أسلوب أنبوب الاسطوانة المعدلة لتصوير متقطعة الذات المترجمة ومتكررة خلال ثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ في نظام مغلق

Summary

قدم هنا طريقة أنبوب اسطوانة معدلة لاستزراع وتصوير عالي الدقة متقطعة من الدماغ القوارض شرائح الأسابيع كثيرة مع إعادة تنظيم دقيق في كوفيرسليبس فوتوتشيد. كذلك يتم الاحتفاظ بصلاحية الخلايا العصبية ومورفولوجيا شريحة. يتم توفير تطبيقات هذا النظام مغلق تماما استخدام الفيروسات للتعبير نوع من الخلايا المحددة.

Abstract

شرائح الدماغ القوارض مثقف مفيدة لدراسة سلوك الخلايا العصبية وإطلاق في بيئة التي يحتفظ العديد من تفاعلاتها طبيعية في فيفو الخلوية والجزيئية. الشرائح التي تم الحصول عليها من مجموعة متنوعة من خطوط الماوس المحورة وراثيا أو استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات فلوريسسينتلي المعلمة أو الصحفيين في شرائح الدماغ نوع البرية السماح للتصوير عالي الدقة بالفحص المجهري الأسفار. على الرغم من أن قد وضعت عدة طرق لتصوير شرائح المخ، الجمع بين الثقافة شريحة مع القدرة على القيام بتصوير عالي الدقة المتكررة من خلايا معينة في شرائح حية على مدى فترات زمنية طويلة قد يطرح مشاكل. وهذا ينطبق بشكل خاص عند استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات الخارجية حيث يتم ذلك أفضل في نظام مغلق حماية المستخدمين ومنع حدوث التلوث المنتقل. ويفاد بسيطة التعديلات التي أدخلت على أسلوب ثقافة شريحة الدماغ أنبوب الاسطوانة التي تسمح بتصوير عالي الدقة المتكررة لشرائح على مدى أسابيع عديدة في نظام مغلق. استزراع شرائح في كوفيرسليبس فوتوتشيد يسمح باستخدام علامات الاعتماد لسرعة ودقة تعيين موضع مرحلة الصورة الميدانية متطابقة مع مرور الوقت قبل وبعد العلاجات المختلفة. وترد أمثلة لاستخدام هذا الأسلوب جنبا إلى جنب مع تلطيخ الخلايا العصبية المحددة والتعبير لمراقبة التغييرات في بنية شريحة هيبوكامبال والفيروسية بوساطة التعبير العصبية من البروتينات الفلورية وتطوير علم الأمراض كوفيلين، سابقا الذي لوحظ في قرن آمون لمرض الزهايمر (AD) ردا على معاملة الشريحة مع ليغومرات الببتيد اميلويد-بيتا (Aβ).

Introduction

الثقافة الأولية من الخلايا العصبية معزولة من مناطق الدماغ القوارض هو أداة هامة يستخدمها الباحثون لمراقبة الردود على مرضية المتورطين المحفزات. غير أن هذه الدراسات قد عيب تبحث في الخلايا العصبية في 2D فقط ودون نظام الدعم لهم الدبقية. وعلاوة على ذلك، إلا إذا نمت في ظروف كثافة عالية جداً (640 الخلايا العصبية/مم² أو حوالي 16% من المساحة السطحية) الذي يصبح من المستحيل متابعة ثمرة عشوائية تغصن أو إكسون لأكثر من مسافة قصيرة من جهازها الخليوي، هيبوكامبال صلاحية الخلايا العصبية أكثر من 4 أسابيع انخفاضات كبيرة¹، الحد من استخدام الثقافات معزولة لإجراء دراسات موسعة للأمراض المرتبطة بالسن. استزراع شرائح أعدت من الدماغ القوارض هو خيار جذاب أن يتغلب على هذه القيود من خلال الحفاظ العمارة خلية المنظمة وقدرتها على البقاء لأسابيع أو أشهر. وكانت الظروف للحفاظ على العديد من مناطق مختلفة من الدماغ القوارض في ثقافة شريحة وصف².

اثنين من الأساليب الرئيسية تستخدم على نطاق واسع لثقافة طويلة الأجل من شرائح المخ: يسمح لتدوير في حاضنة اسطوانة توفير تهوية⁴استزراع على الأغشية في واجهة الهواء السائل³ أو استزراع في كوفيرسليبس في أنابيب محكمة الإغلاق. يمكن تصويرها شرائح مثقف على الأغشية مباشرة مع الفحص المجهري الفلورية العالية الاستبانة استخدام مجهر تستقيم والماء الغمر الأهداف⁵. بدلاً من ذلك، تم نقل شرائح مثقف في الأغشية للزجاج أسفل الأطباق التوصل إلى حل جيد للعمود الفقري الجذعية استخدام مجهر مقلوب⁶. ومع ذلك، كلا أساليب التصوير شرائح نمت على الأغشية هي النظم المفتوحة التي تتطلب التغييرات متوسطة، وغالباً ما تستخدم مضاد و/أو المضادات الحيوية لمنع أو الحد من تلوث^5،6. الشرائح في غشاء في الواجهة الجوية المتوسطة الحفاظ على مورفولوجيا ممتازة والبقاء على قيد الحياة، ولكن العودة إلى المواقع بدقة أثناء التصوير المتكرر في تضخم عالية من الصعوبة ما لم يتابع التجربة مجموعات صغيرة فقط من الخلايا وإذ تعرب عن علامة نيون. على الرغم من أن قد استخدمت شرائح نمت على الأغشية مع التعبير الفيروسية بوساطة من المتسلسلات^5،6، بروتوكولات السلامة الأحيائية قد تتطلب ستستخدم نظام ثقافة مغلقة لبعض النواقل الفيروسية التي يتم استخدامها من أجل وإذ تعرب عن فلوريسسينتلي معلم البروتينات والصحفيين لفيزيولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، تتطلب أهداف الغمر إزالة التلوث بين العينات التي سيتم اتباعها في الثقافة⁵. تطبيق الرئيسية واحد من الغشاء واجهة الثقافات هو الجمع بين التصوير عالي الدقة مع الكهربية في وقت واحد النقاط⁷.

لا يسمح الأسلوب أنبوب الاسطوانة مع كوفيرسليبس داخل أنبوب بلاستيكي أي الكهربية أو تصوير عالي الدقة دون إزالة ساترة. وهكذا طبق هذا الأسلوب في أغلب الأحيان للدراسات الطويلة الأجل التي جعلت الملاحظات التثبيت بعد⁸. الموصوفة هنا هو طريقة التي يستخدم تقنية الثقافة أنبوب الاسطوانة ولكن المحافظة على أنابيب حفر السحب مع شرائح في كوفيرسليبس التي يمكن تصويرها متكررة لطالما الثقافات. يتطلب أي تغيير متوسطة لتصوير نظام مغلق ويستخدم كوفيرسليبس فوتويتشيد لتقديم علامات الاعتماد التي تسمح للتصوير في تضخم عالية، بعد أيام أو أسابيع، حقول محددة سبق تصويرها.

نقوم بتطبيق هذا الأسلوب لدراسة التغيرات في الحصين القوارض، منطقة الدماغ رئيسية مشاركة في الذاكرة والتعلم. وكثيراً ما يتم دراستها الحصين القوارض كنموذج للتغيرات المرضية أو المرتبطة بالسن التي لوحظت أثناء التطوير من ضعف الإدراك⁹، مثل تلك التي تحدث في الإعلان. أسلوبنا مناسبة خاصة لدراسة التغييرات المرضية التي تضع ضمن شريحة واحدة على مر الزمن في الاستجابة للتغيرات البيئية، مثل الزيادات في الببتيدات Aβ، التي من سمات AD⁸. وهو أحد الأمراض المرتبطة بالإنسان والقوارض الدماغ الإعلانية وجود المجاميع كوفيلين-أكتين وقضبان، الحزم التي تحتوي على هذا الأخير من خيوط الأكتين وكوفيلين في 1:1 نسبة مولى^{10،11، 12}-قضبان وقد لوحظت في الشرائح الثابتة الحصين الفئران بعد العلاج Aβ، وكذلك ضمن شريحة الدماغ القوارض يعيش معربا عن التعرض لنقص⁸كوفيلين-بروتينات فلورية خضراء، وأنها قد تسهم في اختلال وظيفي متشابك في الإعلان والسكتة الدماغية. هنا نستخدم هذا الأسلوب الجديد في تثقيف للالتزام بالوقت بالطبع والتوزيع داخل شرائح أعرب البروتينات الفلورية تشيميريك خارجية عشر أدخلت بأنواع مختلفة من الفيروسات. ثم نستخدم تعبيراً محدداً الخلايا العصبية لبناء كوفيلين مراسل لمتابعة وضع قضيب كوفيلين وأمراض الكلي في شرائح هيبوكامبال استجابة للعلاج مع ليغومرات Aβ القابلة للذوبان (Aβ_س).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

استخدام الحيوان يتبع تربية المعتمدة وبروتوكولات استخدام الحيوانات التي تتوافق مع "العناية بالحيوان" و "استخدام المبادئ التوجيهية من جامعة ولاية كولورادو".

ملاحظة: بروتوكول أدناه يصف طريقة إعداد والثقافة للحضانة الطويلة الأجل وتصوير متقطعة شرائح هيبوكامبال. شريحة هيبوكامبال واحدة موصولة إلى ساترة فوتوتشيد أعدت خصيصا استخدام تجلط بلازما، وثم مختومة كوفيرسليبس على الجانب المسطح من أنبوب حفر خارج الاسطوانة، التي يتم الاحتفاظ بها في حاضنة اسطوانة. يتم حل تجلط البلازما لازمين قبل العدوى الفيروسية لتعبير البروتينات الفلورية وتصوير عالي الدقة. يتم استخدام صبغة حيوية الخلايا العصبية فلورسنت الصورة في الخلايا العصبية داخل الشرائح.

1-إعداد الاسطوانة أنبوب حامل

1. استخدام القالب هو مبين في الشكل 1 طباعة حجم سيظهر في شريط مقياس. مع مسمار، لكمه ثقوب صغيرة (كبيرة بما يكفي لعلامة نقطة غرامة) في قالب تتمحور حول الثقوب.
2. تعيين القالب في أسفل طبق استنبات الأنسجة 15 سم (القطر الأسمى من 14 سم) ووضع علامة على موضع الثقوب. كرر هذا الإجراء في صحن ثاني.
3. مع لقم الثقب مصمم للاستخدام على البلاستيك، حفر ثقوب قطرها 1.5 سم ستة في كل طبق في صفيف (4.8 سم مركز إلى مركز) سداسية مع مراكز هول 2.5 سم من حافة الطبق. حفر ثقوب ثلاثة (3 مم في القطر) 12 مم من الحافة التي توضع اكويديستانتلي بين اثنين من أكبر الثقوب كما هو مبين في الشكل 1ألف.
4. مع القيعان من كل طبق في مواجهة بعضهما البعض، مكان المسمار آلة طويلة مقاس 2.5 بوصة (قطرها 3/16 بوصة) مع غسالة مسطح من خلال واحدة من الثقوب الصغيرة تليها غسالة شقة ثاني، قطعة من البولي إيثيلين الأنابيب (فاصل، 4.7 سم)، وآخر غسيل مسطح ، طبق استنبات الأنسجة الثانية وغسيل مسطح آخر وغسالة قفل والجوز.
5. كرر الخطوة 1، 4 مسامير الجهاز اثنين آخرين، وتشديد فضفاضة فقط حتى يتم كل آلة مسامير في المكان. ثم تشديد المكسرات بشكل أمن.
6. تعمل الحلقات (5/16 بوصة سميكة، 5/8 بوصة حفرة قطرها) في الثقوب للطبق السفلي للحصول على أنابيب الاسطوانة النهائية الحامل (الشكل 1ب؛ سيظهر مع اثنين من الأنابيب في مكان). وضع ملصق على كل رف برقم فريد.

2-إعداد أنابيب الرول وكوفيرسليبس

1. مما يجعل الرقصة لحفر الحفرة في أنابيب الرول
   1. حفر حفرة 1.5 سم عمق 8 سم في الجانب مركز 2 × 4 × 5.5 بوصة كتلة خشبية في زاوية من هذا القبيل أن أنبوب الجانب المسطح من الاسطوانة سوف تكون تقريبا بالتوازي مع الكتلة عند إدراج (الشكل 2أ).
   2. تكبير الثقب باستخدام ملف خشب جولة إلى كل من الاتساع وتفتق حفرة للسماح بإدخال أنبوب (أنابيب الاسطوانة أكبر قليلاً في قطر بالقرب من نهاية عملية النداءات الموحدة) (الشكل 2ب).
   3. حفر ثقب عمودي قطرها 1.5 سم، سم 5.5 من الجانب من الكتلة، وتتوسط الحفرة الجانبية (الشكل 2-ج).
   4. عندما ثقب الجانب هو مدبب ما يكفي، إدراج أنبوب اسطوانة التي تم وضع علامة في المكان المطلوب لمركز الحفرة للشريحة ووضع الأنبوب حيث يتركز الفور ملحوظ في حفرة رأسية 1.5 سم.
   5. إزالة الأنبوب وقياس المسافة من النقطة إلى نهاية الأنبوب. وضع علامة على هذه المسافة من مركز الثقب في الرقصة وإدراج مسمار لتوفير حد لوضع الأنبوب للحفر (السهم في الشكل 2ج) بشكل صحيح.
   6. استخدم منشارا قطع الأظافر دافق مع سطح كتلة الخشب لمنع الإصابة.
   7. إضافة قصاصات الربيع في الجزء السفلي من الرقصة إذا كان هناك صحفي الحفر مع الفتحات التي تسمح لها بأن تكون رأسية (الشكل 2د الأسود السهم). خلاف ذلك، استخدام سي المشابك لعقد الرقصة بشكل أمن على الصحافة الحفر.
2. استخدام الرقصة الموصوفة أعلاه عقد ووضع أنبوب بلاستيك ثقافة مسطحة الوجهين سم 11 مع الجانب مسطحة (الشكل 2أ)، وحفر حفرة قطرها 6 مم مع مركز 1.0 سم من الأسفل، وتركزت بين الجانبين من الأنبوب.
   ملاحظة: يجب استخدام مثقاب مصممة للبلاستيك.
3. مع أداة deburring الدوران، وتجانس حواف الحفرة (الشكل 2ه) وجعل الأخاديد 4 داخل حافة الحفرة (الشكل 2ه، اقحم) تيسيرا لتجفيف الحفرة أثناء التناوب.
4. مع وجود ثقب 12 مم لكمه، وقطع أقراص قطرها 12 مم من أوراق المطاط غير سامة مزدوج الوجهين لاصق السيليكون. استخدام لكمه ثقب واحد ورق قياسية (6 مم)، أحداث فجوة في وسط كل قرص.
5. شطف أنابيب حفر مع الإيثانول 70%، والهواء الجاف لهم في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء، وتعقيم الأنابيب وأقراص لاصقة لكمات لمدة 40 دقيقة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (30 ث على مسافة 70 سم ومتوسط) في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
6. تغيير موضع أنابيب وأقراص بعد 20 دقيقة حيث أن يجري تعقيم جميع الأسطح المكشوفة. تحت ظروف معقمة، تقشر الأبيض النسخ من قرص لاصق وإلصاق سيليكون المطاط إلى خارج الأنبوب، محاذاة الثقوب (الشكل 2و).
   تنبيه: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ارتداء العين حماية وإغلاق مجلس الوزراء قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
7. تنظيف 12 ملم قطر فوتوتشيد (100 مركز مرقمة 1 مم المربعات) الزجاج الألماني كوفيرسليبس. اضغط كوفيرسليبس بلطف بالملقط وتراجع في الإيثانول المطلقة، متبوعاً بالماء، يليه الإيثانول المطلقة مرة أخرى، وأخيراً تراجع كوفيرسليبس في لهب لحرق الإيثانول. السماح كوفيرسليبس لتبرد.
8. عقد في كوفيرسليبس بالملقط، تراجع في نسبة 2% 3-أمينوبروبيلتريثوكسيسيلاني في الأسيتون شطف س. 10 كوفيرسليبس مع الماء عالي النقاوة والسماح للهواء الجاف.
9. تعيين كوفيرسليبس على ورق الترشيح العقيمة داخل سلامة بيولوجية مجلس الوزراء وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يعرض كل جانب من كوفيرسليبس لمدة 20 دقيقة.
   تنبيه: لتجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ارتداء العين حماية وإغلاق مجلس الوزراء قبل تشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية.

3. إعداد شريحة هيبوكامبال

1. قبل البدء التشريح، إعداد نصفين شفرات الحلاقة حدين للمروحية الأنسجة. أمثال الريش طوليا بعناية مع الأصابع والمفاجئة في نصف.
2. شطف نصفي بليد مع الأسيتون باستخدام مسحه القطن لتنظيفها، تليها الشطف في الإيثانول المطلقة وهواء التجفيف.

قبل تركيب شفرة نصف على المروحية الأنسجة، تعقيم قبل الشطف مع الإيثانول 70%.

اتبع البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام؛ ورعاية الحيوان المؤسسية بعد التخدير إيسوفلوراني، euthanize جرو الفأر أو الجرذ يوم 4-7 قديمة بقطع الرأس وإزالة الرأس بالمقص أو مقصلة.
ملاحظة: بروتوكول ثقافة شريحة الدماغ مستقل من سلالة الفئران أو ماوس أو الوراثي. وقد استخدمت العديد من خطوط الماوس المحورة وراثيا مع مختلف الخلفيات الوراثية.

شطف الرأس مع الإيثانول 70%، ثم ضعه في 60 مم طبق بيتري. حتى التركيب النهائي من شريحة الدماغ على أنبوب الاسطوانة، جميع الخطوات التالية تتم في غطاء الاندفاق الصفحي للحفاظ على العقم.

استخدام شفرة جراحية #21، جعل قطع السهمي عن طريق الجلد والجمجمة. مع ملقط دومون #5، العودة قشر الجلد والجمجمة لفضح الدماغ.

مع الملقط مغلقة، بلطف ندف خارج الدماغ كله، وإطلاقه معسر مع الملقط عبر جذع الدماغ وراء المخيخ. ضع الدماغ في طبق 60 ملم معقمة تحتوي على Solution/0.5% الملح متوازنة الجلوكوز 4 درجة مئوية جي (جبس/الجلوكوز).

استخدام مجهر تشريح لتصور الدماغ (الشكل 3أ)، ضع الجانب الظهرية الدماغ أعلى وقطع الثالث الجبهة من المخ والمخيخ بشفرة جراحية (الشكل 3ب).

1. مع الملقط، عقد في الجانب الخلفي للدماغ المشذبة أعلى والجانب البطني ضد الجانب طبق بيتري للاستقرار. بلطف ندف السحايا بعيداً حول خط الوسط السهمي وإزالة الأنسجة midbrain استخدام ملقط دومون #5 مقلوب غرامة (الشكل 3جيم، دائرة متقطع).
2. إجراء تخفيضات اثنين على طول الجانب من الدماغ لتنتشر مفتوحة (الشكل 3جيم، خطوط متقطعة). حالما يتم وضع الدماغ الظهرية الجانبية إلى أسفل وفتح انتشار، الشق هيبوكامبال يجب أن تكون مرئية (الشكل 3د، السهم).
3. نقل انتشار المخ مفتوحة لقطعة من الفيلم بوليتشلوروتريفلوروثيليني البلاستيك ووضعه لتقطيع المرحلة من المروحية الأنسجة. الرطب بليد مع جبس/الجلوكوز وختم الحصين إلى ~ 300 ميكرون شرائح سميكة.
4. مع ماصة نقل، مسح الدماغ شرائح إيقاف الفيلم البلاستيك إلى طبق جديد 60 ملم تحتوي على جبس/الجلوكوز (الشكل 3ه). بلطف قرصه قبالة وندف بعيداً، مع غرامة الملقط مقلوب والسحايا المتبقية والأنسجة الأخرى غير هيبوكامبال (الشكل 3و) من الشرائح (الشكل 3ز، ح).

4-طلاء الشرائح

1. مرة واحدة وقد تم الحصول على شرائح، ضع 2 ميليلتر من البلازما الدجاج في مركز فوتويتشيد في الجانب ساترة استعداد. وانتشرت في البلازما قليلاً لتحقيق بقعة قطرها 3-4 ملم.
   ملاحظة: أن الجانب فوتويتشيد على الجانب العلوي من ساترة عندما ينظر إليها من خلال مجهر تشريح أن الأرقام التي تتجه بشكل صحيح.
2. نقل شريحة الدماغ 1 مع ملعقة نصيحة الضيقة عقيمة (الشكل 4أ) على الفور البلازما (الشكل 4ب). استخدام الملقط مغلقة للحفاظ الشريحة على طرف الملعقة حين رفع الشريحة من جبس/الجلوكوز.
3. تلمس الملعقة للبلازما بقعة ساترة، ومع الملقط مغلقة، ودفع الشريحة على ساترة.
4. ميليلتر 2.5 مزيج من البلازما مع 2.5 ميليلتر من ثرومبين في أنبوب منفصل. بسرعة ضع ميليلتر 2.5 من هذا الخليط أكثر وحول شريحة وبيبيت صعودا وهبوطاً بلطف مزيج (الشكل 4ب).
   ملاحظة: سوف تجلط البلازما داخل 10-15 ثانية، حيث يجب أن يتم ذلك بسرعة. إذا كان الالتصاق شريحة تمثل مشكلة، مزيج 5 ميليلتر البلازما مع 5 ميليلتر ثرومبين واستخدام 4-5 ميليلتر في الشريحة، إزالة بعض بعد خلط حيث أن الشريحة تقع الشقة على ساترة.
5. إزالة البلاستيك الشفاف الذي يغطي من الجهة المكشوفة من لاصق مطاط السيليكون سابقا الملصقة على أنبوب اسطوانة وساترة مع شريحة الدماغ على لاصق محاذاة الشريحة داخل الحفرة (الشكل 4ج).
6. لضمان الالتصاق، تطبيق لينة، الضغط حتى إلى ساترة مع الإبهام بالضغط ساترة بالتساوي، وعقد لحوالي 1 دقيقة أثناء نقلها إلى السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
7. في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية، إضافة 0.8 مل من إكمال A نيوروباسال الثقافة المتوسطة (جدول المواد) لكل أنبوبة (الشكل 4د).
8. تدفق مزيج هواء 5% CO₂95 في المائة عن طريق عقيمة الوتر القطن باستور ماصة عقدته المشبك بشكل أمن. تدفق أنبوب الاسطوانة مع خليط الغاز وسرعة في آب الأنبوب حيث يتم سحبه من حولها الماصة.
9. تسمية الأنابيب مع رقم الشريحة ورقم الرف. إدراج أنابيب في حامل الرول، ضمان أنها متوازنة بشكل هندسي. إذا كان هناك عدد فردي من الأنابيب، إضافة أنابيب لتحقيق التوازن.
10. وضع الرفوف في حاضنة اسطوانة 35 درجة مئوية مع تحول حامل الرول في حول بكرات الأستاذ 10-13 (الشكل 4ه). للحفاظ على المتوسط في الجزء السفلي من الأنابيب، يعود إمالة الحاضنة حوالي 5 درجة برفع به الجبهة في مجلس.
11. أدخل رقم الشريحة وأنبوب على جدول بيانات، الذي يستخدم لتسجيل كافة المعلومات من العلاجات شريحة وتواريخ المراقبة.
12. في حوالي يوم 6 في الثقافة، وإضافة 1 ميليلتر (0.002 يو) من النشطة لازمين لكل أنبوبة.
13. بعد الجلطات تذوب تماما (عادة في غضون ساعات قليلة)، إزالة المتوسطة واستبدالها بالطازجة المتوسطة دون لازمين. إذا لزم الأمر، يمكن المحتضنة شرائح مع لازمين بين عشية وضحاها وتغير المتوسط في اليوم التالي.
14. عادة ما يتم المحتضنة شرائح على الأقل 7-10 أيام قبل استخدامها في التجارب. نضح المتوسطة ويحل محله في يوم 3 أو 4، مرة أخرى في اليوم السابع، وبعد ذلك كل 7 أيام.

5-إعداد النواقل الفيروسية للتعبير التحوير

ملاحظة: التعبير عن المتسلسلات في الخلايا العصبية للثقافات شريحة يتحقق أما باستخدام العقول من القوارض المهندسة وراثيا، أو عن طريق إدخال التحوير بالإصابة بفيروسات النسخ المتماثل المؤتلف ناقصة.غدية (AV)، وفيروسات الغدد المرتبطة (إف)، وناقلات lentivirus المؤتلف جميعا قد استخدمت في ثقافاتنا شريحة هيبوكامبال للتعبير عن التركيبات بروتين فلوري مختلف شرائح المخ.

1. إعداد النسخ المتماثل AV قاصرة للتعبير عن الحمض النووي الريبي للفائدة وفقا للأساليب الموصوفة في أماكن أخرى^13،14. عيار الفيروسات المعدية يو/مل بطريقة التخفيف التسلسلي استخدام جسم مضاد لبروتين فيروسي أعرب كوصف¹⁴. لمراقبة كوفيلين المجاميع وتشكيل قضبان كوفيلين-أكتين، الاستفادة من كوفيلين-R21Q-مرفب كدنا (بلازميد #51279)¹⁶.
   ملاحظة: المروج 1 سينابسين اختياراً ممتازا للخلايا العصبية تعبيراً محدداً¹⁵، بينما المروج الفيروس المضخم للخلايا مفيدة للقيادة مستويات عالية من التعبير في العديد من أنواع الخلايا¹³.
2. إعداد إف من تعداء المشارك لنقل بلازميد يحتوي على الجينات للفائدة وبلازميد rep/كاب، مع أو بدون بلازميد مساعد، في HEK293 تغليف الخلايا، التي تزود الجين E1 الفيروسية، كما هو موضح سابقا^17،في الفترة من¹⁸.
   ملاحظة: إف المؤتلف يمكن أيضا إجراء للإدراج المستهدفة إلى جينوم الخلية المضيفة¹⁹. بلازميد نقل، نستخدم كوفيلين البشرية 1 ج-محطة mRFP1 fluorescence بروتين علامة (بلازميد #50856) المستنسخة في سينابسين المحتوية على مروج إف بلازميد المصب من أجهزة الاستشعار GCaMP5G الكالسيوم²⁰. يتم إدراج قطعة من الترميز الذاتي كليفينج P2A الببتيد تسلسل الحمض النووي بواسطة PCR بين GCaMP5G وكوفيلين--طلب تقديم العروض أثناء إعداد بلازميد نقل لتوفير تعبير البروتينات كلا من إف نسخة واحدة²¹.
3. إعداد ناقلات lentivirus المؤتلف من تعداء المشارك لنقل بلازميد يحتوي على الجينات أو كدنا إشارات الاهتمام والتكامل، جنبا إلى جنب مع لينتيفيروس الجيل الثالث تغليف الخليط الذي يقسم هفوة الفيروسية، وبول، والقس، والجينات منظمة-ز على ثلاثة منفصلة والبلازميدات^22،23.
4. بلازميد نقل، استخدام خطوة واحدة استنساخ النظام²⁴ لتجميع سينابسين المروج وكدنا كوفيلين-R21Q-مرفب (من بلازميد #51279) في pLKO.1-التجارة والنقل (بلازميد #30323)، مع مروج سينابسين واستبدال في هبجك كوفيلين-R21Q-مرفب المروج وكدنا بروتينات فلورية خضراء، على التوالي.
5. ترانسفيكت بلازميد النهائي إلى خلايا HEK293T بفوسفات الكالسيوم كما هو موضح سابقا²³.
6. جمع المتوسطة من أربعة أطباق 10 سم والتركيز إلى 500 ميليلتر استخدام مركزات الطرد المركزي 150 كقطع تخزين lentivirus النهائي في-80 درجة مئوية في مختبرين الصغيرة بعد التجميد السريع في نيتروجين سائل. ذوبان الجليد الكوة إلا مرة واحدة لإصابة الخلايا.
7. تحديد تجريبيا حجم كل نوع من أنواع الفيروسات على استعداد لتحقيق درجة التعبير المنشود بإقامة عدد من ثقافات مختلفة من شريحة لتتبع التعبير عن المتسلسلات بعد الإصابة بأحجام مختلفة من الفيروس.
   ملاحظة: عادة ما يستخدم 1-10 ميليلتر من الفيروس كل شريحة.

6-شريحة العلاجات

1. شرائح إصابة بالفيروس
   1. تعمل في مجال سلامة بيولوجية مجلس الوزراء الموافقة على عمل الفيروس على مستوى السلامة البيولوجية المناسبة لمكافحة ناقلات، مزيج قاسمة الفيروس (عادة 1-10 ميليلتر) مع 0.8 مل متوسطة كاملة.
   2. نضح المتوسطة من شريحة باستخدام ماصة باستور معقمة في فخ مجموعة التي تحتوي على التبييض. يتم دائماً استخدام مصيدة ثانوية بين فخ الأولى ومصدر فراغ.
   3. استبدال هذه الوسيلة بقاسمه المحتوية على الفيروس أعد أعلاه والعودة أنابيب الثقافة برف، ووضع في الحاضنة.
   4. بعد 2-5 أيام من حضانة الشرائح مع الفيروس في السلامة البيولوجية مجلس الوزراء، إزالة المتوسطة المحتوية على الفيروس مع ماصة نقل عقيمة ووضعه في زجاجة تحتوي على عامل المضادة للفيروسات معتمدة لقتل الفيروس.
2. تلوين الخلايا العصبية مع صبغ الحيوية
   1. تحضير وتخزين مختبرين لصبغ الحيوية العصبية الفلورسنت²⁵ من ميليلتر 4 التجميد السريع لمختبرين في النتروجين السائل بتركيز 100 ميكرومتر وتخزين هذه في-20 درجة مئوية. عدم تجميد/ذوبان الصبغة أكثر من مرة.
   2. تسمية الخلايا العصبية للتصور بالفحص المجهري الأسفار وذوبان الجليد قاسمة واحد من صبغة حيوية الخلايا العصبية وتضعف إلى 4 مل في كامل نيوروباسال المتوسطة (تركيز الصبغ النهائي هو 100 nM).
   3. إزالة المتوسطة من شرائح بتطلع (أو مع ماصة نقل إذا المتوسط يحتوي على الفيروس) واستبدله 0.8 مل المتوسطة التي تحتوي على 100 نانومتر صبغ الخلايا العصبية الحيوية. العودة الشرائح إلى جهاز الاسطوانة في الحاضنة.
   4. بعد حضانة الشرائح من ح 2، نضح المتوسطة المحتوية على صبغ واستبدله 0.8 مل متوسطة كاملة جديدة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
      ملاحظة: تسمية الخلايا العصبية في شرائح مع صبغ الحيوية يتطلب عدة ساعات للحضانة. عادة ما تؤخذ الصور الأولى ح 24 بعد العلاج صبغ. على الرغم من أن تتم تسمية الخلايا العصبية على وجه التحديد، هناك خلفية الأسفار أن ينخفض أكثر من 2-3 أيام لإعطاء أفضل تصوير الخلايا العصبية. انخفاض كثافة الصبغة الحيوية بعد 72 ساعة.
   5. لمتابعة التغييرات في مورفولوجيا شريحة على مر الزمن، ريلابيل الشرائح كل 7 أيام.

7-شريحة التصوير

1. عرض الشرائح على مجهر مقلوب. لتصوير fluorescence ألمع، في 24 ساعة قبل التصوير، وتبادل الثقافة المتوسطة مع المتوسط A نيوروباسال كاملة دون مؤشر الرقم الهيدروجيني الفينول الحمراء.
   ملاحظة: للتجارب التي ذكرت هنا، شرائح يتم عرضها على مجهر الأسفار [كنفوكل] قرص مقلوب لغزل مزودة بخطى ترميز x، y المرحلة مع مراقبة z بيزو وكاميرا رقمية ذات دقة عالية حساسية.
2. نقل الأنبوب مع ثقافة شريحة تصويرها من الجهاز أنبوب الاسطوانة لصاحب الأنبوبة مصنوعة خصيصا (الشكل 5A)، التي وضعت في مرحلة محول (الشكل 5ب)، للحفاظ ساترة عمودي والهدف والحفاظ على الشريحة في نفس اتجاه خلال جلسات التصوير المتكرر على مدى فترات زمنية طويلة.
3. دفع المنزلق على محول المرحلة مشددة ضد أنبوب لعقد الأنبوب في الموقف (الشكل 5ب).

الحفاظ على شريحة درجة حرارة 35 درجة مئوية أثناء التصوير باستخدام التدفئة شرائط وتحكم الجراحية في صلب المحول المرحلة مصنوعة خصيصا (الشكل 5ج).
ملاحظة: تفاصيل صاحب الأنبوبة، مرحلة محول، ويمكن الوصول إلى سخان في: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.

استخدام قوة منخفضة (على سبيل المثال.، 4 X) الهدف وميدان مشرق تضوء، التركيز على نمط الشبكة فوتوتشيد (الشكل 6A) تحت الشريحة. لدورة التصوير الأولى، مسح حول شريحة لتحديد موقع وتسجيل العدد لمختلف المناطق حيث يتم رغبت أعلى التكبير التصوير بسرعة (مثلاً، قرن أمونيس (CA) 1، CA3، المغزلي المسنن (المدير العام)، و ما إلى ذلك).

نقل المسرح إلى ساحة الشبكة الأولى تحتوي على منطقة للفائدة. قم بالتبديل إلى 20 × الهدف الجوي وتحديد موقع علامة الاعتماد (مثلاً.، تلميح عدد المحفور) (الشكل 6ب).

قم بالتبديل إلى هدف سلطة العليا (40 X أو 60 X)، ترجمة العلامة الاعتماد، وسجل ثم x وموقف y للمرحلة. الانتقال من مرحلة للبحث عن الحقل أو حقول الفائدة القريبة وسجل يزيح عن x و y من علامة الاعتماد (الشكل 6ب، السهم). كرر في مجالات شبكة أخرى إذا رغبت في ذلك.
ملاحظة: هذه المواقف المقاصة من علامة الاعتماد تسمح بإبراز متسقة من نفس الموقع ساترة عندما يتم تصويرها الشريحة، على الرغم من أن تغيير الإعداد y من علامة الاعتماد الأصلي x، عندما المحول أنبوب أو مرحلة إزالة واستبدال.

قم بالتقاط صورة Z-المكدس داخل كل حقل محدد باستخدام مجهر مراقبة موضوعية أو عنصر تحكم مرحلة بيزو، إذا كانت متوفرة.
ملاحظة: صورة طائرات يتم عادة الحصول على فترات من 0.5 ميكرومتر إلى 2 ميكرومتر، تبعاً لحجم والقرار المطلوب من ملامح الصورة. ويتطلب بناء صورة ثلاثية الأبعاد ذات جودة أن ملامح الصورة تمتد عدة طائرات لاقتناء، وحتى لتصور ملامح أصغر، أصغر فترات مطلوبة بين الطائرات.

الحفاظ على مجموع التصوير الوقت لكل شريحة قصيرة قدر الإمكان.
ملاحظة: ذكرت معظم دورات التصوير هنا كانت تحت 18 دقيقة/شريحة. بيد أننا قد تصويرها بعض شرائح عشرة أو أكثر الأوقات، وحتى كدام 40 دقيقة في جلسة واحدة، دون إلحاق أي ضرر واضح في بقاء على المدى الطويل من الشريحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمكن أن تستخدم لتحديد مدى دقة علامات الاعتماد reimage نفس الخلايا داخل نفس الحقول على مر الزمن، قمنا بدراسة الشرائح التي نمت في فوتوتشيد كوفيرسليبس (الشكل 6A). كانت تصور الخلايا العصبية بصبغة بصبغة حيوية (100 نانومتر ح 2؛ لا وصمة عار الخلايا غير العصبية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الاسطوانة أنبوب الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لاستزراع طويلة الأجل وعالية الدقة تصوير حية من أنسجة المخ شرائح. مسألة رئيسية واحدة مع تقنية شريحة المطبق هنا في التركيب والصيانة لشرائح. الطلاء ساترة التي تدعم انضمام شريحة، تشجيع شريحة رقيق بتعزيز ثمرة نيوريتيس والهجرة من الخلايا خارج الشريحة?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bottoms from 15 cm culture dishes	VWR Scientific	25384-326
Phillips Head Machine Screws (#10-32)	Ace Hardware		2.5" long and 3/16" in diameter
Flat Washers #10	ACE Hardware
Machine Screw Nuts (#10-32)	ACE Hardware
Rubber Grommets	ACE Hardware		5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID)	ACE Hardware		Cut to 1.8" length
Lock Washer #10	ACE Hardware
Drill Press, 5 speed	Ace Hardware	ProTech Model 1201
Nunclon Delta Flat-Sided Tubes	VWR	62407-076
Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm	Ace Hardware	Diablo freud brand	Drill bits for cutting plastic.
Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm	Ace Hardware
Wood file, 1/4" round	Ace Harware
Spring clips, 16 mm snap holder	Ace Hardware
Swivel Head Deburring Tool, 5"	Ace Hardware	26307
Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal)	Grace Bio-Labs	666581	0.5 mm Thickness
6 mm hole punch	Office Max
12 mm hole punch	thepunchbunch.com
70% Ethanol
Phototeched Coverslips, 12 mm diameter	Bellco Glass, Inc.	1916-91012
Bunsen Burner
Absolute Ethanol
Nanopure Water
3-aminopropyltriethoxylane	Sigma-Aldrich	A3648
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
#5 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-30
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella, Inc.	10180
Double Edge Razor Blades	Ted Pella, Inc.	121-6
Whatman Filter Paper	VWR	28450-182	Cut into 5.8 cm diameter circles
Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar)	Ted Pella, Inc.	10501-10	Cut into 5.8 cm diameter circles
#21 Surgical Blade	VWR Scientific	25860-144
#5 Dumont Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Spatula, stainless with tapered end	VWR	82027-518
Gey's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	G9779
Glucose	ThermoFisher Scientific	15023-021	25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Chicken Plasma	Cocalico Biologicals	30-0300-5L	Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
Thrombin, Topical (Bovine)	Pfizer	Thrombin-JMI	Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL.
Cell Roller System	Bellco Biotech	SciERA
Roller Incubator	Forma	Model 3956
N21-MAX	ThermoFisher Scientific	AR008
Pen/Strep (100X)	ThermoFisher Scientific	15140122
200 mM Glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081
Glucose	ThermoFisher Scientific	15023-021	25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
Neurobasal A	ThermoFisher Scientific	10888-022	Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
Third generation lentivirus packaging	Life Technologies	K4975-00
159 K cutoff centrifugal filters (Centricon)	EMD Millipore
Lentiviral cloning system (InFusion)	Clonetech
Plasmids 30323, 50856, 51279	Addgene
Neuronal cell viability dye (NeuO)	Stemcell technologies	1801	Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
Inverted microscope	Olympus	IX83
Microscope objectives	Olympus	air: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
Spinning disc confocal system	Yokagawa	CSU22
Microscope EMCCD camera	Photometrics	Cascade II
Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage	ASI
Microscope lasers and integration	Intelligent Imaging Innovations
HEK293T cells	American Type Culture Collection	CRL-3216
Human Plasmin	Sigma Aldrich	P1867	0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.