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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.

Zusammenfassung

Kultivierte Nagetier Gehirnscheiben eignen sich für die Erforschung der zellulären und molekularen Verhaltens der Neuronen und Glia in einer Umgebung, die viele ihrer normalen in-Vivo -Interaktionen unterhält. Scheiben aus unterschiedlichsten transgene Mauslinien oder Verwendung von viralen Vektoren für Ausdruck von Eindringmittel tagged Proteinen oder Reporter in Wildtyp Gehirnscheiben gewonnen ermöglichen hochauflösende Bildgebung durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Obwohl verschiedene Methoden entwickelt worden sind, für imaging Gehirnscheiben kombiniert Stück Kultur mit der Fähigkeit zu führen hat sich wiederholende hochauflösende Bildgebung bestimmter Zellen in live Scheiben über längere Zeit Probleme aufgeworfen. Dies gilt insbesondere, wenn virale Vektoren für Expression exogene Proteine verwendet werden, da dies am besten geschieht in einem geschlossenen System zum Schutz der Nutzer und Kreuzkontamination zu verhindern. Einfache Änderungen an der Walze Rohr Gehirn Stück Kultur-Methode, die für sich wiederholende hochauflösende Bildgebung von Scheiben über viele Wochen in einem geschlossenen System zu ermöglichen, werden gemeldet. Kultivierung der Scheiben auf komplexeste Deckgläsern erlaubt die Verwendung von treuhändische Markierungen schnell und genau die Bühne, um das gleiche Feld im Laufe der Zeit vor und nach verschiedenen Behandlungen Bild neu positionieren. Beispiele sind für den Einsatz dieser Methode kombiniert mit spezifischen neuronalen Färbung und Ausdruck, Änderungen in der hippocampal Stück Architektur zu beobachten, viral-vermittelte neuronale Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen und die Entwicklung von Cofilin Pathologie dargestellt, die zuvor im Hippocampus der Alzheimer-Krankheit (AD) in Reaktion auf die Scheibe Behandlung mit Oligomere von Amyloid-β (Aβ) Peptid beobachtet wurde.

Einleitung

Primärkultur dissoziierten Neuronen aus Regionen des Gehirns Nagetier ist, ein wichtiges Instrument, die von den Forschern verwendet, um Antworten auf pathologisch beobachten reizen beteiligt. Solche Studien haben jedoch den Nachteil Neuronen nur 2D und ohne ihre Glia Support-System zu betrachten. Darüber hinaus unmöglich, es sei denn unter Bedingungen mit sehr hoher Dichte (640 Neuronen/mm2 oder etwa 16 % der Fläche) in dem sie angebaut, zufällige Auswuchs von einem Dendriten und Axon für mehr als eine kurze Strecke von den Zellkörper, hippocampal folgen neuronalen Lebensfähigkeit sinkt über 4 Wochen deutlich1, Begrenzung der Verwendung von dissoziierten Kulturen für erweiterte Studien von altersbedingten Krankheiten. Die Kultivierung von Scheiben aus Nagetier Gehirn vorbereitet, ist eine attraktive Option, die diese Grenzen überwindet durch die Aufrechterhaltung einer organisierten Zellarchitektur und Lebensfähigkeit für Wochen oder Monate. Bedingungen für die Aufrechterhaltung von vielen verschiedener Regionen Nagetier Gehirn im Stück Kultur wurden beschrieben2.

Zwei wichtige Methoden sind am meisten benutzt für langfristige Kultur Gehirnscheiben: Kultivierung auf Membranen in der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle3 oder Kultivierung auf Deckgläsern in versiegelten Röhren um in einem Roller-Inkubator Belüftung4zu drehen durfte. Scheiben-kultivierte auf Membranen können direkt mit hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem aufrechten Mikroskop und Wasser eintauchen Ziele5abgebildet. Alternativ wurden Scheiben kultiviert auf Membranen in Glasschalen unten gute Auflösung von dendritischen Dornen mit einer inversen Mikroskop6erreicht übertragen. Jedoch sind beide Methoden von imaging-Scheiben auf Membranen angebaut offene Systeme, die mittlere Änderungen erfordern und oft Antimykotika und/oder Antibiotika zur Verhinderung oder Reduzierung der Verschmutzung5,6. Scheiben auf einer Membran an der Luft-Medium-Schnittstelle pflegen ausgezeichnete Morphologie und überleben, aber Rückkehr zur genauen Standorte während der sich wiederholenden Bildgebung bei hoher Vergrößerung ist extrem schwierig, es sei denn, das Experiment nur kleine Gruppen von Zellen folgt mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Markers. Obwohl Scheiben gewachsen auf Membranen mit viral-vermittelten Expression von transgenen5,6 verwendet wurden, können biologische Sicherheit Protokolle erfordern eine geschlossene Kultursystem eingesetzt werden, für bestimmte virale Vektoren, die für verwendet werden mit dem Ausdruck Eindringmittel getaggt Proteine und Reporter der Zellphysiologie. Darüber hinaus erfordern eintauchen Ziele Dekontamination zwischen Proben, die in Kultur5folgen werden. Eine wichtige Anwendung der Membran Schnittstelle Kulturen verbindet hochauflösende Bildgebung mit Elektrophysiologie bei Mal Punkte7.

Die Walze Rohr Methode mit Deckgläsern in das Kunststoffrohr lässt keine Elektrophysiologie oder hochauflösende Bildgebung ohne das Deckglas. So wurde diese Methode in den meisten Fällen zu Langzeitstudien angewendet in der Post-Fixierung Beobachtungen8vorgenommen wurden. Hier beschrieben, ist eine Methode, die nutzt die Walze Rohr Kultur Technik aber auf gebohrt-Out Röhren mit Scheiben auf Deckgläsern, die wiederholt können, so lange wie die Kulturen abgebildet werden sind gepflegt. Das geschlossene System erfordert keine mittlere Änderung für die Bildgebung und nutzt komplexeste Deckgläsern treuhändische Marken bieten, die es ermöglichen, imaging bei hoher Vergrößerung, nach Tagen oder Wochen, die präzise Felder vorher abgebildet.

Wir wenden diese Methode, um Änderungen im Nagetier Hippocampus, einer wichtigen Hirnregion beteiligt, Gedächtnis und lernen zu untersuchen. Nagetiere-Hippocampus ist oft untersucht, als Modell für pathologische oder altersbedingten Veränderungen, die während der Entwicklung der kognitiven Beeinträchtigung9, wie n. Chr. auftreten beobachtet. Unsere Methode eignet sich besonders gut für pathologische Veränderungen zu studieren, die innerhalb einer einzigen Scheibe zu im Laufe der Zeit als Reaktion auf Veränderungen der Umwelt, wie z. B. Anstieg der Aβ-Peptide entwickeln, die ist charakteristisch für AD8. Eine Pathologie mit menschlichen und Nagetier AD Gehirn verbunden ist das Vorhandensein von Cofilin-Aktin-Aggregate und Stangen, die letztere mit Bündel von Fäden in denen Cofilin und Aktin sind in einem 1:1 Molverhältnis10,11, 12. Stäbe in festen Scheiben des Ratte Hippocampus nach Aβ-Behandlung, sowie in eine live Nagetier Gehirn-Scheibe mit dem Ausdruck Cofilin-GFP Hypoxie8ausgesetzt eingehalten worden, und sie können zu der synaptischen Dysfunktion gesehen in AD und Schlaganfall. Hier verwenden wir diese neue Methode der Kultivierung der zeitlichen Verlauf und Verteilung in Scheiben zum Ausdruck gebrachten exogene Chimären fluoreszierende Proteine durch verschiedene Viren eingeführt. Wir nutzen dann die neuronale Konkretisierung von Cofilin Reporter Konstrukt, die Entwicklung von Cofilin Stab und aggregierte Pathologie in hippocampal Scheiben in Reaktion auf die Behandlung mit löslichen Aβ Oligomere (Aβo) verfolgen.

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Protokoll

Verwendung von Tieren folgt genehmigten Zucht und Verwendung von Tieren-Protokolle, die konform zu den Animal Care und verwenden Richtlinien der Colorado State University.

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Kultur für die langfristige Inkubation und intermittierende Bildgebung des Hippokampus Scheiben. Eine einzige hippocampale Scheibe mit einem speziell präparierten komplexeste Deckgläschen mit einem Plasma Klumpen verbunden ist, und dann die Deckgläsern auf der flachen Seite des gebohrt-Out Tuchwelle, die in einem Roller-Inkubator beibehalten wird versiegelt. Plasma-Klumpen sind mit Plasmin vor Virusinfektion für fluoreszierende Protein-Expression und hochauflösende Bildgebung aufgelöst. Ein Fluoreszenzfarbstoff neuronaler vitaler wird verwendet, um Bild-Neuronen innerhalb der Scheiben.

1. Vorbereitung der Roller Tube Rack

  1. Verwendung der Vorlage in Abbildung 1A gezeigt gedruckt auf die Größe, die auf der Skala angezeigt. Mit einem Nagel Punsch (groß genug für einen feinen Spitze Marker) kleine Löcher in der Vorlage zentriert auf den Löchern.
  2. Legen Sie die Vorlage auf der Unterseite der 15 cm Gewebe Kulturschale (nominalen Durchmesser von 14 cm) und markieren Sie die Position der Löcher. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf einen zweiten Teller geben.
  3. Bohrungen Sie mit Bohrern, konzipiert für den Einsatz auf Kunststoff sechs 1,5 cm Durchmesser auf jedes Gericht in einer hexagonalen Anordnung (4,8 cm Mitte-Mitte) mit Bohrungsmittelpunkte 2,5 cm vom Rand der Schale. Bohren Sie drei Löcher (3 mm im Durchmesser) 12 mm von der Kante, die äquidistant zwischen zwei der größeren Löcher wie in Abbildung 1Aplatziert werden.
  4. Mit den Böden der einzelnen Gerichte einander gegenüber, legen Sie eine 2,5 Zoll lange Maschinenschraube (3/16 Zoll Durchmesser) mit Unterlegscheibe durch eines der kleinen Löcher, gefolgt von einer zweiten flache Unterlegscheibe, ein Stück aus Polyethylen Schläuche (Spacer, 4,7 cm), eine weitere flache Unterlegscheibe , das zweite Gewebekultur-Gericht, eine weitere flache Unterlegscheibe, eine Sicherungsscheibe und einer Mutter.
  5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 auf die anderen beiden Maschinenschrauben und nur lose anziehen, bis alle Maschine Schrauben vorhanden sind. Dann die Muttern fest anziehen.
  6. Arbeiten die Ösen (5/16 Zoll dick, 5/8 Zoll Durchmesser) in die Löcher der unteren Schale, die endgültige Tuchwelle Rack zu erhalten (Abbildung 1B; mit zwei Röhren im Ort gezeigt). Legen Sie einen Aufkleber, auf jedes Rack mit einer eindeutigen Nummer.

2. Vorbereitung des Roller-Röhren und Deckgläsern

  1. Herstellung der Spannvorrichtung für Bohrung in Walze Röhren
    1. Bohren Sie ein Loch von 1,5 cm 8 cm tief in der Mitte Seite von einem 2 x 4 x 5,5 Zoll Holzblock in einem Winkel so, dass die flache Seite der Walze wird Rohr werden fast parallel mit dem Block beim Einfügen (Abb. 2A).
    2. Vergrößern Sie das Loch mit einer Rundfeile Holz sowohl erweitern und verjüngen das Loch um Rohr Einfügung zu ermöglichen (Walze Rohre sind etwas größer im Durchmesser in der Nähe von GAP-Ende) (Abbildung 2B).
    3. Eine Bohrung 1,5 cm Durchmesser vertikal, 5,5 cm von der Seite des Blocks, und mittig über dem seitlichen Loch (Abbildung 2C).
    4. Wenn die seitlichen Loch genug konisch ist, legen Sie eine Tuchwelle, die gekennzeichnet ist, an der gewünschten Stelle zu zentrieren Sie das Loch für den Slice und positionieren das Rohr so, dass die markierte Stelle zentriert ist in die senkrechte Bohrung 1,5 cm.
    5. Entfernen Sie den Schlauch und Messen Sie den Abstand vom Punkt bis zum Ende des Rohres. Markieren Sie diesen Abstand von der Mitte des Lochs in der Spannvorrichtung und legen Sie einen Nagel bieten einen Stopp, um das Rohr zum Bohren (Pfeil in Abbildung 2C) richtig zu positionieren.
    6. Verwenden Sie eine Metallsäge bündig mit der Oberfläche der Holzklotz zum Schutz vor Verletzungen den Nagel abzuschneiden.
    7. Fügen Sie Federklemmen auf der Unterseite der Jig, wenn gibt es eine Bohrmaschine mit Slots, die es sein lassen (Abbildung 2D schwarzen Pfeil) verankert. Andernfalls verwenden Sie C-Klemmen, halten Sie die Schablone fest auf die Bohrmaschine.
  2. Mit Hilfe der Schablone beschriebenen zu halten und eine flache doppelseitige 11 cm Kunststoff Kultur Röhre mit der flachen Seite nach oben (Abb. 2A) zu positionieren, Bohren Sie ein Loch mit 6 mm Durchmesser mit dem Zentrum 1,0 cm über dem Boden und zwischen den Seiten des Rohres zentriert.
    Hinweis: Ein Bohrer für Plastik entwickelt sollte verwendet werden.
  3. Mit einem schwenkbaren Entgrat-Tool, glätten Sie die Kanten des Loches (Abb. 2E) und 4 Rillen auf der Innenseite machen Kante der Bohrung (Abbildung 2E, inset) Erleichterung der Trockenlegung des Lochs während der Rotation.
  4. Stanzen Sie mit einem 12 mm Loch, schneiden Sie 12 mm Durchmesser Scheiben aus ungiftigen Doppel doppelseitigen Klebstoff Silizium Gummiplatten. Mit einem standard ein Papier Locher (6 mm Durchmesser), ein Loch in der Mitte jeder Scheibe machen.
  5. Spülen Sie die gebohrte Rohre mit 70 % Ethanol, Luft trocknen in einem biologischen Sicherheitsschrank und die Rohre und die gestanzten selbstklebenden Scheiben für 40 Minuten unter der UV-Lampe (30 W bei durchschnittlichen Abstand von 70 cm) in der biologischen Sicherheitsschrank zu sterilisieren.
  6. Positionieren Sie die Rohre und Platten nach 20 min damit alle Sichtflächen sterilisiert werden. Unter sterilen Bedingungen das weiße von einem selbstklebende CD/DVD sichern ziehen Sie ab und bringen Sie der Silikon-Kautschuk an der Außenseite eines Rohres, Ausrichten der Löcher (Abbildung 2F an).
    Vorsicht: Zur Vermeidung von UV-Exposition tragen Sie Augenschutz und schließen Sie den Schrank vor dem Einschalten der UV-Lampe.
  7. 12 mm Durchmesser Foto-(100 Mitte nummeriert 1 mm Quadrate) deutsche Glasdeckgläser zu reinigen. Halten Sie die Deckgläsern vorsichtig mit einer Pinzette und Tauchen Sie ein in absoluten Ethanol, gefolgt von Wasser, gefolgt von absoluten Ethanol wieder, und schließlich tauchen Sie die Deckgläsern in eine Flamme zu verbrennen das Ethanol. Lassen Sie Deckgläsern abkühlen.
  8. Halten Sie die Deckgläsern mit Zangen, Tauchen Sie in 2 % 3-Aminopropyltriethoxysilane in Aceton für 10 S. Spülen Deckgläsern mit Reinstwasser und an der Luft trocknen.
  9. Die Deckgläsern auf steriles Filterpapier innerhalb einer biologischen Sicherheit Kabinett und schalten Sie das UV Licht. Jede Seite des Deckgläsern 20 min aussetzen.
    Vorsicht: Zur Vermeidung von UV-Exposition tragen Sie Augenschutz und schließen Sie den Schrank vor dem Einschalten der UV-Lampe.

(3) hippocampal Slice-Vorbereitung

  1. Bereiten Sie vor Beginn der Dissektion Hälften des zweischneidiges Rasierklingen für die Gewebe-Chopper. Falten Sie die Messer längs sorgfältig mit den Fingern und snap in zwei Hälften.
  2. Spülen Sie die Klinge-Hälften mit Aceton mit einem Wattestäbchen zu reinigen, gefolgt von Spülen in absoluten Ethanol und lufttrocknend.
Vor der Montage eine halbe Klinge auf der Gewebe-Chopper, Sterilisieren sie durch Spülen mit 70 % Ethanol.
  • Folgen Sie Protokolle, die durch die institutionellen Animal Care and Use Committee genehmigt; nach der Isoflurane Narkose einschläfern Sie 4-7 Tage alte Maus oder Ratte Pup durch Enthauptung und entfernen Sie den Kopf mit einer Schere oder Guillotine.
    Hinweis: Das Gehirn Stück Kultur Protokoll ist unabhängig vom Genotyp, Maus oder Ratte Sorte. Viele transgene Mauslinien mit verschiedene genetische Hintergründe wurden verwendet.
  • Spülen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol, und legen Sie sie in einem 60 mm Petrischale. Bis die endgültige Montage des Gehirns Slice auf der Tuchwelle, werden alle folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Haube zu Sterilität durchgeführt.
  • Mit einem #21 chirurgischen Klinge, machen Sie einen sagittalen Schnitt durch die Haut und Schädel. Mit einem #5 Dumont Pinzetten zurück Schälen der Haut und der Schädel das Gehirn aussetzen.
  • Herauszuarbeiten Sie mit geschlossenen Pinzette sanft, das ganze Gehirn durch Kneifen mit der Zange durch den Hirnstamm hinter das Kleinhirn loslassen. Legen Sie das Gehirn in eine sterile 60 mm Schale mit 4 ° C Gey ausgewogen Salz Solution/0.5% Glukose (GBSS/Glukose).
  • Mikroskop eine Dissektion des Gehirns (Abbildung 3) zu visualisieren, stellen Sie die Gehirn dorsalen Seite nach oben und im vorderen Drittel des Gehirns und das Kleinhirn mit einer chirurgischen Klinge (Abbildung 3B) abgeschnitten.
    1. Halten Sie mit der Pinzette die getrimmte Gehirn hinteren Seite nach oben und Bauchseite gegen die Seite der Petrischale für Stabilität. Sanft necken Sie entfernt Hirnhaut in der sagittalen Mittellinie zu und entfernen Sie das Mittelhirn-Gewebe mit einem feinen Spitzen Dumont Nr. 5 Zangen (Abbildung 3C, gestrichelter Kreis).
    2. Machen Sie zwei Schnitten entlang der Seite des Gehirns, um es zu öffnen (Abbildung 3C, gestrichelte Linien) zu verbreiten. Sobald das Gehirn dorsalen Seite nach unten und gespreizt platziert wird, sollte die hippocampale Fissur sichtbar sein (Abbildung 3D, Pfeil).
    3. Übertragen Sie die Ausbreitung offene Gehirn auf ein Stück Polychlorotrifluoroethylene Kunststoff-Folie und positionieren Sie es zum Schneiden auf der Bühne von einem Gewebe-Chopper. Benetzen Sie die Klinge mit GBSS/Glucose und schneiden Sie Hippocampus in ~ 300 µm dicke Scheiben.
    4. Spülen Sie mit einer Transferpipette die in Scheiben geschnittenen Gehirn aus Kunststoff-Folie in eine frische 60 mm Schale mit GBSS/Glucose (Abbildung 3E). Sanft Kneifen Sie und necken Sie entfernt, mit feinen Spitzen Pinzette, die restlichen Meningen und andere nicht-hippocampal Gewebe (Abbildung 3F) von den Scheiben (Abbildung 3G, H).

    • (4) Beschichtung Scheiben

    1. Gewonnene Scheiben stellen Sie 2 µL Huhn Plasma auf die Mitte der komplexeste Seite des vorbereiteten Deckglas. Verbreiten Sie das Plasma leicht um eine 3-4 mm Durchmesser vor Ort zu erreichen.
      Hinweis: Die komplexeste Seite ist die Oberseite des Deckglases durch eine Dissektion Mikroskop betrachtet, so dass die Zahlen korrekt ausgerichtet sind.
    2. 1 Gehirn-Scheibe mit einem sterilen schmal-Tip-Spatel (Abb. 4A) auf der Plasma-Spot (Abbildung 4B) übertragen. Verwenden Sie geschlossene Zange weiterhin die Scheibe an der Spitze der Spachtel beim Anheben der Scheibe aus GBSS/Glukose.
    3. Berühren Sie den Spatel in das Plasma vor Ort auf dem Deckglas und mit geschlossenen Zangen, drücken Sie die Scheibe auf das Deckglas.
    4. Mix 2,5 µL des Plasmas mit 2,5 µL Thrombin in einem separaten Rohr. Platzieren Sie schnell 2,5 µL dieser Mischung über und rund um die Scheibe und Pipettieren oben und unten leicht um zu mischen (Abbildung 4B).
      Hinweis: Das Plasma wird innerhalb von 10-15 s, Blutgerinnung, so dass dies schnell erfolgen muss. Wenn Slice Haftung ein Problem ist, mischen Sie 5 µL Plasma mit 5 µL Thrombin und verwenden Sie 4-5 µL auf der Scheibe, entfernen Sie einige nach dem Mischen, so dass die Scheibe flach auf das Deckglas liegt.
    5. Entfernen Sie die klare Kunststoffabdeckung exponierten seitens der Silikon-Kautschukkleber zuvor angebracht, um eine Tuchwelle und das Deckglas mit Gehirn-Scheibe auf den Klebstoff ausrichten der Scheibe in der Bohrung (Abb. 4C).
    6. Um die Haftung zu gewährleisten, gelten Sie weichen, gleichmäßigen Druck auf das Deckglas mit dem Daumen durch das Deckglas gleichmäßig nach unten drücken und halten es für ca. 1 min während der Übertragung auf die biologischen Sicherheitsschrank.
    7. Fügen Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank 0,8 mL Kulturmedium für komplette Neurobasal A (Table of Materials hinzu) jedes Rohr (Abbildung 4D).
    8. Fließt ein 5 % CO295 % Luft-Gemisch durch eine sterile Baumwolle eingesteckt Pasteurpipette sicher von einer Schelle gehalten. Spülen Sie die Tuchwelle mit dem Gasgemisch und Röhrchen Sie rasch die, wie es um die Pipette entzogen wird.
    9. Beschriften Sie die Rohre mit der Slice-Nummer und rack-Reihe. Legen Sie Röhren einbauen möchten Walze, sicherzustellen, dass sie geometrisch ausgeglichen sind. Gibt es eine ungerade Anzahl von Rohren, fügen Sie Röhren, auszugleichen hinzu.
    10. Legen Sie die Regale in einem 35 ° C Walze Inkubator mit Walzen drehen der Walze am Rack über 10-13 RPH (Abbildung 4E). Um das Medium in den Boden der Röhrchen zu halten, Neigung des Inkubators zurück ca. 5° durch die Erhöhung seiner Front auf einem Brett.
    11. Geben Sie den Slice und Rohr auf eine Tabelle, die verwendet wird, um alle Informationen der Slice-Behandlungen und Beobachtungstagen aufzuzeichnen.
    12. Auf ca. 6. Tag in Kultur, 1 µL (0,002 U) aktive Plasmin hinzufügen jedes Rohr.
    13. Nachdem die Klumpen vollständig auflösen (in der Regel innerhalb weniger Stunden), das Medium zu entfernen und ersetzen es durch frisches Medium ohne Plasmin. Falls erforderlich, Scheiben können über Nacht mit Plasmin inkubiert und das Medium gewechselt am nächsten Tag.
    14. Scheiben sind in der Regel für mindestens 7 bis 10 Tage vor Gebrauch in Experimenten inkubiert. Aspirieren Sie Medium und am Tag 3 oder 4, am 7. Tag und alle 7 Tage danach wieder zu ersetzen.

    5. Vorbereitung des viralen Vektoren für Transgene Ausdruck

    Hinweis: Ausdruck von transgenen in Neuronen des Slice Kulturen wird entweder mithilfe von Gehirnen von gentechnisch Nagetiere oder durch die Einführung des Transgens durch eine Infektion mit rekombinanten Replikation mangelhaft Viren erreicht.Adenoviren (AV), Adeno-assoziierten Viren (AAV) und rekombinanten Lentivirus Vektoren haben alle für den Ausdruck der verschiedenen fluoreszierenden Proteins Chimären in Hirnschnitten in unseren Kulturen hippocampal Scheibe aufgebraucht.

    1. Bereiten Sie Replikation mangelhaft AV für das Ausdrücken der RNS des Interesses nach Methoden an anderer Stelle beschrieben13,14. Titer die Viren für infektiöse U/mL durch die serielle Verdünnungsmethode mit einem Antikörper zu einem viral exprimierten Protein als14beschrieben. Zur Beobachtung Cofilin Aggregate und Cofilin-Aktin Stab Bildung Cofilin-R21Q-mRFP cDNA (Plasmid #51279)16nutzen.
      Hinweis: Der synapsin 1 Projektträger ist eine ausgezeichnete Wahl für neuronale Konkretisierung15, während der Zytomegalievirus Projektträger nützlich ist für hohe Expression Ebenen in vielen Zelle Arten13fahren.
    2. Bereiten Sie AAV durch Co-Transfektion von Transfer Plasmid enthält das gen des Interesses und ein Rep/GAP-Plasmid, mit oder ohne einen Helfer-Plasmid in HEK293 Verpackungszellen, die die virale E1-Gens, wie zuvor beschrieben17,18liefern vor.
      Hinweis: Rekombinanter AAV kann auch für gezielte Einfügung in die Host Zelle Genom19erfolgen. Für die Übertragung Plasmid verwenden wir menschliche Cofilin 1 mit einem C-terminalen mRFP1 Fluoreszenz Protein-Tag (Plasmid #50856) in ein synapsin Promotor-haltigen AAV Plasmid flussabwärts von Kalzium Sensor GCaMP5G20kloniert. Ein Stück DNA Kodierung der P2A selbst anhaftenden Peptidsequenz wird mittels PCR zwischen GCaMP5G und Cofilin-RFP während der Vorbereitung des Plasmids Transfer zum Ausdruck der beiden Proteine aus einer einzigen AAV Transcript21eingefügt.
    3. Bereiten Sie rekombinante Lentivirus Vektoren durch Co-Transfektion von Transfer-Plasmid enthält das Gen oder die cDNA von Interesse und Integration Signalen, zusammen mit einem dritten Generation Lentivirus Verpackung Mischung, die die virale Gag, Pol, Rev und Vsv-g Gene auf teilt drei separate Plasmide22,23.
    4. Verwenden Sie für den Transfer-Plasmid einen einzigen Schritt Klonen System24 zusammenzubauen Wirbeltiere Förderer und Cofilin-R21Q-mRFP cDNA (von Plasmid #51279) in pLKO.1-GLP (Plasmid #30323), mit der Wirbeltiere Projektträger und Cofilin-R21Q-mRFP ersetzen die hPGK Projektträger und GFP cDNA, beziehungsweise.
    5. Transfizieren Sie das endgültige Plasmid in HEK293T Zellen durch Calcium-Phosphat als zuvor beschriebenen23.
    6. Sammeln Sie Medium aus vier 10 cm-Gerichte zu, konzentrieren Sie, 500 µL mit 150K-Cutoff zentrifugale Konzentratoren und speichern Sie die endgültige Lentivirus bei-80 ° C in kleinen Aliquote nach dem schnellen Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Tauen Sie einen aliquoten nur einmal für Zellen zu infizieren.
    7. Bestimmen Sie empirisch, dass die Lautstärke der einzelnen Virustypen bereit, die den Grad des Ausdrucks durch die Einrichtung einer Anzahl von unterschiedlichen Slice Kulturen, den Ausdruck der transgene nach Infektion mit verschiedenen Mengen des Virus zu folgen gewünscht zu erreichen.
      Hinweis: In der Regel wird 1-10 µL des Virus pro Scheibe verwendet.

    6. Scheibe Behandlungen

    1. Scheiben mit Virus infiziert
      1. Arbeiten in einer biologischen Sicherheitsschrank für Virus Arbeit bei der biologischen Sicherheitsstufe für den Vektor zugelassen, mischen Sie ein Aliquot des Virus (in der Regel 1-10 µL) mit 0,8 mL komplette Medium.
      2. Aspirieren Sie das Medium von der Scheibe mit einem sterilen Pasteurpipette in eine Sammlung-Falle, die Bleichmittel enthalten. Eine sekundäre Falle wird immer zwischen die erste Falle und die Vakuumquelle verwendet.
      3. Ersetzen Sie dieses Medium mit der Virus-haltigen aliquoten oben vorbereitet, Kultur-Rohre zu einem Rack zurück und legen Sie in den Inkubator.
      4. Entfernen Sie nach 2-5 Tagen Inkubation die Scheiben mit Virus im biologischen Sicherheitsschrank den Virus-haltigen Mittel mit einem sterilen Transferpipette und legen Sie es in eine Flasche mit genehmigten antivirale Vermittler um das Virus zu töten.
    2. Färbung von Neuronen mit lebenswichtigen Farbstoff
      1. Bereiten Sie vor und speichern Sie Aliquote neuronalen vital Fluoreszenzfarbstoff25 durch schnelle Einfrieren 4 µL Aliquots in flüssigem Stickstoff bei einer Konzentration von 100 µM speichern Sie diese bei-20 ° C. Nicht Frost/Tau des Farbstoffs mehr als einmal.
      2. Beschriften Sie Neuronen für die Visualisierung von Fluoreszenz-Mikroskopie, Tauwetter ein Aliquot des neuronalen vital Farbstoffs und verdünnen bis 4 mL in kompletten Neurobasal Medium (letzte Farbstoff Konzentration beträgt 100 nM).
      3. Entfernen Sie das Medium aus Scheiben durch Absaugen (oder mit einer Pipette übertragen, wenn das Medium Virus enthält) und ersetzen Sie es mit 0,8 mL 100 nM neuronalen vital Farbstoff-haltigem Medium. Die Scheiben auf den Roller-Apparat in den Inkubator zurück.
      4. Nach Inkubation der Scheiben für 2 h, Aspirieren der Farbstoff-haltigen Medium und ersetzen Sie es mit 0,8 mL frisches komplette Medium in einer biologischen Sicherheitsschrank.
        Hinweis: Kennzeichnung von Neuronen in Scheiben mit lebenswichtigen Farbstoff erfordert mehrere Stunden Inkubation. Die ersten Bilder sind in der Regel 24 h nach der Farbstoff Behandlung genommen. Obwohl Neuronen speziell gekennzeichnet sind, gibt es Hintergrundfluoreszenz, die über 2-3 Tage abnimmt, besser neuronale Bildgebung zu geben. Intensität der lebenswichtigen Färbung lehnt nach 72 h.
      5. Um Änderungen in der Morphologie der Scheibe im Laufe der Zeit zu folgen, müssen Sie die Scheiben alle 7 Tage.

    7. Scheibe Imaging

    1. Scheiben auf einem inversen Mikroskop ansehen Für die hellsten Fluoreszenz-Bildgebung bei 24 h vor Bildgebung, Austausch von Kulturmedium mit kompletten Neurobasal A Medium ohne das Phenol Red-pH-Indikator.
      Hinweis: Für Experimente hier berichtet, sind Scheiben auf eine invertierte Spinning Disk konfokale Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit einer linearen codiert angesehen x, y-Bühne mit Piezo-Z-Steuerung und eine sensible hochauflösende digitale Kamera.
    2. Übertragen Sie das Rohr mit der Slice-Kultur, aus der Walze Rohr Vorrichtung, die maßgeschneiderte Rohrhalter (Abb. 5A), abgebildet werden erteilte im Stadium-Adapter (Abb. 5B), das Deckglas senkrecht zu halten Das Ziel und die Scheibe in der gleichen Orientierung während sich wiederholende imaging Sessions über lange Zeiträume zu erhalten.
    3. Schieben Sie den Schieberegler auf der Bühne-Adapter fest gegen das Rohr, das Rohr in Position (Abb. 5B) zu halten.
    Slice Temperatur bei 35 ° C während der Bildgebung durch Verwendung von Heizöl Streifen und einem thermoregulatorischen Controller integriert maßgeschneiderte Bühne Adapter (Abbildung 5C) zu halten.
    Hinweis: Details zu den Schlauchhalter inszenieren Adapter und Heizung abrufbar unter: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Mit einem low-Power (zB., 4 X) Ziel und Hellfeld Durchleuchtung, konzentrieren sich auf die komplexeste Gittermuster(Abbildung 6)unter der Scheibe. Für die erste bildgebende Sitzung schnell zu scannen, um die Scheibe zu lokalisieren und erfassen Sie die Anzahl für die verschiedenen Regionen, in denen höhere Vergrößerung Bildgebung gewünscht wird (z.B.Cornu Ammonis (CA) 1, CA3, dentate Gyrus (DG), etc.).
  • Verschieben Sie die Phase, die erste Planquadrat, enthält eine Region von Interesse. Wechseln Sie zu den 20 X Luft Ziel und suchen Sie eine treuhändische Mark (zB., Spitze einer geätzten Zahl) (Abb. 6B).
  • Wechseln Sie zu einer höheren Macht Objektiv (40 X oder X 60), lokalisieren Sie die treuhändische Mark und dann Rekord der x und y-Position der Bühne zu. Verschieben Sie die Phase, die Felder von Interesse in der Nähe und erfassen ihre x und y offsets aus die treuhändische Markierung (Abb. 6B, Pfeil) zu finden. Wiederholen Sie in anderen Netzbereichen, falls gewünscht.
    Hinweis: Diese Aufrechnung Positionen aus der treuhändische Mark ermöglichen konsequente Ermittlung des gleichen Ortes Deckglas wenn die Scheibe abgebildet wird, obwohl die ursprüngliche X, y Einstellung der treuhändische Marke ändert sich wenn die Röhre oder Bühne Adapter entfernt und ersetzt.
  • Erfassen Sie ein Bild Z-Stapel innerhalb jedes ausgewählte Feld mit dem Mikroskop Objektive Kontrolle oder ein Piezo Bühnensteuerung, falls vorhanden.
    Hinweis: Bildebenen sind in der Regel in Abständen von 0,5 µm bis 2 µm, je nach Größe und Auflösung der Bild-Funktionen erhalten. Aufbau ein 3D Qualitätsbild erfordert, dass Bild Funktionen erstrecken sich über mehrere Ebenen des Erwerbs, also um kleinere Funktionen zu visualisieren, kleinere Intervalle zwischen den Ebenen erforderlich sind.
  • Halten Sie die gesamte imaging-Zeit für jedes Segment so kurz wie möglich.
    Hinweis: Die meisten bildgebende Sitzungen berichtet hier unterstanden 18 min/Stück. Allerdings haben wir einige Scheiben mindestens zehn Mal und sogar als abgebildet solange 40 min in einer einzigen Sitzung, ohne offensichtlichen Schaden für das langfristige Überleben des Segments.

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    Ergebnisse

    Um festzustellen, wie genau so Markierungen können genutzt werden, um die gleichen Zellen in den gleichen Bereichen im Laufe der Zeit Reimaging, untersuchten wir Scheiben auf komplexeste Deckgläsern(Abbildung 6)angebaut. Neuronen wurden visualisiert durch Färbung mit einem vital-Farbstoff (100 nM für 2 h; nicht-neuronalen Zellen keine Flecken), die verschwindet aus Neuronen im Laufe der Zeit ohne Schädigung der Zellen-2...

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    Diskussion

    Die hier beschriebene Methode der Walze-Röhre ermöglicht langfristige Kultivierung und hochauflösende live Imaging von geschnittenen Hirngewebe. Ein großes Problem mit der Slice-Technik wie hier ist bei der Montage und Wartung von Scheiben. Deckglas Beschichtungen, die Slice-Adhäsion, unterstützen fördern Slice Ausdünnung durch die Stärkung der Auswuchs Neuriten und Wanderung von Zellen aus der Scheibe; wir vermieden die Verwendung dieser Substrate. Das Einfügen von Aminogruppen auf das Glas durch Behandlung mi...

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    Materialien

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Bottoms from 15 cm culture dishesVWR Scientific25384-326
    Phillips Head Machine Screws (#10-32)Ace Hardware2.5" long and 3/16" in diameter
    Flat Washers #10ACE Hardware
    Machine Screw Nuts (#10-32)ACE Hardware
    Rubber Grommets ACE Hardware5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD
    Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE HardwareCut to 1.8" length
    Lock Washer #10ACE Hardware
    Drill Press, 5 speed Ace HardwareProTech Model 1201
    Nunclon Delta Flat-Sided TubesVWR62407-076
    Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm Ace HardwareDiablo freud brandDrill bits for cutting plastic.
    Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mmAce Hardware
    Wood file, 1/4" roundAce Harware
    Spring clips, 16 mm snap holderAce Hardware
    Swivel Head Deburring Tool, 5"Ace Hardware26307
    Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal)Grace Bio-Labs6665810.5 mm Thickness
    6 mm hole punchOffice Max
    12 mm hole punchthepunchbunch.com
    70% Ethanol
    Phototeched Coverslips, 12 mm diameterBellco Glass, Inc.1916-91012
    Bunsen Burner
    Absolute Ethanol
    Nanopure Water
    3-aminopropyltriethoxylaneSigma-AldrichA3648
    AcetoneSigma-Aldrich179124
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    McIlwain Tissue ChopperTed Pella, Inc.10180
    Double Edge Razor BladesTed Pella, Inc.121-6
    Whatman Filter PaperVWR28450-182Cut into 5.8 cm diameter circles
    Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Cut into 5.8 cm diameter circles
    #21 Surgical BladeVWR Scientific25860-144
    #5 Dumont ForcepsFine Science Tools11251-30
    Spatula, stainless with tapered endVWR82027-518
    Gey's Balanced Salt SolutionSigma-AldrichG9779 
     GlucoseThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
    Chicken PlasmaCocalico Biologicals30-0300-5LRehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at  -80 °C.
    Thrombin, Topical (Bovine)PfizerThrombin-JMIQuick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL.
    Cell Roller SystemBellco BiotechSciERA
    Roller IncubatorFormaModel 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pen/Strep (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutamineThermoFisher Scientific25030081
    GlucoseThermoFisher Scientific15023-02125% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep.
    Third generation lentivirus packagingLife TechnologiesK4975-00
    159 K cutoff centrifugal filters (Centricon)EMD Millipore
    Lentiviral cloning system (InFusion)Clonetech
    Plasmids 30323, 50856, 51279Addgene
    Neuronal cell viability dye (NeuO)Stemcell technologies1801Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C
    Inverted microscopeOlympusIX83
    Microscope objectivesOlympusair: 4X, 20; oil: 40X, 60X,
    Spinning disc confocal systemYokagawaCSU22
    Microscope EMCCD cameraPhotometricsCascade II
    Linear encoded (x,y), piezo z flat top stageASI
    Microscope lasers and integrationIntelligent Imaging Innovations
    HEK293T cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
    Human PlasminSigma AldrichP18670.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C.

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