JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقنية جديدة لعرض مستضد السريع على سطح البكتيريا يرد، الذي ينطوي على سطح بيوتينيليشن يليه التعرض للبروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي. تحميل بي سي جي مع المستضدات المحدد بنجاح يحسن به الاستمناع، مما يوحي بأن الزخرفة السطحية يمكن استبدال النهج الوراثية التقليدية.

Abstract

الدرن (السل) هو مرض معد خطير وعصية M. bovis لقاح متوفر فقط لقاح السل (BCG) هو آمنة وفعالة للحماية ضد شديدة السل التهاب السحايا الأطفال وبعض أشكال السل نشرها، ولكن فشل لحماية ضد السل الرئوي، الذي هو الشكل الأكثر شيوعاً للمرض. استراتيجيات واعدة لتحسين BCG حاليا تعتمد أما على تحولها مع الجينات ترميز إيمونودومينانت م. السل (Mtb)-المستضدات محددة و/أو التكامل مع الجينات ترميز المشارك من العوامل التي تحفز مستضد عرض الخلايا. وتشمل القيود الرئيسية لهذه النهج كفاءة منخفضة ومنخفضة الاستقرار ومستوى سلامة ناقلات التعبير غير مؤكد. في هذه الدراسة، نقدم نهج بديل لتحسين اللقاح، الذي يتألف من التكامل بي سي جي مع البروتينات الخارجية ذات الاهتمام على سطح البكتيريا، بدلاً من التحول مع البلازميدات ترميز الجينات المقابلة. أولاً، يتم التعبير عن البروتينات ذات الاهتمام في الانصهار مع عبدين أحادي في معيار كولاي نظم التعبير وتستخدم بعد ذلك لتزيين سطح بيوتينيلاتيد بي سي جي. استخدام سطح BCG مزينة مستضد ovalbumin مركب التجارب على الحيوانات تبين أن بكتيريا معدلة مكسبه تماما وقادرة على استحثاث استجابات محددة T الخلية. بالإجمال، دعم البيانات المعروضة هنا بشدة الرواية والأسلوب كفاءة لإعادة تشكيل لقاح BCG الحالي الذي يحل محل النهج التقليدي شاقة للتكامل مع الأحماض النووية الخارجية.

Introduction

واقترحت استراتيجيات مختلفة ليحل محل لقاح السل الحالية ضد السل، بما في ذلك البروتين adjuvant النظم والتكنولوجيات فيكتوريد الفيروسية والموهنة الحية سلالات M.tb وسلالات السل المحورة وراثيا، أما إدخال جينات الإفراط معربا عن المستضدات السل التي لا يتم التعبير عنها بما فيه الكفاية خلال العدوى1 أو المواضيع المتميزة-المستضدات المحددة غير موجودة في البي سي جي2. الهندسة الوراثية، مع ذلك، يواجه العديد من العوائق، بما في ذلك مستوى السلامة وعملية تستغرق وقتاً طويلاً، وانخفاض كفاءة التعبير ناقلات4،5غير مؤكد. فيما يتعلق بتحسين BCG، مطلوب نهج بديلة لتحسين الاستمناع دون الحاجة للتغييرات الجينية غير مؤكد.

في هذه الدراسة، نقدم استراتيجية رواية لعرض بروتينات المؤتلف من الفائدة على سطح الخلية BCG يستند التفاعل المعروفة عالية تقارب avidin مع البيوتين. ويسمح هذا النهج مرفق السريع واستنساخه من عبدين المؤتلف الانصهار البروتينات على سطح بيوتينيلاتيد ضد السل، مما يسهل التلاعب الواسع للسل لتحقيق تحسين فعاليته القصوى مع الحفاظ على سلامتها ممتازة تسجيل، لوحظ على مدى عقود الاستخدام.

ألفه عبدين البيوتين مرتفعة للغاية (كد = 10−15 م) وحالما تتشكل، المجمع البيوتين-عبدين مستقرة جداً، ويمكن أن تتعطل فقط تحت ظروف6يشوه. ومع ذلك، لهذا النوع من التفاعل مثابة بديل أسلوب نقل جينات، عرض طويلة الأجل ولكن عكسها البروتينات المؤتلف مطلوب. وهكذا قدمنا هنا من عبدين أحادي تقارب منخفضة (كد = 10−7 م) أن يؤدي إلى الإفراج عن عكسها للبروتين من السطح زينت BCG بلعها مرة واحدة داخل مستضد عرض الخلايا. من أجل توفير دليل على المفهوم، قمنا باختبار هذا الأسلوب استخدام أحادي avidin بروتين تشيميريك تناظر مركب مستضد المستمدة من7،أوفالبومين (OVA)8. وأظهرت النتائج أن سطح الخلية BCG يمكن أن زينت بسهولة وسرعة مع البروتينات الانصهار avidin أحادي وأن هذا الربط إلى السطح BCG مستقرة واستنساخه بدون تغييرات لا يمكن اكتشافها في النمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة. أيضا، وجدنا أن BCG مزينة avidin أحادي تنصهر مع البويضات (أفيوفا) يمكن أن تحدث استجابة مناعية مشابهة لتلك الناجمة عن السل وراثيا معربا عن مستضد نفسه على حد سواء في المختبر و في فيفو. هذه التكنولوجيا لعرض عكسها للبروتينات للفائدة على سطح البكتيريا ولذلك هو بديل فعال للنهج نقل الجينات التقليدية ويمكن أن توفر منبرا للتلاعب الواسع للسل ومزيد من التطبيقات في اللقاحات التنمية.

Protocol

وأبقى على جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة برعاية الحيوان واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا البريطانية. تجارب وافق عليها العناية بالحيوان واستخدام اللجان وتنفيذها وفقا "المجلس الكندي للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان". هو عدد رعاية الحيوان ضمان A11-0247.

1-جيل بروتينات الانصهار Avidin أحادي التعبير عن البلازميدات

  1. دون استنساخ avidin أحادي التسلسل12 إلى بلازميد pDEST17 بين مواقع "مكافحة الإرهاب" و "جا" الذي يتوافق مع 133-134bp. (أيبين 6-هيستاج وموقع جزئ Attr1 pDEST17) للحصول على p17-أفي.
    ملاحظة: يتم عرض تسلسل الحمض النووي أحادي عبدين أدناه. تظهر الطفرات الثلاث في البرية من نوع أفيدين للحصول على أفيدين أحادي في الأحرف التي باللون الغامق.
    جككاجااجتجكتكج كتجاكتججا آتجاككا كجاتكتججك tccالمنسوجات والملابسأتجا ككاتكجججك تجتجاكاجك
    تكاكاجكاك أجاجتجات كتاكاتكاكا ككاكاتكاا جككجتاكاج تجاجاتكاا تجكاتججاك جاجتكاككاك
    أكاةبنالجنة التنسيق الإدارية أتكاكاجا جاكككاجكك كاككتتجك تكاككجتكا أتتجاجتت تكاجاجتكك أككاكتجتكت
    جتجكتكاتا تكاكججككا جاكاجاتج ككتجاجاكك جاجاغت أتجتجكتجك تجتاتجاك تجكجتكاج
    أتجتجاتج acأأأأععجك تاككاججتك جكاتكاكا تكتكاكتكج ككتجكجكاكا كاجاجاجت ألجأ
  2. تصميم كبسولة تفجير محاط بمواقع توريB1 و B2 توريالمقابلة للبويضات ببتيد757-1035 (-أب--و H-2_Kب-قيدت [ابيتوبس]) تسلسل الحمض النووي. يتم تسلسل التمهيدي: b1-البويضات توري
    B2-البويضات جججأكاجتتجتاكاااااجكاجكتتككتجاجكاجكتجاجاجتات وتوري
    جججأككاكتتجتاكاجااجكتغغتجتاكككتاككاككتكتكتجك. (B1توريوتسلسل b2 توريبالغامق).
    1. [بكر] تضخيم البويضات ببتيد757-1035 تسلسل الحمض النووي مع الإشعال أعلاه باستخدام بلازميد البويضات pUC57 كقالب.
    2. استنساخ منتجات PCR إلى 221 بدونر من خلال مواقع محددة في المختبر جزئ فعل (مثلاً، كلوناسي شركة بريتيش بتروليوم) للحصول على بدونر البويضات.
  3. نقل جينات الفائدة في p17-وافي استخدام رد فعل كلوناسي LR للحصول على p17-أفي-البويضات.
    ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل BP و LR جزئ الاستنساخ، راجع الدليل الخاص بالشركة المصنعة.

2-أحادي عبدين الانصهار البروتين التعبير وتنقية ريفولدينج

  1. تحويل BL21 كولاي بلازميد p17-أفي-البويضات وحمل 250 مل ثقافة BL21 كولاي مع إيبتج (0.1 M) ح 3 في 37 درجة مئوية.
  2. تحلل البكتيريا وإدراج الهيئات سولوبيليزيشن
    1. بيليه 250 مل المستحث BL21 الثقافة قبل 30 دقيقة من استخدام الطرد المركزي في 4000 x ز وعند 4 درجة مئوية.
    2. جمع الكريات في 10 مل من تحلل المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCL، 150 مم كلوريد الصوديوم، 6 م جوانيداين-HCL، الأس الهيدروجيني 1.5-2.5) واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية. تبني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على دوار.
    3. أجهزة الطرد المركزي 30 دقيقة بمبلغ 000 15 × ز و 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية.
  3. نق أفي-البويضات من المادة طافية (Solubilized إدراج الهيئات الكسر) باستخدام أعمدة ني-الإدارة الوطنية للسياحة.
    1. تمييع الهيئات إدراج 1:2 مع تحلل المخزن المؤقت.
    2. استخدام 4 مل راتنج ني-جاتا الواحدة 250 مل هيئات إدراج المستمدة من الثقافة.
    3. أغسل x 3 مع 10 مل من تحلل المخزن المؤقت (pH 7.0).
    4. الوتي مع 10 مل من شطف المخزن المؤقت (تحلل المخزن المؤقت pH 7.0 مع ايميدازول 250 ملم).
  4. ريفولد التيد البروتين بالتخفيف التدريجي (01:10) وفورتيكسينج السريع في تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.5) الذي يحتوي على 1 مم DTT، 200 ملم NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate)، 0.5 مم توين 80، ارجينين 500 مم، ومم 200 كلوريد الصوديوم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إزالة الملح وتبادل المخزن المؤقت ريفولديد البروتين من المخزن المؤقت تريس في برنامج تلفزيوني مع مركزات البروتين وفقا للبروتوكولات الخاص بالشركة المصنعة.
  6. إزالة الركام عن طريق الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة 3,500 ز خ وإلى 4 درجات مئوية، وتخزين مختبرين للبروتين للذوبان في-20 درجة مئوية.

3-بيوتينيليشن سطح الخلية BCG

  1. تنمو BCG في Middlebrook ح 7 مرق 9 مع 10% أوادك (حمض الأولييك، حل الزلال وسكر العنب) و 0.05% 80 توين في 37 درجة مئوية على منصة شاكر 50 لفة في الدقيقة حتى OD = 0.5-1.
    ملاحظة: BCG ممرض مستوى 2 السلامة البيولوجية وينبغي القيام بكل التجارب المتعلقة بالسل بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  2. أغسل 109 BCG 3 مرات مع 500 ميليلتر من الذيفان المثلج مجاناً برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1% Tween80 (ببست) (pH 8.0). تعليق بيليه BCG في الذيفان معقمة مجاناً برنامج تلفزيوني.
  3. فورا قبل الاستخدام، إعداد 1 مل 10 ملم البيوتين SS سالفو--دائرة الصحة الوطنية في تعقيم المياه التي تمت تصفيتها.
    1. احتضان البكتيريا مع 1 مل من 0.5 مم بيوتين SS سالفو--دائرة الصحة الوطنية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. يغسل البكتيريا المسماة 3 مرات مع 500 ميليلتر من ببست البارد المثلج لإزالة بيوتينيليشن غير رد فعل كاشف.
    1. إعادة تعليق بيليه في 1 مل ببست.
  5. لتقييم كفاءة بيوتينيليشن، وصمة عار 108 بيوتينيلاتيد بي سي جي مع ستريبتافيدين-فيتك (1: 100، 25 ميليلتر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    1. احتضان البكتيريا الملون في 1 مل 2% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم اختبر مستويات بيوتينيليشن بتحليل التدفق الخلوي.

4-النمط الظاهري للبكتيريا بيوتينيلاتيد: النمو والبقاء على قيد الحياة

  1. زراعة سلالات السل في Middlebrook ح 7 مرق 9 مع 10% أوادك (حمض الأولييك، حل الزلال وسكر العنب) و 0.05% 80 توين في 37 درجة مئوية على منصة شاكر 50 لفة في الدقيقة.
    1. تسجيل الكثافة البصرية (OD600) ثقافة البكتيرية لمدة 8 أيام.
  2. استخدام البي سي جي-لوك (9تم وصفه مسبقاً) للكشف عن بقاء البكتيريا في الضامة.
    1. تصيب الخلايا RAW264.7 مع بيوتينيلاتيد بي سي جي-لوك (موي 10:1) أو دون علاج السل-لوك (تحكم) والمحتضنة في 37 درجة مئوية على مدى 48 ساعة الفترة الزمنية.
    2. أغسل مونولاييرس الخلية وثم مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.025% على إطلاق سراح البكتيريا بلعها.
    3. قياس إنتاج الإضاءة الحيوية مع نظام الإنزيم لوسيفراس ولومينوميتير.
      ملاحظة: إشارة التﻷلؤ يدل على بقاء البكتيرية. الرجاء الرجوع إلى الدليل الخاص بالشركة المصنعة للحصول على تفاصيل من الإنزيم لوسيفراس.

5-ربط أحادي الانصهار Avidin البروتين على سطح BCG بيوتينيلاتيد

  1. مزيج 5 × 108 BCG بيوتينيلاتيد مع أفي-البروتين (10 ميكروغرام/مل النهائي في برنامج تلفزيوني-T) ح 1 في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر.
  2. البكتيريا الغسيل 3 مرات مع 500 ميليلتر ببست الباردة المثلجة ووصمة عار مع أرنب عبدين المضادة الأجسام المضادة (Ab) (تخفيف 1: 100، وصفه سابقا10) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ومن ثم مع فيتك مترافق الماعز الأرنب المضادة Ab مفتش في نفس الظروف.
  3. يغسل البكتيريا 3 مرات مع 500 ميليلتر من ببست وتحليلها بالتدفق الخلوي لتقييم مدى الزخرفة السطحية.

6-lyophilization Mycobacteria

  1. بيوتينيلاتي البكتيريا وفقا للخطوة 3، 1-3-4 ومعطف البكتيريا بيوتينيلاتيد مع أفي-البويضات وفقا للخطوة 5.1.
  2. بيوتينيلاتيد اليكووت والبكتيريا المغلفة (108) وتغسل ببرنامج تلفزيوني وإعادة تعليق في وسائل الإعلام ليوفيليزيشن 0.5 مل (المتوسطة ساوتون 25 ٪، 75 ٪ ح2س، و 1.5 في المائة غلوتامات Na).
  3. نقل البكتيريا إلى قارورة من الزجاج وتجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. ليوفيليزي قنينة الزجاج شغلها والمجمدة ح 24 استخدام تجميد مجفف.
  5. تخزين العينات المجففة في درجة حرارة الغرفة وإعادة تشكيل في برنامج تلفزيوني عند الحاجة.
  6. كرر الخطوة 3، 5 لتقييم بيوتينيليشن والسطح طلاء الاستقرار.

7-البلعمه بالانزيم

  1. تنمو خلايا بلعم 264.7 الخام في أطباق الثقافة قطرها 10 سم في دميم FCS 5% تحتوي على المتوسط، 1% لكل منهما للأم الجلوتامين والأحماض الأمينية غير الضرورية، والبنسلين وحبيس ستربتوميسين حتى كونفلوينسي 70-80%.
  2. البذور 2 × 106 264.7 الخام بلعم الخلايا في لوحة 6-جيدا. السماح بالالتزام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2الخلايا.
  3. توليد BCG دسريد مزينة (هو موضح سابقا9) أفي-البويضات (دسريد بي سي جي-أفي-البويضات) وفقا للخطوات 3.1 3.4 و 5.1.
  4. تصيب الخلايا الأولية مع دسريد بي سي جي-أفي-البويضات أو BCG دسريد غير المعالجة في وزارة الداخلية 20:1 عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  5. يغسل خلايا ثلاث مرات وتريبسينيزي باستخدام 1 مل من 0.25% التربسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة البكتيريا منفصلة جزئيا.
  6. إصلاح في 2.5% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني وتحليلها بالتدفق الخلوي.

8-داخل الخلايا الاتجار بالبويضات مزينة بيوتينيلاتيد BCG في الضامة

  1. مجهر الأسفار
    1. البذور 3 × 105 264.7 الخام بلعم الخلايا على كوفيرسليبس في صفيحة 24-جيدا. السماح بالالتزام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2الخلايا.
    2. تصيب الخلايا بلعم مع المتفطرة (موي 10:1) في صيانة وسائل الإعلام دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 4 إلى 24.
    3. تغسل الخلايا وتريبسينيزي لإزالة البكتيريا المرفقة، وعدم بلعها السطحية كما هو الحال في الخطوة 7، 5.
    4. الخلايا المصابة فيكس في 2.5% تليها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة يغسل 3 مع برنامج تلفزيوني.
    5. بيرميبيليزي الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لحظر/بيرميبيليزيشن (0.1% X-100 تريتون، جيش صرب البوسنة 3% في برنامج تلفزيوني) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      1. استخدام جسم معين للفائدة (مثلاً، أرنب avidin المضادة Ab) في 10 ميكروغرام/مل في بيرميبيليزيشن تليها المخزن المؤقت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جسم الثانوية (مثلاً، مفتش أرنب المضادة فيتك-الماعز) لمدة 20 دقيقة.
    6. أغسل الخلايا x 3 مع برنامج تلفزيوني، مرة بالماء، وجبل على الشرائح في 10 ميكروليتر المتوسطة تصاعد مائي والتقليل من فوتوبليتشينج الأسفار.
    7. دراسة الشرائح برقمي مجهرية [كنفوكل] استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مجهزة 63 x/1.4 هدف الخطة--أبوتشرومات. تسجيل الصور باستخدام كاميرا رقمية بالإضافة إلى برنامج المجهر.
  2. تلوين Immunogold والمجهر الإلكتروني
    1. البذور 2 × 106 264.7 الخام بلعم الخلايا في لوحات 6-جيدا.
    2. إصلاح الضامة المصابة BCG مع 4% منهاج عمل بيجين ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
    3. تغسل العينات مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    4. تضمين عينات في 4% نقطة انصهار منخفضة [اغروس]، ويذوي في الإيثانول 70%.
    5. نقل العينات إلى راتنج اﻷكريليك وبلمره في 50 درجة مئوية.
    6. قطع 60 نانومتر المقاطع مع مبضع وجمع الأقسام في شبكات النيكل.
    7. تسمية عينات مع 10 ميكروغرام/مل عبدين جسم ح 1 في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في حضانة الحل (BSA PBS و 0.1 في المائة)، ويغسل مع الاحتضان الحل مترافق الذهب F(ab')2 صغيرة جداً الماعز-مكافحة-الأرنب مفتش (1/20) عن ح 1 في الغرفة درجة الحرارة في حضانة الحل.
    8. أغسل المقاطع في الماء المقطر ووصمة عار في جلوتارالديهيدي 2% وتغسل مرة أخرى، الهواء الجاف وتفحص بالمجهر الإلكتروني.

9-الحيوانات التحصين ومعالجة الجهاز

ملاحظة: جميع الخطوات، وينبغي أن يتم في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.

  1. تمرير بيوتينيلاتيد وبروتين البكتيريا المغلفة من خلال 271/2ز إبرة 10 مرات لجعل تعليق خلية مفردة.
  2. 1 × 106 البكتيريا في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني خالية من الذيفان وتحصين من فئران C57BL/6 الإناث (-أب، ح 2 كب، 5-6 الأسبوع القديمة) تحت الجلد في القفا العنق.
    1. حقن الفئران التحكم مع 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني وحدها.
  3. Euthanize الفئران تحصينهم التحصين بعد 20 يوما من استنشاق2 CO متبوعاً بخلع عنق الرحم.
    1. عزل الطحال وتحويلها إلى وسائط الإعلام ربمي.
  4. تهرس الطحال من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مع المكبس حقنه 5 مل.
    1. يغسل مع 5 مل ربمي. أجهزة الطرد المركزي (800 x ز، 3 دقيقة) لعزل تعليق خلية مفردة.
    2. تستنفد ربك مع الماوس البيوتين التحديد إيجابية عدة مع البيوتين-Ter119/محمر خلايا Ab.
    3. أجهزة الطرد المركزي، وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل ربمي كاملة (FCS 10% و 1% لام الجلوتامين، البنسلين 1%، ستربتوميسين 1% و 50 ميكرومتر 2-لي).

10-أنا-أب تيترامير تلطيخ لتحديد الترددات CD4 محددة مستضد+ "خلايا تي" وتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا لتحديد الترددات من محددة مستضد "تي الخلايا الإفراج عن السيتوكينات" في "تحصين الحيوانات"

  1. تلوين تيترامير
    1. وصمة عار سبلينوسيتيس من التحكم والفئران المحصنين (~ 20 × 106 خلايا) مع PE مترافق-أب-البويضات323-339 tetramers (تمييع 1/12.5) ح 1 في 37 درجة مئوية في ربط المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع FCS 2% و 0.1% نان3).
    2. إضافة AF647 CD4 Ab (01:25)، وعاد 7 (للكشف عن الخلايا الميتة) إلى سبلينوسيتيس لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحليل العينات بالتدفق الخلوي.
    4. اكتساب 500,000 الأحداث في المنطقة CD4 إيجابية لتحديد تواتر الأحداث الإيجابية تيترامير.
      ملاحظة: مجموع سبلينوسيتيس تحددها بوصمة عار دوت SSC/منتدى التعاون الأمني، الخلايا الحية باستبعاد 7-عاد الأحداث الإيجابية، ومجموعات فرعية CD4 النابضة AF647 الأحداث الإيجابية.
  2. تواتر سيتوكين داخل الخلايا محددة مستضد الإفراج عن الخلايا T
    1. نقل نحو 1 × 107 سبلينوسيتيس إلى 4 مل متوسطة ربمي كاملة في اللوحات الست، حسنا مع أو بدون البويضات المؤتلف (10 ميكروغرام/مل) واحتضانها ح 16.
    2. علاج الخلايا مع بريفالدين أ (1:1، 000) 5 ساعات إضافية.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني وتخضع سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ كما يلي:
      1. وصمة عار عينات الخلايا مع PE-CD8 أو PE-Cy7-CD4 Ab (01:50 في المخزن المؤقت ملزم) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. إصلاح في 4% منهاج العمل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      3. بيرميبيليزي باستخدام حل بيرميبيليزيشن، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      4. غسل الخلايا والتسمية مع IFN-γ مترافق AF647 Ab (01:50) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. تغسل الخلايا وخاضعة لتحليل التدفق الخلوي كما هو موضح أعلاه.

النتائج

مع الإجراءات العامة المذكورة أعلاه، تم بحث جدوى BCG بيوتينيليشن السطحية والديكور مع مستضد مركب البويضات. كان الاستمناع للسل تم التعديل ثم اختبارها في فيفو. سطح البكتيرية وصفت بسهولة مع البيوتين للعرض السريع المستضدات عبدين تشيميريك دون أي تغييرات يمكن اكتشافها في ت?...

Discussion

أبلغنا في هذه الدراسة نهجاً غير وراثية للعرض السريع والفعال للبروتينات الخارجية على سطح BCG لإضافة مولدات معينة أو محددة الخصائص الفنية التي من المتوقع أن يحسن كفاءة الاستمناع للبكتيريا. أظهرنا أن سطح الخلية BCG يمكن بسهولة بيوتينيلاتيد للزخرفة السطحية لحظية مع عبدين الانصهار البروتينات. ?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور R ستوكس لسلالة البي سي جي باستير وطلال أ للدعم التقني. ونشكر أيضا جينسكريبت للمساعدة في تركيب الجينات.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Endotoxin-free RPMI 1640StemCell Technologies 36750
Sulfo-NHS SS biotinThermo Fisher 21328
FITC-conjugated streptavidinSigma-AldrichS3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer MBL International TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
AF647 rat anti-mouse IFN-gBD Bioscience 557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-EBD Bioscience 562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 552775
PE rat anti-mouse CD8 AbBD Bioscience 561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kbBD Bioscience562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibodyThermo Fisher31635
AF 647 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgGElectron Microscopy Sciences25100
Middlebrook 7H9 brothBD Diagnostic Systems271310
OADCBD Diagnostic SystemsB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 murine macrophage cell linesAmerican Type Culture Collection
pDEST17 plasmid Invitrogen11803012
pUC57-OVA plasmid GenScriptSD1176
BP clonase Invitrogen11789020
LR clonase Invitrogen11791043
pDONR221 plasmidInvitrogen12536017
Ni-NTA columns Qiagen31014
Pierce protein concentrators Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II epifluorescence microscopeCarl Zeiss Inc
CCD digital camera Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope FEI CompanyG2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer Thermo Fisher 87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit StemCell18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibodyBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kit BD Pharmingen554714
Bright-Glo Luciferase assay systemPromegae2620
Turner Biosystem luminometer PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 microtome Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 freeze dryerSavant Instruments NL 50
Wheaton boroscilicate glass vialsWheaton VWR 66011-675

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved