نموذج الماوس إشعال الناجمة عن بينتيلينيتيترازولي

Summary

توضح هذه المقالة طريقة لإشعال المواد الكيميائية مع بينتيلينيتيترازولي هذا البروتوكول ويقدم نموذجا ماوس من الصرع. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في التعرض للاستيلاء على الاستقراء والمرضية بعد نوبات الصرع في الفئران.

Abstract

بينتيلينيتيترازولي (بتز) خصم مستقبلات GABA A. حقن داخل من بتز في حيوان يدفع مصادرة حادة، شديدة بجرعة عالية، بينما استخدمت حقن متسلسلة من جرعة سوبكونفولسيفي لتطوير مادة كيميائية إشعال، نموذج لصرع. يدفع حقن جرعة منخفضة وحيدة من بتز نوبة خفيفة دون تشنج. بيد المتكررة حقن جرعة منخفضة من بتز انخفاض عتبة تثير نوبة التشنجية. أخيرا، الحث المستمر الإدارة جرعة منخفضة من بتز الاستيلاء منشط بهلوانية شديدة. هذا الأسلوب بسيطة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع للتحقيق في الفسيولوجيا المرضية للصرع، الذي يعرف بأنه أمراض مزمنة التي تتضمن نوبات متكررة. هذه المادة الكيميائية إشعال البروتوكول تسبب النوبات المتكررة في الحيوانات. مع هذا الأسلوب، قدرت التأثر بوساطة بتز المضبوطات أو درجة تفاقم نوبات الصرع. وأدت هذه المزايا لاستخدام هذا الأسلوب لفحص العقاقير المضادة للصرع والجينات المتعلقة بالصرع. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت هذا الأسلوب للتحقيق في الأضرار العصبية بعد نوبات الصرع لأن تظهر أيضا التغييرات النسيجي لوحظت في أدمغة مرضى الصرع في أدمغة الحيوانات اوقدت الكيميائية. وهكذا، هذا البروتوكول مفيد لسهولة إنتاج نماذج حيوانية للصرع.

Introduction

الصرع هو اضطراب عصبي مزمنة التي تتسم بالنوبات المتكررة، ويؤثر على ما يقرب من 1 في المائة شعب. لا يمكن توضيح الآليات الكامنة من جيل ابيليبتوجينيسيس وضبطها في مرضى الصرع تماما في الدراسات السريرية. ولذلك، مطلوب نموذج حيوان مناسب لدراسة الصرع¹.

وقد استخدمت مجموعة متنوعة من نماذج حيوانية للصرع للتحقيق في علم وظائف الأعضاء الصرع وتحديد العقاقير المضادة للصرع^2،3. بين هذه النماذج، تحريض الاستيلاء الدوائي طريقة شائعة تستخدم لتوليد نموذج حيوان للتحقيق في علم الأمراض الصرع⁴. هذا الأسلوب غير مكلفة وبسيطة. قطب كهربائي بوساطة إشعال أيضا طريقة شائعة استخدام، ولكن تكاليف هذا الإجراء أعلى، والأسلوب يتطلب المهارات الكهربائية والعمليات الجراحية للحث على مضبوطات المتكررة⁵.

التعريفي الدوائية مفيد أيضا لأنه يتم التحكم في توقيت وعدد المضبوطات بسهولة. كما تستخدم نماذج الماوس الوراثية التي يحمل مضبوطات عفوية في الدراسة للصرع. ومع ذلك، قد يكون التنبؤ متى وكيف في كثير من الأحيان المضبوطات تنشأ في هذه النماذج الوراثية المستحيل⁶. مطلوب نظام رصد مراقبة سلوك الفئران المعدلة وراثيا⁶الصرع.

حمض كينك وبيلوكاربيني وبينتيلينيتيترازولي (بتز) تستخدم على نطاق واسع كالمخدرات الذي يحفز الاستيلاء على⁷. حمض كينك مؤثر على مستقبلات الغلوتامات، و pilocarpine ينشط مستقبلات اتروبين. بتز حمض غاما أمينوبوتيريك (GABA)-خصم مستقبلات⁸. يمنع بتز وظيفة الاشتباكات العصبية المثبطة، مما يؤدي إلى زيادة نشاط الخلايا العصبية. هذه اللائحة يسبب النوبات المعممة في الحيوانات⁹. حقنه واحدة من حمض كينك وبيلوكاربيني يمكن أن يستحث مضبوطات الحادة، لا سيما مركز epilepticus (جنوب شرق)^10،11 وكينك حمض-أو بيلوكاربيني-بوساطة سراج الدين يعزز مضبوطات عفوية والمتكررة المزمنة^{12 , 13}-بينت تسجيلات اليكترونسيفالوجرافيك (EEG) وتحليل السلوك الالتزام بعفوية النوبات المتكررة بعد^12،حقنه واحدة¹³شهر. حقنه واحدة لجرعة التشنجية من بتز يستحث أيضا الاستيلاء على حدة. ومع ذلك، المضبوطات عفوية المزمنة بعد حقنه واحدة من بتز صعبة لتعزيز. الإدارة المزمن من بتز مطلوب للحث على مضبوطات المتكررة¹⁴. في أي من الطريقتين، يتم توليد النوبات المتكررة قادرة على حمل علم أمراض أكثر مشابهة للصرع البشرية من جيل مضبوطات الحادة. في حالة بتز، يستحضر كل حقن من الاستيلاء، ويصبح أشد شدة الاستيلاء بطريقة تدريجية مع كل حقن. وأخيراً، يدفع حقنه بتز جرعة منخفضة وحيدة الاستيلاء منشط بهلوانية شديدة. في هذه المرحلة، يستحضر كل حقن مضبوطات الحادة. وباﻹضافة إلى ذلك، الكمون الاستيلاء والمدة أيضا تغيير على مدى الحقن. زمن الوصول للاستيلاء على منشط غالباً ما يصبح أقصر في المرحلة الأخيرة من إشعال¹⁵. وعلاوة على ذلك، تفاقم الاستيلاء يرافقه مدة حجز مطول¹⁶. التحقيق الآلية الجزيئية تنظيم شدة الاستيلاء، الكمون، ومدة مفيد لفحص العقاقير المضادة للصرع^17،،من¹⁸¹⁹.

المضبوطات هي عادة الناجمة عن إدارة منهجية واحدة من بتز، والانتعاش سريع جداً، في غضون 30 دقيقة^4،5. وهكذا، عدد المضبوطات يمكن التحكم أكثر في نموذج إشعال بتز. بيد أن رصد EEG أوضحت أن المسامير المعمم قد يعتبر ما يصل إلى 12 ساعة بعد وساطة بتز مصادرة²⁰. ولذلك، ينبغي أن تظل الحيوانات يفضل أن يكون ذلك تحت المراقبة 24 ساعة بعد الاستيلاء على رمعيه أو منشط²¹ لتحليل أكثر دقة آليات إشعال.

إدارة العقاقير المضادة للصرع، مثل اثوسوكسيميدي، فالبرويت، الفينوباربيتال، فيجاباترين وريتيجابيني³، قبل أو بعد حقن بتز يخفف من تفاقم الاستيلاء على شدة^{3،22، 23}. وبالمثل، أظهرت الفئران خروج المغلوب أن نقص الجينات متورطة في تفاقم مصادرة، مثل مصفوفة أية-9²⁴، 22 صندوق الأجيال القادمة²⁵ ونيوريتين²⁶، يحمل الاستيلاء على انخفاض حدة عقب حقنات متعددة بتز. وباﻹضافة إلى ذلك، مراقبة تغييرات نسيجية بعد نوبات الصرع ممكن مع هذا الأسلوب. في المرضى الذين يعانون من الصرع الفص الصدغي، هناك نموذجي تغييرات نسيجية في الدماغ، مثل الألياف المطحلب تنتشر الخلايا العصبية، أستروجليوسيس^3027،28، الحبيبية الشاذ العصبية الهجرة²⁹ الوفاة في قرن آمون^31،32والتصلب هيبوكامبال³³. ولوحظت تغييرات مماثلة في الحيوانات النموذجية الصرع. بين الأساليب المتاحة، تأجيج الكيميائية بتز بوساطة طريقة جيدة واستنساخه وغير مكلفة لإنتاج نموذج حيوان من الصرع. في طراز SE بيلوكاربيني بوساطة، الاستيلاء على التحكم صعب ويموت العديد من الفئران أو تفشل في وضع سراج الدين³⁴. وفي المقابل، الوفيات وشدة الاستيلاء أكثر السيطرة عليها في نموذج بتز. بالإضافة إلى ذلك، بتز أقل تكلفة من حمض كينك، والمهارات في مجال جراحة الدماغ الماوس غير مطلوبة لإدارة المخدرات.

Protocol

وافق جميع الإجراءات التجريبية بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لطوكيو متروبوليتان معهد العلوم الطبية. بعد الولادة 8-ينصح الفئران عمرها 16 أسبوع. أي سلالة فطري مقبول للتجربة. الفئران C57BL/6 أكثر قدرة على مقاومة بتز، بينما الفئران ألبينو بالب/ج والسويسرية أكثر حساسية بتز. واستخدمت في هذه الدراسة C57BL/6. مشكلة عدم الحصانة بتز يعتمد أيضا على سن الماوس. بالمقارنة مع الفئران الأصغر سنا، الفئران الأكبر سنا أكثر مقاومة للحرارة إلى بتز³⁵. يمكن أن يختلف عدد الحيوانات المستخدمة لهذا الأسلوب، ولكن مالا يقل عن 6-10 الحيوانات المطلوبة لكل حالة.

1-إعداد بتز

1. حل 2 مغ/مل بتز العقيمة 0.9% (w/v) كلوريد الصوديوم. إعداد بتز اليوم من الاستخدام.

2-حقن بتز

1. القيام بتجارب جميع بين 09:00 ص و 12:00 م (ظهرا).
2. قياس وزن الجسم للحيوان.
3. وضع الحيوان في دائرة مراقبة التعود.
4. وخلال فترة التعود (3 دقائق)، حساب حجم الحل بتز لحقن استناداً إلى وزن جسم الحيوان وجرعة حقن سبق تحديدها.
   ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام 35 مغ/كغ بتز، مغ 0.875 من بتز مطلوب لماوس يزن 25 جرام (35 مغ/كغ × 0.025 كغ = 0.875 mg). ولذلك ينبغي أن يكون حقن ميكروليتر 437.5 حل بتز 2 مغ/مل (0.875 مغ/2 مغ/مل = 0.4375 مل). حقن جرعة بتز يعتمد على الماوس النمط الوراثي والسلالة. للفئران البرية من نوع C57BL/6، يوصي بجرعة 30-35 ملغ بتز/كغ من وزن الجسم في المحاكمة الأولى. حساسية بتز يعتمد على الماوس الضغط المستخدمة^36،37. أن حقن جرعة يختلف باختلاف غرض التجربة.
5. حقن بتز إينترابيريتونيلي بحقنه 1 مل المرفقة بإبرة قياس 27 في الربع الأيمن أو الأيسر من البطن للحيوان. تجنب الحقن في خط الوسط.
   1. تجنب تكرار الحقن في نفس الموضع.
6. مراقبة سلوك الحيوانات لمدة 30 دقيقة بعد الإدارة بتز (الشكل 1A)، وتصنيف ونقاط السلوك الشاذ كما هو موضح أدناه. إذا كان ذلك ممكناً، الاحتفاظ بالحيوانات تحت الملاحظة 24 ساعة، أو على الأقل إضافية 6-10 ح بعد حقنه، خاصة عندما يصل إلى درجة خطورة مصادرة 3 أو أعلى.
   1. ملاحظة أي مضبوطات معتدل أو التغيرات السلوكية في الحيوانات بعد فترة 30 دقيقة الملاحظة. وهذا لفترة طويلة المراقبة قد تناول الفترة تأثير أهمية خاصة وكاملة من جرعة سوبكونفولسيفي من بتز الجيل من المضبوطات دون سابق استفزاز المزمن في الصرع.
   2. وباﻹضافة إلى ذلك، قياس مدة الاستيلاء على كل مصادرة الملاحظة كالتغييرات في مدة الاستيلاء تتصل بشدة الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، زمن الوصول إلى مصادرة الأولى بعد حقن بتز تدبيرا هاما آخر لجمع. رصد تواتر الاستيلاء، والمدة، والكمون أمر حاسم لأي دراسات ما بعد الاستيلاء الجزيئية.
7. حقن بتز كل يوم (الشكل 1A). عدد الحقن يعتمد على هدف التجربة. فيما يلي الأمثلة التمثيلية.
   1. لتوليد الحيوانات اوقدت تماما، وبمجرد تجارب حيوان من الاستيلاء على النقطة 5 (منشط رمعي الاستيلاء)، الانتهاء من الحقن داخل الإدارات الثلاث الإضافية. وفي هذه الحالة، زيادة جرعة الحقن إذا لم زيادة درجة الاستيلاء لثلاث حكومات متتالية. يمكن أن يتلقى كل الحيوانات رقم مختلف وجرعة من حقن بتز.
   2. تحديد عدد وجرعة من حقن بتز في كل حالة لتقييم تعرض بتز، بما في ذلك تقييمات للأدوية المضادة الصرع ودراسات للنمط الظاهري للفئران المعدلة وراثيا. تعطي جميع الحيوانات بنفس عدد الحقن بتز؛ ويوصي بمجموعة من 8 إلى 12 الحقن. إذا مات حيوان، ينبغي الإشارة إلى نقاط الاستيلاء ك 6.
   3. تحديد جرعة الحقن اللازمة للحفاظ على ضبط ارتفاع نقاط (4 أو 5) لحقن 10 أو أكثر دراسة التغيرات التشريحية المرضية التي تحدث نوبات الصرع. في هذه الحالة، عدد الحقن الإجمالي يجب أن تتراوح من 25 إلى 30. إنقاص جرعة الحقن إذا كان الاستيلاء على نقاط يصل إلى 5. إذا انخفضت درجة الاستيلاء على 3 أو أقل، زيادة جرعة الحقن.

3-الاستيلاء على نقاط

1. مراقبة في سلوك الحيوانات وتسجيل النقاط.
   1. تصنيف وتسجيل السلوكيات الصرع كالتالي^38،39 (الشكل 1B):
      0: السلوك العادي، لا شذوذ.
      1: التثبيت، الكذب في البطن.
      2: رأس التقلصات الإيماء أو الوجه أو فوريليمب أو اللكتات.
      3: الهزات المستمرة التقلصات كامل الجسم، رمعيه، عقد ذيل تصنع.
      4: الضبط تربية، منشط، تسقط على جانبها.
      5: منشط رمعي الاستيلاء، تسقط على ظهرها، البرية التسرع والقفز.
      6: الموت.
2. قم بتغيير المعايير السلوكية استناداً إلى رأسين نقاط⁴⁰، تبعاً لظروف تجريبية.

4-الاستيلاء على ما بعد التحليل

1. تحليل إيمونوهيستوباثولوجيكال
   1. تثبيت التروية
      1. إعداد
         1. حل 4% (w/v) بارافورمالدهيد (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.4). الحرارة الحل إلى ما يقارب 70 درجة مئوية بالإضافة إلى قطره من هيدروكسيد الصوديوم 1 متر (حوالي 1 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 1 لحل منهاج العمل 50 مل).
         2. إعداد المثلج 4% منهاج عمل بيجين والفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
         3. إقامة مضخة تمعجية، مع الأنبوب والإبرة. قم بتشغيل حوالي 20 مل مياه من خلال أنبوب لمسح بقايا. ثم، ضع نهاية الأنبوب مفتوح في برنامج تلفزيوني المثلج.
      2. نضح ترانسكارديال وإعداد للدماغ ثابت
         1. تخدير عميق الماوس مع الإيثانول isoflurane/50% 50% في جرة صغيرة.
         2. تبقى الماوس في وضع ضعيف بتعلق نصائح الأمامية وهيندليمبس.
         3. قطع خط الوسط البطني من البطن وكشف الحجاب الحاجز.
         4. قطع الحجاب الحاجز على طول الهامش الساحلي. ثم قطع الجانبين الأفقي من أضلاعه والجسم. قرصه عملية الرهابه بالملقط تأمين وايفرت القفص الصدري. متمسكة بموقفها عملية الرهابه التي تعلق عليه بإبرة أو معسر فإنه مع الملقط. كشف القلب.
         5. أدخل الإبرة في البطين الأيسر وقطع في الاذين الأيمن باستخدام مقص. كن على علم لا لدفع الإبرة بعيداً جداً في القلب، كما أنه يمكن بيرس الجدران داخلية.
         6. بدء تدفق مستمر لبرنامج تلفزيوني المثلج من خلال الإبرة لتغسل الدم (حوالي 15-20 مل/دقيقة).
         7. عندما تم مسح الدم من الجسم، تحريك الأنبوبة إلى حل بارافورمالدهيد 4% (حوالي 60 مل) دون إضافة فقاعات. ثم قم بإيقاف في التروية.
         8. قص الرقبة الخلفي والعمود الفقري وتقشر الجلد الرأس والجزء الظهرية الجمجمة مع تشريح المقص.
         9. قطع عظم بريماكسيلاري بين مدارات العين وإزالة الجزء الظهرية للجمجمة.
         10. خلق فجوة بين الدماغ والعظام جوجال من الجانب الخلفي وقطع الأعصاب تريجيمينال و chiasm البصرية تحت الدماغ. بعناية إزالة الدماغ ووضعه في قنينة تحتوي على 4% منهاج عمل بيجين. بعد إصلاح الدماغ في 4 درجات مئوية عن ح 12-16.
   2. إعداد شريحة الدماغ
      1. نقل الدماغ ثابت إلى 20% السكروز/برنامج تلفزيوني حتى الدماغ المصارف في حل للسماح كريوبروتيكتيون.
      2. قص الدماغ الثابتة استناداً إلى اتجاه الشريحة المطلوبة والجزء المطلوب من الدماغ.
      3. تعيين كريوميكروتومي. تعيين بليد في الموقف والحفاظ على مرحلة مبضع عند درجة حرارة تقل عن-20 درجة مئوية.
      4. مكان في الدماغ قبل قطع على المسرح ومعطف الدماغ مع السكروز 20%/برنامج تلفزيوني. حل السكروز/برنامج تلفزيوني ستجمد تدريجيا، تغطي الدماغ في المرحلة، حتى الدماغ تماما مضمن في السكروز 20% مجمدة/برنامج تلفزيوني.
      5. شريحة الدماغ (30 ميكرون سمك) من انزلاق شفرة عن طريق الأنسجة. نقل الشرائح في برنامج تلفزيوني والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية.
   3. إيمونوهيستوتشيميستري نيون
      1. تغسل شرائح اللازمة في 0.1% تريتون العاشر-100/برنامج تلفزيوني (ببست) لمدة 10 دقائق، 3 مرات في درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. كتلة الشرائح التي تفرخ لهم في ببست مع 2% الماعز المصل أو 5% البقري ألبومين المصل (BSA) ح 1-2 في الرايت
      3. احتضان الشرائح في حلاً جسم مع تركيز مناسب من جسم الأولية في ببست مع 2% الماعز المصل أو 5% جيش صرب البوسنة أوفيرنايتس 1 إلى 7 في 4 درجات مئوية.
      4. تغسل الشرائح في ببست لمدة 10 دقائق، 3 مرات في الرايت
      5. احتضان الشرائح في حل جسم ثانوي مع تركيز مناسب لجسم الثانوية في ببست ح 1-2 في الرايت، محمية بالضوء.
      6. تحميل الشرائح على الشرائح الزجاجية وتغطية مع تصاعد المتوسطة وتغطية الزجاج.
      7. مراقبة الشرائح مع الفحص المجهري الأسفار.
2. 3-دائرة الاختبار
   1. إعداد
      1. إعداد على الأقل 2 2--الفئران 129/Sv عمره 6 أشهر من نفس الجنس كالفئران هذا الموضوع أن يكون الماوس "غريب". روض جميع الفئران في القفص قبل التحليل. لكل دورة تدريبية، ضع الماوس في القفص واترك الماوس لمدة 15 دقيقة.
      2. قبل كل مرحلة التعود مع الماوس هذا الموضوع، بتنظيف الجهاز برمته وكل الأقفاص بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      3. وضع الأقفاص الفارغة في الدوائر الجانبية على الجهاز 3-الدائرة وفتح الأبواب بين الدوائر.
      4. روض الماوس الموضوع، ضع ماوس موضوع في قاعة مركز والسماح للماوس للتنقل بحرية في جميع أنحاء الجهاز حتى الماوس وحقق كلا أقفاص، بالإضافة إلى القيام حيوانات موضوع الحد أدنى 5 إضافية قد تكون خوفاً من القفص لا التحقيق في القفص لمدة 20 دقيقة، ولا ينبغي أن تستخدم لهذا التحليل. تجنب القفص مثل هذه الحيوانات ونادراً ما تقترب من القفص.
      5. بعد انتقال الحيوان في قاعة المركز، إغلاق الأبواب وترك الماوس تتحرك بحرية في قاعة مركز لمدة 5 دقائق. وخلال هذه الفترة، وضع واحد من الفئران 129/Sv في قفص روض إلى القفص.
   2. تحليل بالمجتمع
      1. القيام بهذا التحليل مباشرة بعد فترة التعود الماوس هذا الموضوع.
      2. ضع القفص الذي يحتوي على ماوس 129/Sv، يطلق عليه "القفص غريب 1"، في واحدة من جانب الدوائر ومكان القفص فارغاً، يطلق عليه "القفص الكائن"، في قاعة جانبية أخرى.
      3. فتح الباب، ورصد سلوك الماوس هذا الموضوع.
      4. السماح لهذا الموضوع الماوس للتحرك بحرية لمدة 10 دقائق، وسجل المعلمات السلوكية التالية. إذا كان الماوس الموضوع يخاف من الماوس في القفص 1 غريب، كما هو مبين بالماوس تجنب القفص 1 غريب والمتبقية في الزاوية لإحدى الدوائر، ينبغي عدم استخدام الحيوان للتحليل.
         أ) الوقت المستغرق في كل دائرة، والدائرة 1 غريب، الدائرة الكائن، ومركز الدائرة.
         ب) الوقت المستغرق التحقيق في كل قفص والقفص 1 غريب والقفص الكائن. (الماوس تصنف على أنها للالتجلد بالماوس أو قفص أو التحقيق في القفص إذا هو استنشاق الماوس)
         ج) عدد المداخل في كل دائرة (اختياري)
         د) سافر مسافة المجموع (اختياري)
      5. بعد تحريك الماوس في قاعة مركز، قم بإغلاق الأبواب.
   3. التحليل الاجتماعي والجدة
      1. القيام بهذا التحليل بعد التحليل بالمجتمع مباشرة.
      2. مسح كلا أقفاص مع الإيثانول 70%.
      3. مكان آخر 129/Sv الماوس في أحد الأقفاص، يطلق عليه "قفص غريب 2" والقفص مكان 2 غريب في إحدى الدوائر. ضع الماوس 1 غريب في قفص آخر، يسمى "القفص غريب 1"، ووضع القفص 1 شخص غريب في غرفة أخرى.
      4. فتح الباب، ورصد سلوك الماوس هذا الموضوع.
      5. السماح لهذا الموضوع الماوس للتحرك بحرية لمدة 10 دقائق، وقياس نفس المعلمات السلوكية ووصف للتحليل بالمجتمع.
         ملاحظة: ينبغي اختيار الماوس غريب 1 و 2 غريب عشوائياً. وينبغي تحديد الدائرة 1 غريب والدائرة الكائن، فضلا عن الدائرة 1 غريب والدائرة 2 غريب عشوائياً.
3. التمييز الخوف السياقية
   1. تكييف
      1. قبل كل محاكمة تكييف، تنظيف الجهاز التجريبي بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      2. ضع ماوس في جهاز تكييف مع الظروف المحددة (شكل الجهاز لون الجدار، الكلمة، ورائحة، والإضاءة ومواد حجم الضوضاء الخلفية ينبغي أن تحدد مسبقاً). على سبيل المثال، جهاز تكييف، استخدمت هنا كان جهاز مربعة مع الجدران شبكي واضحة وطابق شبكة معدنية، رائحة الإيثانول، وسطوع لوكس 100 والضوضاء البيضاء خلفية 65-dB.
      3. شرط الماوس بصدمة سيرا على الأقدام مع توقيت شبه عشوائي للصدمات الكهربائية 0.1-اماه 2 s x 3 مرات على مدى 5 دقائق.
      4. العودة الماوس إلى القفص المنزل بعد تكييف.
   2. تقييم الذاكرة
      1. قبل كل تقييم، بتنظيف الجهاز التجريبي بمسح السطح مع الإيثانول 70%.
      2. وفي اليوم التالي تكييف التالي، ضع الماوس في الجهاز نفسه كحالة الصدمة وقياس الوقت بالتجميد على مدى 5 دقائق.
      3. في وقت لاحق في نفس اليوم، ضع الماوس في جهاز رواية وقياس الوقت تجميد أثناء إجراء تقييم 5-دقيقة. تم استخدام جهاز ثلاثي مع الجدران البيضاء شبكي، والكلمة لوحة، لا رائحة، السطوع لوكس 30 والضوضاء البيضاء 70-dB هنا.
      4. مقارنة وقت التجميد بين نفس الشرط وشرط الرواية. سوف تجمد الفئران مع قدرة ذاكرة عادي أكثر في نفس الحالة مما في حالة الرواية. التجميد جمود المعرفة من الحيوان لأكثر من 2 ثانية.

النتائج

حقن متكررة من بتز الحث على زيادة في شدة الاستيلاء. ستة C57BL/6 الفئران تعامل مع بتز، والفئران 6 آخر تعامل مع المالحة كمجموعة مراقبة. الجرعة بتز 35 مغ/كغ، وكانت تدار من حقن 10. زادت درجة الاستيلاء تدريجيا مع حقن بتز، بينما كانت أثارت لا مضبوطات أو سلوكيات غير طبيعية قبل الحقن الما...

Discussion

نقدم هنا، بروتوكول متاحة على نطاق واسع لإنشاء نموذج الحيوان الدوائي للصرع. بوساطة بتز إشعال الكيميائية لها تاريخ طويل وهو نموذج مقبولة عموما لدراسة باثولوجيا التشريح المرضى والخلوي للصرع⁴¹. نموذج إشعال الكيميائية من الصرع وقد استعرضت سابقا سوزداك ويانسن، 1995⁴². ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi