JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז'ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.

Abstract

השחפת (TB) היא מחלה זיהומית קשה, חיסון זמין רק מ חיידקי סטרפטקוקוס בוביס bacillus Calmette-Guérin (BCG) הינו בטוח ויעיל להגנה נגד חמור טרה-בתים דלקת קרום המוח ילדים, כמה צורות של המופץ טרה-בתים, אך אינו מצליח להגן נגד שחפת, וזו הצורה השכיחה ביותר של המחלה. מבטיח אסטרטגיות לשיפור BCG כעת להסתמך גם על השינוי שלה עם הגנים קידוד immunodominant מ. שחפת (Mtb)-אנטיגנים ספציפיים ו/או קומפלמנטציה עם הגנים קידוד שיתוף גורמים המעודדים אנטיגן הצגת תאים. מגבלות הגדולות גישות אלה כוללים יעילות נמוכה, יציבות נמוכה לרמת הבטיחות של וקטורים ביטוי לא בטוח. במחקר זה, אנו מציגים גישה אלטרנטיבית לשיפור החיסון, אשר מורכב קומפלמנטציה BCG עם חלבונים אקסוגני של עניין על פני השטח של חיידקים, במקום טרנספורמציה עם פלסמידים קידוד הגנים המתאימים. ראשית, חלבונים עניין באים לידי ביטוי פיוז'ן עם אבידין monomeric ב רגיל e. coli מערכות ביטוי אז נהגו לקשט את פני השטח של biotinylated ה-BCG. ניסויים בבעלי חיים באמצעות משטח BCG מעוטרים עם הפונדקאית אובלבומין אנטיגן מדגימים כי החיידק ששונה הוא מלא immunogenic, מסוגל גרימת תגובות תא T ספציפי. בסך הכל, הנתונים המוצגים כאן בחום תמיכה של הרומן שיטה יעילה לשינוי הצורה של החיסון BCG הנוכחי מחליף את הגישה המקובלת מפרך של קומפלמנטציה עם חומצות גרעין אקסוגני.

Introduction

אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להחליף את החיסון הנוכחי שחפת BCG, כולל חלבון אדג'וונט מערכות, טכנולוגיות הווקטורי ויראלי, זנים M.tb בשידור חי הקלוש של זנים מהונדסים BCG, גם להחדיר גנים יתר ביטוי אנטיגנים BCG באים לא מספיק לידי ביטוי במהלך זיהום1 או שחרור מהיר למוט אוכף-אנטיגנים ספציפיים מציג BCG2. עם זאת, הנדסה גנטית, פונה מחסומים רבים כולל רמת לא בטוח בטיחות התהליך זמן רב, יעילות נמוכה של הביטוי וקטורים4,5. לגבי שיפור BCG, גישה חלופית יש צורך לשפר את immunogenicity ללא צורך מסעה גנטי לא בטוח.

במחקר זה, נסקור אסטרטגיה הרומן לתצוגה של חומרים מעניינים על פני תא ה-BCG מבוססת על האינטראקציה ידועים אבידין גבוהה-זיקה עם ביוטין. גישה זו מאפשרת מצורף מהיר ולא לשחזור של recombinant אבידין פיוז'ן חלבונים על פני השטח של biotinylated BCG, אשר מקלה על מניפולציות רחבה של BCG כדי להשיג שיפור מקסימלי של יעילותה תוך שמירה על בטיחות מעולה שלה שיא, שנצפה במשך עשרות שנים של שימוש.

אבידין אהדה ביוטין הוא גבוה מאוד (Kd = 10−15 מ'), לאחר שהוקמה, המתחם ביוטין-אבידין יציב מאוד, רק יכול להיות משובשות תחת denaturing תנאים6. עם זאת, עבור סוג זה של אינטראקציה לשמש חלופה שיטה של העברת גנים, התצוגה לטווח ארוך אבל הפיכה של חומרים נדרש. לפיכך, הצגנו כאן אבידין monomeric של זיקה נמוכה (Kd = 10−7 ז) כי הפניות שחרור הפיך של חלבון מהמשטח מעוצבים BCG בלע פעם אחת בתוך אנטיגן הצגת תאים. כדי לספק הוכחה של המושג, בדקנו בשיטה זו באמצעות חלבון chimeric monomeric אבידין המתאים אנטיגן הפונדקאית נגזר אובלבומין (פשוט)7,8. התוצאות הראו כי השטח תא BCG ניתן בקלות, במהירות מעוטר אבידין monomeric פיוז'ן חלבונים, כי איגוד זה השטח BCG הינה יציב לשחזור וללא שינוי לזיהוי התפתחות חיידקים והישרדות. בנוסף, מצאנו BCG מעוטר monomeric אבידין התמזגו עם ביצית (AviOVA) יכול לגרום תגובה חיסונית הדומה לזה הנגרם על ידי BCG גנטית לבטא אותו אנטיגן גם במבחנה וגם בתוך vivo. טכנולוגיה זו תצוגה הפיך של חלבונים עניין על פני חיידקי ולכן הוא תחליף יעיל של גישות העברת גנים מסורתיים, מספקים פלטפורמה מניפולציות רחבה של BCG ויישומים נוספים בחיסון פיתוח.

Protocol

כל בעלי החיים היו נשמרים על פי פרוטוקולים אושרה על ידי חיה אכפת ועדות שימוש ב אוניברסיטת בריטיש קולומביה. הניסויים היו אושרה על ידי חיה אכפת לי להשתמש ועדות, שבוצעה על פי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים. המספר רווחת בעלי חיים אבטחת הוא A11-0247.

1. דור של חלבונים פיוז'ן אבידין Monomeric לבטא פלסמידים

  1. תת לשבט monomeric אבידין רצף12 לתוך פלסמיד pDEST17 בין האתרים "CTC", "גה" המתאים 133-134bp. (כלומר, בין 6-histag pDEST17 Attr1 רקומבינציה האתר) כדי להשיג p17-Avi.
    הערה: רצף הדנ א אבידין monomeric מוצגת להלן. שלוש מוטציות שהוצגה בפראי-סוג אבידין להשיג אבידין monomeric מוצגים תווים מודגשים.
    gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
    agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
    acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
    tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
    attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga
  2. עיצוב תחל תמר מוקף עם AttB1 ו- AttB2 אתרים המתאימים ביצית מפוליפפטיד757-1035 (-Ab- ו H-2_Kb-מוגבל epitopes) רצף ה-DNA. פריימר רצפים הם: Attb1-ביצית
    GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT ו- Attb2-ביצית
    GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC. (Attb1 ו- b2 Attרצפים הם מודגשים).
    1. להגביר את-PCR ביצית מפוליפפטיד757-1035 רצף ה-DNA עם תחל לעיל באמצעות פלסמיד pUC57-ביצית כתבנית.
    2. לשכפל את המוצרים PCR לתוך pDONR-221 דרך בייעודי לאתר במבחנה רקומבינציה לתגובה (למשל, BP Clonase) כדי לקבל pDONR-ביצית.
  3. להעביר את הגן עניין p17-Avi באמצעות התגובה LR Clonase כדי להשיג p17-אבי-ביצית.
    הערה: לקבלת פרטים של BP וחברת LR רקומבינציה שיבוט, עיין במדריך של היצרן.

2. monomeric אבידין פיוז'ן חלבון ביטוי, טיהור, Refolding

  1. להפוך פלסמיד p17-אבי-ביצית BL21 e. coli , זירוז 250 מ של e. coli BL21 תרבות עם IPTG (0.1 M) עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
  2. פירוק של חיידקים, הכללה גופות Solubilization
    1. גלולה 250 מ של תרבות BL21 המושרה על ידי 30 דקות של צנטריפוגה ב 4000 x g ו ב 4 ° C.
    2. לאסוף כדורי 10 מ"ל של פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCL, 150 מ מ NaCl, 6 מ' Guanidine-HCL, pH 1.5-2.5) דגירה למשך 15 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס. דגירה ללילה בטמפרטורת החדר על מסובב.
    3. צנטריפוגה 30 דקות ב- 15,000-g ו 4 ° C ותגובת שיקוע לאסוף.
  3. לטהר אבי-ביצית של תגובת שיקוע (שבר Solubilized גופות הכללה) תוך שימוש בעמודות Ni-נ. ת.
    1. לדלל הכללה גופות 1:2 עם פירוק מאגר.
    2. השתמש 4 מ"ל של ני-נ שרף לכל 250 מ של תרבות-derived גופים הכללה.
    3. רחץ 3 x 10 מ של פירוק מאגר (pH 7.0).
    4. Elute עם 10 מ"ל • תנאי מאגר (פירוק מאגר pH 7.0 עם 250 מ מ imidazole).
  4. לקפל את החלבון eluted על ידי דילול הדרגתי (1:10), vortexing מהירה במאגר טריס (pH 7.5) המכיל 1 מ מ DTT, 200 מ"מ NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate), 0.5 מ מ Tween 80, ארגינין 500 מ מ ו-200 מ מ NaCl למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מבטל את מלח, מאגר exchange refolded חלבון מהמאגר טריס לתוך PBS עם ריכוז חלבון על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  6. הסר אגרגטים על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב- 3,500 x g וב -4 ° C, ולאחסן את aliquots של חלבון מסיס ב-20 ° C.

3. Biotinylation משטח BCG תא

  1. לגדול BCG של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד עד OD = 0.5-1.
    הערה: BCG הוא. חיידק רמה 2 אבטחה, כל ניסויים הנוגעים BCG צריך להיעשות על אבטחה של ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.
  2. רחץ 109 BCG 3 פעמים עם 500 µL של PBS חינם אנדוטוקסין כקרח בתוספת 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). להשעות BCG גלולה ב- PBS חינם אנדוטוקסין סטרילי.
  3. מיד לפני השימוש, להכין 1 מ"ל של 10 מ מ Sulfo-NHS SS ביוטין במים מסוננים סטרילי.
    1. דגירה חיידקים עם 1 מ"ל של 0.5 מ מ של האס. אס Sulfo-NHS ביוטין בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. רחץ חיידקים שכותרתו 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר כדי להסיר ריאגנט biotinylation לא הגיב.
    1. מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBST.
  5. כדי להעריך את יעילות biotinylation, כתם8 10 biotinylated BCG עם Streptavidin-FITC (1: 100, 25 µL) בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
    1. דגירה חיידקים ויטראז'ים ב מ 1 ל 2% מחברים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בדוק רמות של biotinylation על ידי ניתוח cytometry זרימה.

4. ותפקיד של Biotinylated Mycobacteria: צמיחה והישרדות

  1. לגדול BCG זנים של מידלברוק 7H 9 מרק עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין פתרון דקסטרוז) ו- 0.05% Tween 80 ב 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה שאכר ב-50 סל ד.
    1. להקליט את צפיפות אופטית (OD600) של התרבות חיידקי במשך תקופה 8 ימים.
  2. השתמש BCG-לוק (שתואר לעיל9) כדי לזהות הישרדות של חיידקים מקרופאגים.
    1. להדביק תאים RAW264.7 עם biotinylated BCG-לוק (MOI 10:1) או מטופל BCG-לוק (בקרה), מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס מעל 48 שעות תקופת זמן.
    2. לשטוף תא monolayers ואת lyse ואז עם 0.025% מרחביות לשחרר חיידקים בלע.
    3. מדד הייצור ביולומינסנציה עם לוציפראז assay מערכת luminometer.
      הערה: הפריה חוץ גופית אות היא מעידה על יכולת הקיום חיידקי. נא עיין במדריך של היצרן לקבלת פרטים של לוציפראז וזמינותו.

5. איגוד של חלבון Monomeric אבידין-Fusion למשטח BCG Biotinylated

  1. מערבבים 5 x 108 biotinylated BCG עם אבי-חלבון (סוף μg/מ"ל ב- PBS-T) לשעה בטמפרטורת החדר בפלטפורמה בשייקר.
  2. שטיפת חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST קר קר, הכתם עם הארנב אנטי-אבידין נוגדנים (אלב) (דילול מטריים, שתואר לעיל10) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן עם FITC מצומדת עז ארנב אנטי איג Ab באותם התנאים.
  3. לשטוף חיידקים 3 פעמים עם 500 µL של PBST ולנתח על ידי cytometry זרימה כדי להעריך את היקף השטח קישוט.

6. lyophilization של Mycobacteria

  1. Biotinylate חיידקים על פי 3.1-3.4 שלב biotinylated מעיל חיידקים עם אבי-ביצית לפי שלב 5.1.
  2. Aliquot biotinylated וחיידקים מצופה (108), לשטוף עם PBS ו להשעות מחדש בתקשורת lyophilization 0.5 mL (25% Sauton בינוני, 75% H2O ו- 1.5% Na-גלוטמט).
  3. להעביר חיידקים צלוחיות זכוכית ומקפיאים במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. Lyophilize זכוכית מלא וקפוא vials 24 שעות ביממה באמצעות הקפאת מייבש.
  5. לאחסן דגימות מיובשים בטמפרטורת החדר, לשקם ב- PBS בעת הצורך.
  6. חזור על שלב 3.5 להעריך biotinylation, משטח ציפוי יציבות.

7. phagocytosis Assay

  1. לגדול 264.7 גלם תאי מקרופאג במנות תרבות בקוטר 10 ס מ ב- DMEM 5% בינוני FCS המכיל, 1% כל-גלוטמין, HEPES, חומצות אמינו שאינן הכרחיות, ו פניצילין, סטרפטומיצין עד 70-80% confluency.
  2. זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים בצלחת 6-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
  3. צור DsRed BCG (שתואר לעיל9) מעוצבים עם אבי-ביצית (DsRed BCG-אבי-פשוט) על-פי השלבים 3.1-3.4 ו- 5.1.
  4. להדביק תאים גולמי עם DsRed BCG-אבי-ביצית או BCG טיפול DsRed-MOI 20:1 במשך 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.
  5. רוחצים תאים שלוש פעמים את trypsinize באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להסיר את החיידקים מנותקת חלקית.
  6. לתקן ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. 3 x עם PBS וקונטה לנתח ידי cytometry זרימה.

8. וגדילת של ביצית מעוצבים Biotinylated BCG ב מקרופאגים

  1. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
    1. זרע 3 x 105 264.7 גלם תאי מקרופאג על coverslips לתוך צלחת 24-. טוב. לאפשר תאים לדבוק בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
    2. להדביק תאי מקרופאג עם mycobacteria (MOI 10:1) בתקשורת תחזוקה ללא אנטיביוטיקה-37 ° C ו- 5% CO2 עבור 4 עד 24 שעות.
    3. רוחצים את התאים את trypsinize להסיר את משטח חיידקים מחובר, שאינם בלע כמו שלב 7.5.
    4. תיקון נגוע התאים ב- 2.5% מחברים ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו 3 מנקי עם PBS.
    5. Permeabilize תאים במאגר חוסם/permeabilization (0.1% טריטון X-100, 3% BSA ב- PBS) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      1. שימוש נוגדן ספציפי של עניין (למשלארנב אנטי-אבידין Ab) ב 10 μg/מ"ל ב permeabilization מאגר עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו נוגדנים משניים (למשל, FITC-התיש ארנב אנטי איג) במשך 20 דקות.
    6. שטיפת תאים x 3 עם PBS, פעם אחת עם מים, ו הר בשקופיות ב 10 μL של מדיום הרכבה מימית כדי למזער זריחה photobleaching.
    7. לבחון את השקופיות על-ידי דיגיטלי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד 63 x / 1.4 תוכנית-עדשה אפוכרומטית אובייקטיבי. תמונות הרשומה באמצעות מצלמה דיגיטלית יחד על התוכנה מיקרוסקופ.
  2. Immunogold מכתים ואלקטרון
    1. זרע 2 x 106 264.7 גלם מקרופאג תאים 6-ובכן צלחות.
    2. לתקן מקרופאגים BCG נגוע עם 4% PFA במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
    3. רחץ דגימות פעמיים עם PBS.
    4. להטביע דגימות 4% נקודת התכה נמוכה agarose, מייבשים 70% אתנול.
    5. העברת דגימות שרף אקרילי, פולימריזציה ב 50 º C.
    6. לגזור 60 ננומטר מקטעים עם מיקרוטום ולאסוף סעיפים על רשתות ניקל.
    7. תווית דגימות עם 10 נוגדן אבידין μg/mL עבור h 1 בטמפרטורת החדר או 4 ° C בלילה בפתרון דגירה (PBS ו- 0.1% BSA) ולאחר מכן לשטוף עם הדגירה פתרון מצומדת זהב F(ab')2 של קטן במיוחד עז-נגד-ארנב אג (1/20) עבור h 1 בחדר טמפרטורה בפתרון הדגירה.
    8. לשטוף ובסעיף מים מזוקקים, כתם ב 2% גלוטראלדהיד, לשטוף שוב, אוויר יבש, בודקים עם מיקרוסקופ אלקטרוני.

9. התחסנות חיות ועיבוד איברים

הערה: כל השלבים צריך להיעשות על אבטחה של ארון.

  1. מעבר biotinylated וחלבון מצופה חיידקים באמצעות מחט1/2G 27 10 פעמים כדי להפוך לתא בודד ההשעיה.
  2. קח 1 x 106 חיידקים μL 100 ל- PBS חינם אנדוטוקסין, לחסן את העכברים-C57BL/6 הנשי (-Ab, H - 2 Kb, שבוע 5-6) subcutaneously ב עורפה של הצוואר.
    1. מזריקים בקרת עכברים μL 100 ל- PBS לבד.
  3. המתת חסד עכברים לחסן 20 ימים לאחר חיסון על ידי שאיפת2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    1. לבודד את הטחול, להעבירו RPMI מדיה.
  4. מועכים את הטחול דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם פומפה מזרק 5 מ.
    1. לשטוף עם 5 מ של RPMI. צנטריפוגה (x 800 גרם, 3 דקות) כדי לבודד השעיה תא בודד.
    2. לרוקן RBC עם העכבר ביוטין חיובי בחירת ערכת עם תאים ביוטין-Ter119/Erythroid Ab.
    3. צנטריפוגה והשהה מחדש תאים ב- 10 מ"ל של שלמה RPMI (FCS 10%, 1%-גלוטמין, 1% פניצילין, סטרפטומיצין 1% ו- 50 μM 2-ME).

10. אני-Ab tetramer מכתים כדי לקבוע את התדרים של אנטיגן ספציפי CD4+ תאי T ואת ציטוקין תאיים מכתים כדי לקבוע תדרים של אנטיגן ספציפי T תאים שחרור ציטוקינים לחסן חיות

  1. Tetramer מכתים
    1. כתם splenocytes של שליטה ועכברים לחסן (~ 20 x 106 תאים) עם מצומדת-PE-Ab-tetramers323-339 ביצית (1/12.5 דילול) עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס במאגר מחייב (PBS עם FCS 2% ו- 0.1% נאן3).
    2. להוסיף AF647 CD4 Ab (1:25) ו- 7-מ (כדי לאתר תאים מתים) splenocytes למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. לנתח דגימות ידי cytometry זרימה.
    4. השג 500,000 אירועים באזור חיובי CD4 כדי לקבוע את התדירות של אירועים חיוביים tetramer.
      הערה: splenocytes סה כ מוגדרים על-ידי נקודה האס/FSC האבן החשופה, תאים חיים מאת הדרה של אירועים חיוביים 7-מ ו CD4 קבוצות משנה על-ידי gating אירועים חיוביים AF647.
  2. התדירות של ציטוקין תאיים ספציפיים אנטיגן, שחרור תאי T
    1. העברת כ 1 × 107 splenocytes לתוך 4 מיליליטר RPMI מלאה, במדיום. ובכן שש צלחות עם או בלי ביצית רקומביננטי (10 µg/mL), תקופת דגירה של 16 h.
    2. פנקו תאים עם Brefeldin (1:1, 000) עבור h 5 נוספים.
    3. לשטוף עם PBS ובכפוף ציטוקין תאיים מכתים כדלקמן:
      1. כתם דגימות תאים עם PE-CD8 או PE-Cy7-CD4 Ab (1:50 במאגר מחייב) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
      2. לתקן ב 4% PFA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
      3. Permeabilize באמצעות פתרון permeabilization, על פי הוראות היצרן.
      4. לשטוף את התאים ואת תווית עם AF647 מצומדת IFN-γ Ab (1:50) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. רוחצים התאים את נושא ניתוח cytometry זרימה כמתואר לעיל.

תוצאות

עם כללי בהליכים המתוארים לעיל, נבחנה הכדאיות של biotinylation משטח BCG וקישוט עם אנטיגן הפונדקאית ביצית. Immunogenicity של BCG שהשתנה היה אז נבדק בתוך vivo. השטח חיידקי סומן בקלות עם ביוטין לתצוגה מהירה של אנטיגנים chimeric אבידין ללא כל שינוי לזיהוי פנוטיפים חיידקי. BCG ששונה וכתוצאה מכך ב?...

Discussion

אנחנו דיווחו במחקר זה בגישה הלא גנטי לתצוגה מהירה ויעילה של חלבונים אקסוגני במשטח BCG להוסיף אנטיגנים ספציפיים או מאפיין פונקציונלי מסוים צפוי לשיפור ביעילות immunogenicity של החיידק. להדגים כי השטח תא BCG יכול להיות בקלות biotinylated לקישוט משטח מיידי עם אבידין פיוז'ן חלבונים. ניתן לבצע את ההליך הכולל ...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר סטוקס R לזן של פסטר BCG ו א טלאל לקבלת תמיכה טכנית. אנו מודים גם GenScript על העזרה עם ג'ין סינתזה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Endotoxin-free RPMI 1640StemCell Technologies 36750
Sulfo-NHS SS biotinThermo Fisher 21328
FITC-conjugated streptavidinSigma-AldrichS3762
Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer MBL International TS-M710-1
7-AADBD Pharmingen559925
TALON polyhistidine-Tag purification resin Clontech635501
Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
AF647 rat anti-mouse IFN-gBD Bioscience 557735
AF647 rat anti-mouse I-A/I-EBD Bioscience 562367
PeCy7 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 552775
PE rat anti-mouse CD8 AbBD Bioscience 561095
AF 647 rat anti-mouse H-2kbBD Bioscience562832
FITC-conjugated goat anti rabbit antibodyThermo Fisher31635
AF 647 rat anti-mouse CD4BD Bioscience 557681
Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgGElectron Microscopy Sciences25100
Middlebrook 7H9 brothBD Diagnostic Systems271310
OADCBD Diagnostic SystemsB11886
Tween 80Sigma-AldrichP1379
RAW 264.7 murine macrophage cell linesAmerican Type Culture Collection
pDEST17 plasmid Invitrogen11803012
pUC57-OVA plasmid GenScriptSD1176
BP clonase Invitrogen11789020
LR clonase Invitrogen11791043
pDONR221 plasmidInvitrogen12536017
Ni-NTA columns Qiagen31014
Pierce protein concentrators Thermo Fisher 88527
FlurosaveCalbiochem-Novabiochem345789
Axioplan II epifluorescence microscopeCarl Zeiss Inc
CCD digital camera Retiga EX, QImaging
Tecnai G2 200kV electron microscope FEI CompanyG2 200Kv 
70μm Falcon cell strainer Thermo Fisher 87712
EasyStep mouse biotin positive selection kit StemCell18556
biotin-Ter119/Ertyroid cells antibodyBioLegend116203
Brefeldin ABD Pharmingen555029
Cytofix/Cytoperm kit BD Pharmingen554714
Bright-Glo Luciferase assay systemPromegae2620
Turner Biosystem luminometer PromegaTD-20/20
Leica EM UC6 microtome Leica MicrosystemsUC6
Novalyphe NL 500 freeze dryerSavant Instruments NL 50
Wheaton boroscilicate glass vialsWheaton VWR 66011-675

References

  1. Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
  2. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
  3. Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
  4. Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
  5. Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
  6. Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
  7. Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
  8. Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
  9. Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
  10. Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
  11. Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  12. Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
  13. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  14. Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
  15. Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
  16. Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
  17. Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
  18. Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
  19. Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
  20. Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
  21. Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
  22. Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
  23. Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
  24. Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131MycobacteriumT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved