アビジン-ビオチン システムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現

要約

迅速抗原細菌表面に表示のための新たな手法を提示することで、単量体のアビジンとの融合に興味の蛋白質への暴露に続いて表面ビオチン化が含まれます。選択した抗原と BCG を正常に読み込み表面加飾が従来の遺伝的アプローチを置き換えることができますを示唆して、その免疫原性が向上します。

要約

結核 (TB)、深刻な感染症のみ利用可能なワクチンウシ細菌カルメットゲラン桿菌 (BCG) 安全かつ効果的なは、子供の深刻な TB の髄膜炎と播種性結核のいくつかのフォームの保護が保護するために失敗しました。肺の結核に対する病気の最も流行する形態であります。現在 BCG を改善する有望な戦略は結核 (Mtb)主要抗原遺伝子とその変換のいずれかを依存して-特定の抗原および/または抗原刺激する共同因子をコードする遺伝子と相補提示細胞。これらのアプローチの主要な制限には、低効率、低安定性、発現ベクターの安全性の不確実性のレベルが含まれます。本研究では対応する遺伝子をプラスミドに変換ではなく、細菌の表面に興味の外因性蛋白質と BCG の相補性から成っているワクチン改善する方法を提案する.標準的なエシェリヒア属大腸菌の単量体のアビジンと融合に興味の蛋白質を表現するまず、式システム、ビオチン化 BCG の表面を飾るために使用します。サロゲート卵白アルブミン抗原で飾られた BCG 表面を用いた動物実験では、変更された細菌は完全に免疫原性と特異的 T 細胞反応を誘導することができることを示しています。完全に、強くここに示すデータは外因性核酸を補完の面倒な従来の手法に代わる現在の BCG ワクチンは整形のため小説と効率的な方法をサポートします。

概要

現在の結核ワクチン BCG、遺伝子を導入する遺伝子組み換え BCG 株、弱毒ライブM.tb 、ウイルスのベクトル化技術タンパク質補助システムをどちらかなどを交換する様々 な戦略が提案されています。感染¹またはMtbの中に十分に表されない BCG 抗原発現-BCG²に特定の抗原が存在しません。遺伝子工学、しかし、安全、時間のかかるプロセス、および式ベクトル^4、5の低効率の不確実性のレベルを含む多くの障壁に直面しています。BCG を改善に関して不確かな遺伝的交替を必要とせず免疫原性を改善するために別のアプローチが必要です。

本研究では BCG 細胞表面ビオチンとよく知られている高親和性アビジン相互作用に基づく利息の組換え蛋白質の表示のための新たな戦略を紹介します。このアプローチにより、BCG は、その優れた安全性を維持しながら有効性の最大の改善を達成するために BCG の広範な操作を容易にビオチン化の表面に組換えアビジン融合蛋白質の迅速かつ再現可能な添付ファイル使用の十年にわたって観察を記録します。

ビオチンにアビジンの親和性が非常に高い (K_d = 10^{− 15} M) と構成、ビオチン-アビジン複合体は非常に安定と変化の条件⁶の下でのみ破壊することが。ただし、この種類の相互作用遺伝子転送メソッドの代替方法として、組換えタンパク質の長期的なリバーシブルの表示が必要です。したがって、我々 はここで低親和性単量体アビジンを紹介 (K_d = 10⁻⁷ M) 表面からのタンパク質の可逆的なリリースにリードがいったん抗原提示細胞内に取り込まれた BCG を装飾。コンセプトの証明を提供するために、我々 は卵白アルブミン (OVA)^7,8から派生したサロゲート抗原に対応する単量体アビジン キメラ蛋白質を使用してこのメソッドをテストしました。結果は、BCG 細胞表面飾ることができる簡単かつ迅速に単量体アビジン融合蛋白質と BCG の表面にこのバインドは安定して細菌の増殖や生存に検出可能な変更することがなく再現できることを示した。また、わかった OVA (AviOVA) と融合した単量体アビジンで飾られた BCG が類似する BCG による免疫反応を引き起こすことができる同じ抗原を遺伝子発現の in vitroとin vivoの両方。細菌の表面に興味の蛋白質の元に戻せる状態表示のこの技術は伝統的な遺伝子移転手法の効果的な代替と BCG の広範な操作とワクチンでさらにアプリケーションのプラットフォームを提供することができます。開発。

プロトコル

すべての動物は、動物のケアおよび使用委員会ブリティッシュ ・ コロンビアの大学によって承認されたプロトコルに従って維持されました。実験は動物ケアおよび使用委員会によって承認され、動物介護ガイドライン カナダ評議会によると実行します。動物保証福祉は A11 0247 です。

1. プラスミドを表現する単量体アビジン融合蛋白質の生成

1. サブ 133 に対応する"CTC"や"GAA"サイト間 pDEST17 プラスミドに単量体アビジン シークエンス¹²のクローン-134bp。 (すなわち、6 histag と pDEST17 Attr1組換えサイト間) p17 avi ファイルを取得します。
   注: 単量体アビジン DNA シーケンスを以下に示します。単量体アビジンを取得する野生型アビジンで導入された 3 つの突然変異は、太字の文字で表示されます。
   gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
   agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
   acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
   tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
   attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
2. 両脇にAttB1 とAttB2 サイト OVA ポリペプチド_757-1035に対応するプライマーを設計 (- A、^b-、H-2_K^b-エピトープを制限) DNA シーケンス。プライマー シーケンス: Attb1-卵子
   GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT とAttb2-卵子
   GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC。(Attb1 とAttb2 シーケンスが太字で表示される) です。
   1. PCR 増幅 OVA ポリペプチド_757-1035 DNA シーケンス テンプレートとして pUC57 OVA プラスミドを使用して上記のプライマー。
   2. サイト固有の in vitro再結合反応によって (例えば、BP Clonase) pDONR-卵子を取得する pDONR 221 に PCR の製品をクローンします。
3. P17 avi LR Clonase 反応を使用して p17 Avi 卵子を取得する興味の遺伝子を転送します。
   メモ: 組み変えのクローニング BP と LR の詳細については、製造元のマニュアルを参照してください。

2. 単量体アビジン融合タンパク質発現・精製・ リフォールディング

1. P17 Avi OVA プラスミドを大腸菌BL21 に変換し、37 ° C で 3 h の IPTG (0.1 M) と大腸菌BL21 文化の 250 mL を誘発します。
2. 細菌や封入体を可溶化の換散
   1. 4,000 x g と 4 ° C では遠心分離の 30 分の誘導 BL21 文化の 250 mL のペレットします。
   2. 換散バッファーの 10 mL にペレットを収集 (50 mM トリス-HCL、150 mM の NaCl、6 M グアニジン塩酸で pH 1.5 2.5) と 95 ° C で 15 分間インキュベートローテーターに室温で一晩インキュベートします。
   3. 15,000 × g と 4 ° C と上澄みで 30 分遠心分離します。
3. 清 (封入体を可溶化された分数) Ni NTA 列を使用してから Avi OVA を浄化します。
   1. 封入体の 1:2 の換散バッファーで希釈します。
   2. Ni NTA 樹脂封入体の文化由来の 250 mL あたり 4 mL を使用します。
   3. 10 ml の溶解バッファー (pH 7.0) の 3 倍を洗います。
   4. 10 mL の溶出バッファー (250 mM のイミダゾール換散バッファー 7.0 pH) で溶出します。
4. 希釈 (1:10) で溶出蛋白質のフォールディングとトリス緩衝液 (7.5) で急速なボルテックスを含む 1 mM DTT、200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate)、Tween 80 0.5 mM、500 mM アルギニン、室温で 30 分間 200 mM の NaCl。
5. デ塩、製造元のプロトコルに従ってタンパク質コンセントレーターと PBS に Tris バッファーからの蛋白質を refolded バッファー交換。
6. 3,500 × g 4 ° C で 30 分間遠心分離によって集計を削除し、-20 ° C で溶ける蛋白質の因数を格納

3. BCG 細胞表面ビオチン化

1. ミドルブ ルック 7 H で BCG を成長 9 スープ 10 %oadc (オレイン酸、アルブミンおよびブドウ糖のソリューション) と 0.05% Tween 80 外径まで 50 rpm でシェーカーのプラットフォーム上の 37 ° c = 0.5-1。
   注: BCG はバイオ セーフティ レベル 2 の病原体、バイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けで BCG をに関するすべての実験を行う必要があります。
2. 500 μ L の冷たいエンドトキシン無料 PBS プラス 0.1 %tween80 (pbst;) (pH 8.0) 10⁹ BCG 3 倍を洗います。滅菌エンドトキシン無料 PBS で BCG ペレットを中断します。
3. 使用直前に滅菌ろ過された水で 10 mM スルホ NHS SS ビオチンの 1 mL を準備します。
   1. 30 分間室温でスルホ NHS SS ビオチンの 0.5 mM の 1 ml の細菌を孵化させなさい。
4. ラベルの付いた細菌の非反応したビオチン化試薬を削除する冷たい pbst; アイス 500 μ L で 3 回洗います。
   1. 再 pbst; 1 mL にペレットを中断します。
5. ビオチン化効率を評価するために 20 分間室温で 10⁸ビオチン標識ストレプトアビジン FITC (1: 100, 25 μ L) と BCG を染色します。
   1. 2 %1 mL にステンド グラスの細菌を孵化させなさい室温で 20 分間 PFA、フローサイトメトリー分析によるビオチン化のレベルを調べます。

4. ビオチン抗酸菌の表現型: 成長および存続

1. ミドルブ ルック 7 H で BCG 株を成長 9 スープ 10 %oadc (オレイン酸、アルブミンおよびブドウ糖のソリューション) と 0.05% Tween 80 50 rpm でシェーカーのプラットフォーム上の 37 ° C で。
   1. 8 日間にわたって細菌文化の光学濃度 (OD₆₀₀) を記録します。
2. BCG リュック (上記⁹) を使用して、マクロファージの細菌の生存を検出します。
   1. ビオチン標識 BCG リュック (MOI 10:1) と RAW264.7 細胞に感染や BCG リュック (コントロール) を放置期間 48 h を 37 ° C で培養しました。
   2. 細胞膜を洗浄し、摂取した細菌を解放する 0.025 %sds 溶解します。
   3. 生物発光ルシフェラーゼ アッセイ システムとルミノ生産を測定します。
      メモ: 発光信号は、細菌の生存率を表しています。ルシフェラーゼ アッセイの詳細は、製造元のマニュアルを参照してください。

5. ビオチン BCG 表面に単量体のアビジン融合蛋白質の結合

1. シェーカーのプラットフォームに室温で 1 時間 Avi 蛋白質 (PBS T で最終 10 G/ml) と 5 x 10⁸ビオチン BCG をミックスします。
2. アイス冷たい PBST および汚れウサギ抗アビジン抗体 (Ab) (1: 100 希釈、前述¹⁰) 室温で 20 分間放置と FITC の 500 μ L で 3 回洗い細菌標識ヤギ抗うさぎ IgG Ab 同じ条件で。
3. PBST の 500 μ L で 3 回細菌を洗浄し、表面の装飾の程度を評価するためのフローサイトメトリーによる分析します。

6. 抗酸菌の凍結乾燥

1. Biotinylate 細菌ステップ 3.1 3.4 とコート ビオチン化細菌によると Avi OVA と 5.1 のステップによると。
2. 割り切れるビオチン化やコーティングされた細菌 (10⁸)、PBS で洗浄および再 0.5 mL 凍結乾燥媒体の中断 (1.5%、75% H₂O、25 %sauton 培地 Na グルタミン酸)。
3. ガラスの瓶に細菌を転送し、一晩-80 ° C のフリーザーで凍結します。
4. 凍結乾燥機を使用して 24 時間つぶしと冷凍ガラスバイアルを凍結乾燥します。
5. 常温乾燥のサンプルを格納し、PBS 必要なときに再構築します。
6. 3.5 ビオチン化及び表面の安定性を評価するための手順を繰り返します。

7. 食作用の試金

1. 70-80% の confluency まで DMEM 培地含む 5 %fcs、L-グルタミン、HEPES、非本質的なアミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンの各 1% の 10 cm 径培養皿で未加工 264.7 マクロファージ細胞は成長します。
2. 6 ウェル プレートで 2 x 10⁶未加工 264.7 マクロファージ細胞を播きます。37 ° C、5% CO₂で一晩接着細胞を許可します。
3. 生成した DsRed BCG 3.1 3.4 の手順および 5.1 によると Avi OVA (した DsRed BCG Avi OVA) で飾られた (前述した⁹)。
4. した DsRed BCG-avi ファイル-OVA またはモイ 20:1 37 ° C で 24 時間で治療した DsRed BCG と生細胞に感染します。
5. 血球を 3 回洗浄し、trypsinize 10 分の 37 ° C で 0.25% トリプシンの 1 mL を使用して部分的に切断の細菌を除去します。
6. 2.5% で修正室温で 20 分間 PBS で PFA。
7. PBS の 3 x を洗浄し、フローサイトメトリーで分析します。

8 マクロファージにおけるビオチン BCG を飾られた OVA の細胞内輸送

1. 蛍光顕微鏡
   1. 24 ウェル プレートで coverslips に 3 × 10⁵ RAW 264.7 マクロファージ細胞を播きます。37 ° C、5% CO₂で一晩接着細胞を許可します。
   2. 抗酸菌 (MOI 10:1) 保守メディアの 37 ° C および 4 に 24 h の 5% CO₂で抗生物質なしでマクロファージ細胞に感染します。
   3. 細胞を洗浄し、ステップ 7.5 のように表面の添付、非摂取の細菌を除去する trypsinize。
   4. 2.5% で修正感染細胞室温で 20 分間 PBS で PFA は PBS の 3 洗浄が続きます。
   5. ブロック/透過バッファー内セルを permeabilize (0.1% トリトン X-100、PBS で 3 %bsa) 室温で 20 分間。
      1. 興味の特定の抗体を使用 (例えば、ウサギの反アビジン Ab) で透過に 10 μ g/mL 室温で 20 分間バッファーは続いて 20 分間 (例えば、FITC ヤギ抗うさぎ IgG) 二次抗体。
   6. 洗浄は、一度水との蛍光退色を最小限に抑えるため水土台媒体の 10 μ L のスライド マウント、pbs 3 x を細胞します。
   7. 63 x を搭載した落射蛍光顕微鏡を用いたデジタル共焦点顕微鏡によるスライドを調べる/1.4 計画アポクロマート目的。顕微鏡のソフトウェアに結合するデジタル カメラによる画像を記録。
2. 免疫染色や電子顕微鏡
   1. 6 ウェル プレートで 2 x 10⁶未加工 264.7 マクロファージ細胞を播きます。
   2. 4% と BCG 感染したマクロファージを修正 PFA 部屋の温度で 4 時間。
   3. サンプルを PBS で 2 回洗います。
   4. 4% 低融点アガロースに試料を埋め込むし、70% のエタノールの脱水します。
   5. アクリル樹脂にサンプルを転送し、50 ° C で重合
   6. ミクロトームで 60 nm のセクションをカットし、ニッケル グリッドのセクションを収集します。
   7. 1 時間室温でまたは孵化ソリューション (PBS と 0.1 %bsa) で一晩 4 ° C 10 G/ml アビジン抗体サンプルのラベルし、インキュベーション ソリューション金共役 F(ab')₂の超小型ヤギ抗うさぎを洗う部屋で 1 時間 (1/20) を IgG培養液の温度。
   8. 蒸留水のセクションを洗浄、2% グルタルアルデヒドで染色、乾燥、空気をもう一度、洗浄、電子顕微鏡で調べる。

9. 動物の予防接種と臓器処理

注: すべての手順はバイオ セーフティ キャビネットでされるべきであります。

1. パス ビオチン化タンパク質コーティングと細菌 27_1/2G 針を通して 10 倍単一細胞懸濁液を作成します。
2. 1 x 10⁶細菌のエンドトキシン PBS 100 μ l を取り、首の首筋で皮下の C57BL/6 女性なマウスを (- A^bH 2 K^b5-6 週齢) を接種します。
   1. 単独で PBS 100 μ l/マウス コントロールを挿入します。
3. 頚部転位続いて CO₂吸入による免疫マウス 20 日後予防接種を安楽死させます。
   1. 脾臓を分離し、RPMI メディアに転送します。
4. 5 mL シリンジのプランジャーを 70 μ m セル ストレーナー脾臓をマッシュ アップします。
   1. RPMI 5 mL で洗浄します。遠心分離機 (800 x g、3 分) 単一細胞懸濁液を分離します。
   2. マウス ビオチン ビオチン Ter119/赤芽球系細胞 Ab 正の選択キットと赤血球を破壊します。
   3. 完全な RPMI (10% FCS 1 %l-グルタミン ペニシリン 1%、1% ストレプトマイシン、50 μ M 2 ME) の 10 mL の遠心分離と再中断セルします。

10. 私の^b四量体を決定する周波数の抗原特異的 cd 4⁺ T 細胞と細胞内サイトカイン染色決定周波数の抗原特異的 T 細胞解放サイトカインは、免疫動物の染色

1. 四量体染色
   1. コントロールと免疫マウス (10 の⁶セル × 20 ~) PE 共役-A^bからの脾細胞を染色-OVA_{323 339}テトラマー (1/12.5 希釈) 結合バッファー (2% の FCS と 0.1% ナン₃PBS) で 37 ° C で 1 時間。
   2. 室温で 20 分間脾細胞に AF647 CD4 Ab (1:25) と (死んだ細胞を検出) するため 7 AAD を追加します。
   3. フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。
   4. テトラマー肯定的なイベントの頻度を決定する CD4 陽性地域で 500,000 個のイベントを取得します。
      注: 合計脾細胞によって定義されます SSC/FSC ドットしみ 7 AAD 肯定的なイベントの除外によって生きている細胞および CD4 サブセット AF647 肯定的なイベントのゲートによって。
2. T 細胞抗原特定の細胞内サイトカインの頻度
   1. 6 ウェル プレート組換え卵子の有無で完全 RPMI 培地 4 mL に転送約 1 × 10⁷脾細胞 (10 μ G/ml)、16 時間インキュベートします。
   2. さらに 5 時間ブレフェルジン A (1:1, 000) で細胞を治療します。
   3. PBS であり、次のように染色細胞内サイトカインを洗います。
      1. 30 分間室温で PE CD8 や PE Cy7 CD4 Ab (1:50 結合バッファーで) 細胞検体を染色します。
      2. 修正 4% PFA 20 分間室温で。
      3. 製造元の指示に従って透過ソリューションを使用してを permeabilize します。
      4. 室温でセルと 20 分間 AF647 共役 IFN-γ Ab (1:50) のラベルを洗います。
      5. 細胞を洗浄し、上記フロー フローサイトメトリー解析対象します。

結果

一般的な手順で上記、BCG 表面ビオチン化及びサロゲート抗原 OVA が付いている装飾の可能性を検討しました。当時の変更された BCG 免疫原性in vivoをテストします。細菌の表面は、アビジン キメラ抗原細菌の表現型の検出可能な変更なしの急速な表示のためのビオチンが簡単に付いていた。結果の変更された BCG 抗原提示細胞によって効率的に摂取され、マウス?...

ディスカッション

私たちはこの研究で BCG 面上特異抗原または細菌の免疫原性を効率的に改善するために期待される機能の特定のプロパティを追加する外因性タンパク質の迅速かつ効果的なディスプレイのための非遺伝的アプローチを報告しました。BCG 細胞表面ができる簡単にビオチン標識アビジン融合蛋白質と瞬時の表面装飾のデモンストレーションを行った。形質転換と肯定的なクローンの選択 2 ~ 3ヶ月?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endotoxin-free RPMI 1640	StemCell Technologies	36750
Sulfo-NHS SS biotin	Thermo Fisher	21328
FITC-conjugated streptavidin	Sigma-Aldrich	S3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer	MBL International	TS-M710-1
7-AAD	BD Pharmingen	559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin	Clontech	635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	557681
AF647 rat anti-mouse IFN-g	BD Bioscience	557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-E	BD Bioscience	562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	552775
PE rat anti-mouse CD8 Ab	BD Bioscience	561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kb	BD Bioscience	562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibody	Thermo Fisher	31635
AF 647 rat anti-mouse CD4	BD Bioscience	557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG	Electron Microscopy Sciences	25100
Middlebrook 7H9 broth	BD Diagnostic Systems	271310
OADC	BD Diagnostic Systems	B11886
Tween 80	Sigma-Aldrich	P1379
RAW 264.7 murine macrophage cell lines	American Type Culture Collection
pDEST17 plasmid	Invitrogen	11803012
pUC57-OVA plasmid	GenScript	SD1176
BP clonase	Invitrogen	11789020
LR clonase	Invitrogen	11791043
pDONR221 plasmid	Invitrogen	12536017
Ni-NTA columns	Qiagen	31014
Pierce protein concentrators	Thermo Fisher	88527
Flurosave	Calbiochem-Novabiochem	345789
Axioplan II epifluorescence microscope	Carl Zeiss Inc
CCD digital camera	Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope	FEI Company	G2 200Kv
70μm Falcon cell strainer	Thermo Fisher	87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit	StemCell	18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody	BioLegend	116203
Brefeldin A	BD Pharmingen	555029
Cytofix/Cytoperm kit	BD Pharmingen	554714
Bright-Glo Luciferase assay system	Promega	e2620
Turner Biosystem luminometer	Promega	TD-20/20
Leica EM UC6 microtome	Leica Microsystems	UC6
Novalyphe NL 500 freeze dryer	Savant Instruments	NL 50
Wheaton boroscilicate glass vials	Wheaton	VWR 66011-675