höchst/DAPI leke görselleştirmek için ultraviyole uyarma ve longpass emisyon filtreyi kullanın.
    2. Yoğuşma alan ölçme, bir görüntü işleme yazılımı kullanın, görüntü 8 bit dosyalarına dönüştürmek, arka plan çıkarmak ve toplama kontur vurgular bir eşik seçin. Parçacıkların alanını hesaplamak.
    3. FAs, sitoiskeleti aktin iplikleri ve kıkırdak özgü kollajen tip II Alfa 1 (COL2A1) bir dik confocal mikroskobu yüksek büyütmede (yani 40-60 X) ile örnek immunostained. Bölümler temsilcisi aralığında (Yani 0.5 – 1 µm) toplamak.
    4. Yığın işlemek için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. 8-bit dosyaları için görüntüleri dönüştürmek, arka plan çıkarmak ve onları bir eşik ayarlayarak ikili olun. Üç bağımsız örneklerin koşul başına üç hücre yoğunluğu en az tedavi.
    5. Hücre yoğunluğu Bazal Bölge alanlarından lekeli SK protein ölçmek ve onlara karşılık gelen hücre çekirdeği görüntü sayısı bölü alanının yüzdesi olarak ifade eder.
    6. COL2A1 boyama ölçmek için öngörülen alan (örnek başına maksimum COL2A1 alanı) toplamı ölçmek ve confocal z-projeksiyonlar kullanın. Karşılık gelen yoğuşma alan karşı alınan alan değeri normalleştirmek.

8. kantitatif ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) analiz

Not: RNase kirlenmesini önlemek için tek kullanımlık, steril plastik eşya kullanın ve reaktifler ve RNA işlerken tek kullanımlık eldiven giymek. Her zaman uygun Mikrobiyolojik aseptik teknikler kullanmak ve bir uygun dekontaminasyon çözüm RNase kirlenme çalışma yüzeyleri ve santrifüjler ve Pipetler gibi olmayan tek öğeleri kaldırmak için kullanın.

  1. Toplam RNA yalıtmak ve onu bir RNA bozguncu ezmek. Dnaz örnekleriyle RNA tedavi ve cDNA sentez seti kullanarak cDNA dönüştürmek.
  2. QRT-PCR kuralları transkripsiyon faktörü SOX9primerler kullanılarak. Beta-2-Mikroglobulin (B2a) ve ribozomal protein L13a (RPL13a)-ebilmek var olmak kullanılmış temizlik genler.
  3. İfade düzeylerini hesaplama ve negatif kontrol (PLLA) karşı normalleştirmek.

Sonuçlar

Biz Nano (şekil 1) ele alınması gereken yüzey adhesiveness sağlayan bir nanopatterning yöntemi mevcut. RGD-Cys-D1 kimyasal yapısını şekil 1Aile gösterilir. Dendrimers elektrik iletken Au(111) yüzeylerde yüksek çözünürlük STM karakterizasyonu için desenli. Çözüm (en çok 10-5% w/w) konsantrasyonlarda düşük dendrimer 4-5 nm çapında (şekil 1B), daha yükse...

Tartışmalar

Açıklanan protokol geliştirilmesi sırasında birkaç kritik adım düşünülmelidir. İlk tarama prob mikroskobu teknikleri ile nanopattern karakterizasyonu anlamına gelir. Nanopatterns görselleştirmek için nerede desenlendirme üretilen Yüzey pürüzlülük değerinin altında civarındadır dendrimers ortalama çapı olması gerekir (şekil 1B) STM tarafından ölçülen 4 – 5 nm. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü STM görüntüleme için bu durumda Au(111) iletken yüzeylerde sınırlıd...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Oriol yazı tipi-Bach ve Albert G. Castaño ddk miktar onların yardım kabul edersiniz. Onlar da gelişmiş Digital mikroskobu birimi (IRB Barcelona) kendi tesislerinde video kaydetmek yazarlar izin Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde kabul. Bu eser ağ Biyomedikal Araştırma Merkezi (CIBER tarafından), İspanya desteklenmiştir. CIBER bir girişim VI Ulusal ar-ge & ben planı 2008-2011, bulunan INGENIO 2010, Consolider programı, CIBER eylemleri ve Instituto de tarafından Salud Carlos III, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu desteği ile finanse var. Bu eser üniversiteler ve araştırma departmanı yenilik, üniversiteler ve kurumsal Generalitat de Catalunya için komisyon tarafından desteklenen (2014 SGR 1442). Ayrıca OLIGOCODES (No projeler tarafından finanse edildi MAT2012-38573-C02) ve CTQ2013-41339-P, rekabet ve İspanyolca Ekonomi Bakanlığı tarafından Ayrıca INTERREG V-A İspanya-Portekiz 2014 2020 POCTEP (0245_IBEROS_1_E) için verilmiştir. C.R.P. İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet gücünü grant (No mali desteği kabul eder. IFI15/00151).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Gold (111) on mica. 1.4x1.1 cm Spi Supplies466PS-AB
Glass micro slides, plainCorning2947-75x25
Deionized waterMillipore18MΩ cm
Ethanol 96%PanReac131085.1212
L-Lactide/DL-Lactide copolymerCorbion95/05 molar ratio
1,4 - dioxaneSigma-Aldrich296309-1L
Silicone oil, high temperatureAcros Organics174665000
SpinnerLaurellWS-650MZ-23NPP/Lite
Tissue culture laminar flow hoodTelstarBio II AdvanceClass II biological safety cabinet
Filter unitMillex-GPSLGP033RB0.22 µm
Syringe 10 mLDiscardit309110
Atomic Force microscopeVeeco InstrumentsDimension 3000 AFM instrument
Silicon AFM probesBudget SensorsTap300AI-GResonant Freq. 300 kHz, k = 40 N/m
Scanning tunneling microscopeMolecular ImagingPicoSPM microscope
Pt0.8:Ir0.2 wireAdventPT671012Diameter 0.25 mm
WSxM 4.0 softwareNanotec electronica
Optical contact angle (CA) systemDataphysics
SCA20 softwareDataphysics
X-ray photoelectron spectrometerPhysical ElectronicsPerkin-Elmer PHI 5500 Multitechnique System
Fibronectin from bovine plasmaSigma-AldrichF1141-1MG1.0 mL solution
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS)Gibco21600-10Powder
Mouse embryo fibroblastsATCCATCC CRL-1658NIH/3T3
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) liquid high glucoseGibco11960044liquid high glucose, no glutamine, 500 mL
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000044500 mL
L-GlutamineInvitrogen25030200 mM (100X)
Penicillin-streptomycinInvitrogen15140
Sodium pyruvateInvitrogen11360039100 mL
T75 culture flasksNunclon156499
TrypsinLife Technologies252000720,25% EDTA
CentrifugeHermle LabortechnikZ 206 A
Non-tissue culture treated plate, 12 wellFalcon351143Non-adherent
Adipose-derived hMSCsATCCATCC PCS-500-011Cell vial 1 mL
MSC basal mediumATCCATCC PCS-500-030
MSC growth kitATCCATCC PCS-500-040Low serum
Chondrocyte differentiation toolATCCATCC PCS-500-051
Formalin solutionSigma-AldrichHT5011-15MLneutral buffered, 10%
Ammonium chlorideSigma-AldrichA9434-500Gfor molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5%
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-Ffor molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-50G
Rabbit monoclonal [Y113] anti-paxillin antibodyAbcamab32084Diluted 1:200
Mouse monoclonal [1F5] anti-collagen alpha-1 XX chain Acris AntibodiesAM00212PU-NDiluted: 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibodyInvitrogenA106672 mg/mL. Diluted 1:1000
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibodyInvitrogenA110362 mg/mL. Diluted 1:1000
Hoechst 33342Thermo FisherH3570 10ML10 mg/mL. Diluted 1:1000
Cover glass 24x24 mmDeltalabD102424
FluoromountSigma-AldrichF4680-25ML
Epifluorescence MicroscopeNikonEclipse E1000 upright microscopewith a CCD camera
Confocal MicroscopeLeica MicrosystemsLeica SPE Upright Confocal Microscope
ImageJ 1.50g freewarehttp://imgej.nih.gov/ij
MATLAB softwareThe MATHWORKS, Inc.
OriginPro 8.5 software OriginLab Coorporation

Referanslar

  1. Jiang, F., Hörber, H., Howard, J., Müller, D. J. Assembly of collagen into microribbons: Effects of pH and electrolytes. J. Struct. Biol. 148 (3), 268-278 (2004).
  2. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), 2243-2254 (2007).
  3. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biol. 27 (5), 451-461 (2008).
  4. Christman, K. L., Enriquez-Rios, V. D., Maynard, H. D. Nanopatterning proteins and peptides. Soft Matter. 2, 928-939 (2006).
  5. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  6. Arnold, M., et al. Activation of integrin function by nanopatterned adhesive interfaces. ChemPhysChem. 5 (3), 383-388 (2004).
  7. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Lateral spacing of integrin ligands influences cell spreading and focal adhesion assembly. Eur. J. Cell. Biol. 85 (3-4), 219-224 (2006).
  8. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys. J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  9. Arnold, M., et al. Cell interactions with hierarchically structured nano-patterned adhesive surfaces. Soft Matter. 5 (1), 72-77 (2009).
  10. Malmström, J., et al. Large area protein patterning reveals nanoscale control of focal adhesion development. Nano Lett. 10 (2), 686-694 (2010).
  11. Deeg, J. A., et al. Impact of local versus global ligand density on cellular adhesion. Nano Lett. 11 (4), 1469-1476 (2011).
  12. Medda, R., et al. Investigation of early cell–surface interactions of human mesenchymal stem cells on nanopatterned β-type titanium-niobium alloy surfaces. Interface Focus. 4, 20130046 (2014).
  13. Wang, X., et al. Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells. Biomaterials. 34 (12), 2865-2874 (2013).
  14. Wang, X., Ye, K., Li, Z. H., Yan, C., Ding, J. D. Adhesion, proliferation, and differentiation of mesenchymal stem cells on RGD nanopatterns of varied nanospacings. Organogenesis. 9 (4), 280-286 (2013).
  15. Wang, X., Li, S. Y., Yan, C., Liu, P., Ding, J. D. Fabrication of RGD micro/nanopattern and corresponding study of stem cell differentiation. Nano Lett. 15 (3), 1457-1467 (2015).
  16. Li, Z. H., et al. Effects of RGD nanospacing on chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. J. Mater. Chem. B. 3 (12), 5197-5209 (2015).
  17. Stephanopoulos, N., et al. Bioactive DNA-peptide nanotubes enhance the differentiation of neural stem cells into neurons. Nano Lett. 15 (1), 603-609 (2015).
  18. Rolland, O., Turrin, C. O., Caminade, A. M., Majoral, J. P. Dendrimers and nanomedicine: Multivalency in action. New J. Chem. 33, 1809-1824 (2009).
  19. Saovapakhiran, A., D’Emanuele, A., Attwood, D., Penny, J. Surface modification of PAMAM dendrimers modulates the mechanism of cellular internalization. Bioconjug. Chem. 20 (4), 693-701 (2009).
  20. Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral functionalization of dendrimers regulates internalization and intracellular trafficking in living cells. Bioconjug. Chem. 23 (5), 1059-1068 (2012).
  21. Mikhail, A. S., Jones, K. S., Sheardown, H. Dendrimer grafted cell adhesion peptide-modified PDMS. Biotechnol. Prog. 24 (4), 938-944 (2008).
  22. Kino-oka, M., Kim, J., Kurisaka, K., Kim, M. H. Preferential growth of skeletal myoblasts and fibroblasts in co-culture on a dendrimer-immobilized surface. J. Biosci. Bioeng. 115 (1), 96 (2013).
  23. Kim, M. H., et al. Morphological regulation and aggregate formation of rabbit chondrocytes on dendrimer immobilized surfaces with D-glucose display. J. Biosci. Bioeng. 107 (2), 196-205 (2009).
  24. Lomba, M., et al. Cell adhesion on surface patterns generated by the photocrosslinking of hyperbranched polyesters with a trisdiazonium salt. React. Funct. Polym. 73 (3), 499-507 (2013).
  25. Maheshwari, G., Brown, G., Lauffenburger, D. A., Wells, A., Griffith, L. G. Cell adhesion and motility depend on nanoscale RGD clustering. J. Cell Sci. 113 (Pt 10), 1677-1686 (2000).
  26. Kim, M. H., Kino-oka, M., Kawase, M., Yagi, K., Taya, M. Synergistic effect of D-glucose and epidermal growth factor display on dynamic behaviors of human epithelial cells. J. Biosci. Bioeng. 104 (5), 428-431 (2007).
  27. Pericet-Camara, R., Cahill, B. P., Papastavrou, G., Borkovec, M. Nano-patterning of solid substrates by adsorbed dendrimers. Chem. Commun. 3, 266-268 (2007).
  28. Lagunas, A., et al. Large-scale dendrimer-based uneven nanopatterns for the study of local arginine–glycine–aspartic acid (RGD) density effects on cell adhesion. Nano Res. 7 (3), 399-409 (2014).
  29. Lagunas, A., et al. Tailoring RGD local surface density at the nanoscale toward adult stem cell chondrogenic commitment. Nano Res. , (2017).
  30. Prats-Alfonso, E., et al. Effective and Versatile Strategy for the Total Solid-Phase Synthesis of Alkanethiols for Biological Applications. Eur. J. Org. Chem. 2013 (7), 1233-1239 (2013).
  31. Zhu, Y. B., Gao, C. Y., Liu, X. Y., He, T., Shen, J. C. Immobilization of biomacromolecules onto aminolyzed poly(L-lactic acid) toward acceleration of endothelium regeneration. Tissue Eng. 10 (1-2), 53-61 (2004).
  32. Güell, A., Díez-Pérez, I., Gorostiza, P., Sanz, F. Preparation of reliable probes for electrochemical tunneling spectroscopy. Anal. Chem. 76 (17), 5218-5222 (2004).
  33. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res. C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  34. De Lise, A. M., Fisher, L., Tuan, R. S. Cellular interactions and signaling in cartilage development. Osteoarthritis Cartilage. 8 (5), 309-334 (2000).
  35. Kosher, R. A., Kulyk, W. M., Gay, S. W. Collagen gene expression during limb cartilage differentiation. J. Cell Biol. 102 (4), 1151-1156 (1986).
  36. Biebricher, A., Paul, A., Tinnefeld, P., Golzhauser, A., Sauer, M. Controlled three-dimensional immobilization of biomolecules on chemically patterned surfaces. J. Biotechnol. 112 (1-2), 97-107 (2004).
  37. Tinazli, A., Piehler, J., Beuttler, M., Guckenberger, R., Tampé, R. Native protein nanolithography that can write, read and erase. Nat. Nanotechnol. 2, 220-225 (2007).
  38. Oberhansl, S., et al. Facile Modification of Silica Substrates Provides a Platform for Direct-Writing Surface Click Chemistry. Small. 8 (4), 541-545 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 131DendrimerNanopatternarginin glisin aspartik asit RGDAtomik Kuvvet Mikroskobu AFMh cre adezyonMezenkimal K k h cre MKHChondrogenesis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır