Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Resumo

Este protocolo descreve um método de inflamação química com mielinização e fornece um modelo do rato da epilepsia. Este protocolo também pode ser usado para investigar a vulnerabilidade à indução de convulsões e patogênese após crises epilépticas em ratos.

Resumo

Mielinização (PTZ) é um antagonista dos receptores GABA-A. Uma injeção intraperitoneal de PTZ em um animal induz uma convulsão aguda, grave em uma dose alta, Considerando que injeções sequenciais de uma dose de subconvulsive têm sido utilizadas para o desenvolvimento da química kindling, um modelo de epilepsia. Uma única injeção de baixas doses de PTZ induz uma convulsão leve sem convulsão. No entanto, injeções de baixas doses repetitivas de PTZ diminuem o limiar para evocar um ataque convulsivo. Finalmente, administração contínua de baixa dose de PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Este método é simples e amplamente aplicável para investigar a fisiopatologia da epilepsia, que é definida como uma doença crônica que envolve ataques repetitivos. Este produto químico acender protocolo causa convulsões repetitivas em animais. Com este método, estimou-se a vulnerabilidade a ataques mediada por PTZ ou o grau de agravamento de crises epilépticas. Estas vantagens levaram à utilização desse método para triagem de droga anti-epiléptica e genes relacionados com epilepsia. Além disso, este método utilizou-se para investigar o dano neuronal após ataques epiléticos, porque as alterações histológicas observadas no cérebro de pacientes epilépticos também aparecem nos cérebros dos animais acendeu o produto químico. Assim, este protocolo é útil para produzir convenientemente modelos animais de epilepsia.

Introdução

Epilepsia é uma doença neurológica crônica que se caracteriza por convulsões recorrentes e afeta aproximadamente 1% das pessoas. Os mecanismos subjacentes da geração epileptogenesis e apreensão em pacientes de epilepsia não podem ser totalmente esclarecidos em estudos clínicos. Portanto, um modelo animal adequado é necessário para o estudo da epilepsia¹.

Uma variedade de modelos animais de epilepsia têm sido utilizados para investigar a fisiologia da epilepsia e para identificar a droga anti-epiléptica^2,3. Entre estes modelos, indução farmacológica convulsão é um método comum usado para gerar um modelo animal para a investigação da patologia de epilepsia⁴. Este método é simples e barato. Inflamação mediada por eletrodo também é um método comumente usado, mas os custos deste procedimento são mais elevados, e o método requer habilidades cirúrgicas e elétricas para induzir convulsões repetitivas⁵.

Indução farmacológica também é vantajosa porque o calendário e o número de apreensões são facilmente controladas. Modelos de genética do rato que apresentam convulsões espontâneas também são usados no estudo da epilepsia. No entanto, prever quando e quantas vezes as convulsões surgem nesses modelos genéticos pode ser impossível⁶. Um sistema de monitoramento é necessário para observar o comportamento epiléptico de camundongos geneticamente modificados⁶.

Ácido Kainic, pilocarpina e mielinização (PTZ) são amplamente utilizados como indutora de apreensão de drogas⁷. O ácido Kainic é um agonista de receptores de glutamato, e pilocarpina ativa receptores colinérgicos. PTZ é um ácido gama aminobutírico (GABA)-um antagonista de receptor⁸. PTZ suprime a função de sinapses inibitórias, levando ao aumento da atividade neuronal. Este regulamento causa convulsões generalizadas em animais⁹. Uma única injeção de ácido kainic e Pilocarpina pode induzir convulsões agudas, especialmente estado de mal epiléptico (SE)^10,11 e kainic ácido ou pilocarpina-mediada SE promove convulsões espontâneas e recorrentes crônicas^{12 , 13}. gravações eletroencefalográficos (EEG) e análise do comportamento têm indicado que a espontâneas convulsões recorrentes são observadas um mês após uma única injeção de^12,13. Uma única injeção de uma dose convulsiva de PTZ também induz convulsão aguda. No entanto, crônicas espontâneas convulsões após uma única injeção de PTZ são difíceis de promover. Administração crônica de PTZ é necessária para induzir convulsões repetitivas¹⁴. Em ambos os métodos, a geração de convulsões repetitivas é capaz de induzir a uma patologia mais semelhante da epilepsia humana do que a geração de crises agudas. No caso de PTZ, cada injeção evoca uma convulsão, e severidade de apreensão torna-se mais grave, de forma gradual, com cada injeção. Finalmente, uma única injeção de baixa dose PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Nesta fase, cada injeção evoca convulsões graves. Além disso, a duração e a latência de apreensão também mudam ao longo das injeções. A latência de convulsão tônico muitas vezes torna-se mais curta na última fase de acender¹⁵. Além disso, agravamento de convulsão é acompanhado por uma apreensão prolongada duração¹⁶. Investigar o mecanismo molecular que regula a gravidade do ataque, latência e duração é útil para triagem droga anti-epiléptica^17,18,19.

As convulsões comumente são induzidas por uma única administração sistémica de PTZ, e a recuperação é muito rápida, dentro de 30 min^4,5. Assim, o número de apreensões é mais controlável no modelo PTZ-gravetos. No entanto, monitorização de EEG indicou que picos generalizados podem ser vistos até 12 h após apreensão mediada por PTZ²⁰. Portanto, animais de preferência devem permanecer em observação por 24 h após a convulsão tônico ou Mioclônicas²¹ para análise mais precisa dos mecanismos de inflamação.

A administração de fármacos antiepiléptico, como etossuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina e retigabine³, antes ou após a injeção de PTZ atenua o agravamento do ataque gravidade^{3,22, 23}. Da mesma forma, ratos do KO que falta genes envolveram na exacerbação de apreensão, tais como matriz metaloproteinase-9,²⁴, FGF-22²⁵ e neuritin²⁶, foram mostrados para expor a gravidade reduzida convulsão após múltiplas injecções de PTZ. Além disso, observar alterações histopatológicas após ataques epilépticos é possível com este método. Em pacientes com epilepsia do lobo temporal, existem alterações histológicas típicas no cérebro, tais como fibra musgosa brotando de^27,28, grânulo anormal neurônio migração²⁹, astrogliosis³⁰celular neuronal morte no hipocampo^31,32e esclerose hippocampal³³. Alterações semelhantes são observadas em animais modelo epiléptica. Entre os métodos disponíveis, mediada por PTZ inflamação química é um método bom, Reproduzível e baixo custo para produzir um modelo animal de epilepsia. Em um modelo SE mediada por pilocarpina, controle de crises é difícil e muitos ratos morrem ou deixam de desenvolver-SE³⁴. Em contraste, mortalidade e gravidade de apreensão são mais controláveis no modelo de PTZ. Além disso, PTZ é menos caro do que o ácido kainic, e habilidades na cirurgia de cérebro de rato não são necessárias para a administração de drogas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso de Tokyo Metropolitan Instituto de ciência médica e cuidado Animal. Pós-natal, 8 - 16 semanas os ratos são recomendados. Toda a tensão pura é aceitável para o experimento. Camundongos C57Bl/6 são mais resistentes a PTZ, Considerando que BALB/c e Swiss ratos albinos são mais sensíveis a PTZ. C57Bl/6 foram utilizados neste estudo. Vulnerabilidade de PTZ também depende da idade do rato. Em comparação aos mais jovens ratos, ratos mais velhos são mais refratários a PTZ³⁵. O número de animais utilizados para este método pode variar, mas pelo menos 6 a 10 animais são necessários para cada condição.

1. preparação de PTZ

1. Dissolva 2 mg/mL PTZ em estéril 0,9% NaCl (p/v). Prepare PTZ no dia do uso.

2. injeção de PTZ

1. Execute todas as experiências entre 09:00 e 12:00 (meio dia).
2. Medir o peso do corpo do animal.
3. Coloque o animal em uma câmara de observação para habituação.
4. Durante o período de habituação (3 min), calcule o volume de solução PTZ para a injeção com base no peso do corpo do animal e a dose de injeção previamente determinada.
   Nota: por exemplo, quando é usada a 35mg/kg PTZ, 0,875 mg de PTZ é necessário para um rato pesando 25g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Portanto, deve ser injetada 437.5 μL de uma solução PTZ de 2 mg/mL (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). A dose de injeção de PTZ depende do genótipo do rato e tensão. Para camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, recomenda-se uma dose de 30-35 mg PTZ/kg de peso corporal para o primeiro julgamento. Sensibilidade-PTZ depende o rato estirpes utilizadas^36,37. A dose de injeção varia de acordo com a finalidade do experimento.
5. Injete PTZ intraperitonealmente com uma seringa de 1 mL, conectada a uma agulha de calibre 27 ao quadrante esquerdo ou direito do abdômen do animal. Evite a injectar na linha.
   1. Evite injeções repetidas na mesma posição.
6. Observar comportamentos animais por 30 min após a administração de PTZ (figura 1A) e classificar e marcar o comportamento anormal, como mostrado abaixo. Se possível, manter os animais em observação por 24 h, ou pelo menos uma injeção de pós adicionais 6-10 h, especialmente quando o escore de severidade de apreensão atinge 3 ou acima.
   1. Observe quaisquer apreensões suaves ou mudanças comportamentais nos animais para além do período de observação de 30 min. Esta prolongada observação período pode dirigir um efeito particularmente importante e completo de um subconvulsive dose de PTZ na geração de crônicas não provocadas convulsões em epilepsia.
   2. Além disso, medida a duração de apreensão de cada apreensão observada como alterações na duração da convulsão referem-se a gravidade do ataque. Além disso, a latência para a primeira convulsão após a injeção de PTZ é outra medida importante para coletar. A latência, duração e frequência de apreensão de monitoramento é fundamental para qualquer estudos moleculares após um ataque.
7. Injete PTZ cada outro dia (figura 1A). O número de injeções varia de acordo com o objetivo do experimento. Estes são exemplos representativos.
   1. Para gerar animais completamente acendeu, uma vez que um animal experimenta um ataque com uma pontuação de 5 (tónico-clónica), termine a injeção nas três administrações adicionais. Neste caso, aumente a dose de injeção se o escore de apreensão não aumenta para três administrações consecutivas. Cada animal pode receber um número diferente e dose de injecções de PTZ.
   2. Fixa o número e a dose de injeção de PTZ em todas as condições para avaliar a vulnerabilidade de PTZ, incluindo avaliações de antidrogas epilepsia e estudos do fenótipo de camundongos geneticamente modificados. Dar a todos os animais o mesmo número de injeções de PTZ; recomenda-se um total de 8 a 12 injeções. Se um animal morre, a pontuação de ataque deve ser classificada com 6.
   3. Determinar a dose de injeção necessária para manter uma convulsão de alta pontuação (4 ou 5) para 10 ou mais injeções estudar as alterações histopatológicas que ocorrem ataques epilépticos. Neste caso, o número total de injeção deve variar de 25 a 30. Diminua a dose da injeção, se a pontuação de ataque atinge 5. Se a pontuação de ataque diminui para 3 ou mais baixo, aumente a dose de injeção.

3. apreensão Pontuação

1. Observar os comportamentos animais e gravar os resultados.
   1. Classificar e marcar os comportamentos epilépticos como segue^38,39 (figura 1B):
      0: comportamento normal, nenhuma anormalidade.
      1: imobilização, deitado de barriga.
      2: cabeça acenando, facial, membro anterior ou membro posterior mioclonia.
      3: mioclonia contínua de todo o corpo, Mioclônicas empurrões, rabo preso rigidamente.
      4: criação, tônico apreensão, caindo de lado.
      5: tônico-clônica, caindo nas suas costas, selvagem, correndo e pulando.
      6: morte.
2. Altere os critérios comportamentais com base na Racine Pontuação⁴⁰, dependendo das condições experimentais.

4. após um ataque análise

1. Análise de Immunohistopathological
   1. Fixação de perfusão
      1. Preparação
         1. Dissolva o paraformaldeído 4% (p/v) (PFA) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4). Aquece a solução a cerca de 70 ° C com a adição de uma gota de 1 M de NaOH (aproximadamente 1 µ l de 1 M NaOH para 50 mL de solução de PFA).
         2. Preparar o gelado 4% PFA e tampão fosfato salino (PBS).
         3. Configure uma bomba peristáltica, com um tubo e agulha. Execute cerca de 20 mL de água através do tubo para limpar resíduos. Em seguida, coloque a extremidade aberta do tubo em PBS gelado.
      2. Transcardial perfusão e preparação do cérebro fixa
         1. Anestesia profundamente o mouse com etanol a 50% isoflurane/50% em um pequeno pote.
         2. Mantenha o mouse na posição supina fixando as pontas de suas patas dianteiras e os membros traseiros.
         3. Corte da linha mediana ventral do abdômen e expor o diafragma.
         4. Corte o diafragma ao longo da margem costal. Em seguida, corte ambas as partes laterais das costelas e corpo. Beliscar o processo xifoide pela pinça de bloqueio e evert a caixa torácica. Manter a posição do processo xifoide, fixando-o com uma agulha ou Beliscá-lo com pinça. Expor o coração.
         5. Insira a agulha no ventrículo esquerdo e fazer um corte no átrio direito com uma tesoura. Estar ciente para não empurrar a agulha longe demais para o coração, como ele pode furar uma parede interior.
         6. Iniciar um fluxo constante de PBS gelado através da agulha para lavar o sangue (aproximadamente 15-20 mL/min).
         7. Quando o sangue foi limpo do corpo, mova o tubo para uma solução de paraformaldeído 4% (cerca de 60 mL) sem a adição de bolhas. Em seguida, pare a perfusão.
         8. Cortar o pescoço traseiro e espinha e retire a pele da cabeça e a parte dorsal do crânio com tesoura de dissecação.
         9. Corte o osso pré-maxilar entre as órbitas oculares e remover completamente a porção dorsal do crânio.
         10. Criar um fosso entre o cérebro e o osso jugal do lado posterior e cortar os nervos trigêmeo e quiasma óptico em baixo do cérebro. Retire o cérebro cuidadosamente e colocá-lo em um frasco contendo 4% PFA. Fixe o cérebro a 4 ° C, durante 12-16 h.
   2. Preparação de fatia do cérebro
      1. Transferi o cérebro fixo de 20% sacarose/PBS até o cérebro afunda-se na solução para permitir a cryoprotection.
      2. Corte o cérebro fixo baseado na fatia necessária orientação e uma parte necessária do cérebro.
      3. Defina o cryomicrotome. Coloque a lâmina na posição e manter a fase de micrótomo em uma temperatura abaixo dos-20 ° C.
      4. Coloque o cérebro pré-cortados no palco e revestir o cérebro com 20% de sacarose/PBS. A solução de sacarose/PBS gradualmente irá congelar, cobrindo o cérebro no palco, até que o cérebro está completamente incorporado no congelado 20% sacarose/PBS.
      5. Corte o cérebro (30 µm de espessura) deslizando a lâmina através do tecido. Transfira as fatias em PBS e mantê-los em 4 ° C.
   3. Imuno-histoquímica fluorescente
      1. Lave as fatias necessárias em 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) durante 10 minutos, 3 vezes a temperatura ambiente (RT).
      2. Bloquear as fatias incubando-os em PBST com 2% cabra soro ou 5% albumina de soro bovino (BSA) para 1-2 h em RT
      3. Incubar as fatias em uma solução de anticorpos com a concentração adequada de anticorpo primário em PBST com 2% cabra soro ou 5% BSA para pernoites de 1 a 7 a 4 ° C.
      4. Lave as fatias em PBST durante 10 minutos, 3 vezes a RT
      5. Incube as fatias em uma solução de anticorpo secundário com a concentração adequada de anticorpo secundário em PBST por 1-2 h em RT, protegido de luz.
      6. Monte as fatias em lâminas de vidro e cubra com meio de montagem e cobertura de vidro.
      7. Observe as fatias com microscopia de fluorescência.
2. Teste da três-câmara
   1. Preparação
      1. Preparar pelo menos 2 2 - ratos de 129/Sv 6 meses de idade do mesmo sexo como os ratos de assunto para ser o "mouse estranho." Se habituar todos os ratos na gaiola antes da análise. Para cada sessão de treino, coloque o rato na gaiola e deixar o mouse por 15 min.
      2. Antes de cada fase de habituação com o mouse do assunto, limpe todo o aparelho e as duas gaiolas por limpar a superfície com etanol a 70%.
      3. Coloque as gaiolas vazias nos aposentos de aparato 3-câmara dois lado e abra as portas entre as câmaras.
      4. Para se habituar o mouse do assunto, colocar um rato do assunto na câmara de centro e permitir o mouse para mover-se livremente em todo o aparelho até que o mouse tem investigado as duas gaiolas, além de um adicional de 5 min. animais de assunto que podem ter medo da gaiola que não investigar a gaiola por 20 min e não deve ser usado para esta análise. Esses animais evitar a gaiola e raramente perto da gaiola.
      5. Depois que o animal move-se para a câmara de centro, feche as portas e deixe o mouse mover-se livremente na câmara centro por 5 min. Durante este período, colocar um dos 129/Sv ratos em uma gaiola para se habituar a gaiola.
   2. Análise de sociabilidade
      1. Realizar esta análise imediatamente após o período de habituação do mouse assunto.
      2. Coloque a gaiola contendo um rato 129/Sv, denominado "gaiola de estranho 1", em uma das câmaras de lado e coloque a gaiola vazia, denominada "gaiola de objeto", na câmara do outro lado.
      3. Abra a porta e monitorar o comportamento do mouse assunto.
      4. Permitir que o mouse assunto mover-se livremente por 10 min e gravar os seguintes parâmetros comportamentais. Se o mouse do assunto tem medo do rato na gaiola 1 estranho, conforme indicado pelo mouse evitando a forasteiro 1 gaiola e permanecendo no canto de uma das câmaras, o animal não deve ser usado para a análise.
         a) o tempo gasto em cada câmara, a câmara 1 estranho, a câmara de objeto e câmara do centro.
         b) o tempo gasto investigando cada gaiola, a gaiola do estranho 1 e a gaiola de objeto. (O rato é classificado como a gaiola a investigar se o mouse está cheirando ou toughing o mouse ou gaiola)
         c) o número de entradas em cada câmara (opcional)
         d) total distância percorrida (opcional)
      5. Depois que o mouse se move para a câmara de centro, feche as portas.
   3. Análise social novidade
      1. Realizar esta análise imediatamente após a análise da sociabilidade.
      2. Limpe as duas gaiolas com etanol a 70%.
      3. Coloque outro rato 129/Sv em uma das gaiolas, denominadas "Gaiola de estranho 2" e gaiola de lugar a 2 de estranho em uma das câmaras. Coloque o mouse estranho 1 na outra gaiola, denominada "gaiola estranho 1" e coloque a gaiola 1 estranho na outra câmara.
      4. Abra a porta e monitorar o comportamento do mouse assunto.
      5. Permitir que o mouse do assunto se mover livremente por 10 min e medir os mesmos parâmetros comportamentais descritos para a análise de sociabilidade.
         Nota: O mouse estranho 1 e 2 de estranho deve ser escolhido aleatoriamente. A câmara de estranho 1 e câmara de objeto, bem como o estranho 1 câmara e câmara estranho 2 devem ser determinados aleatoriamente.
3. Discriminação do medo contextual
   1. Condicionado
      1. Antes de cada tentativa de condicionamento, limpe o aparato experimental por limpar a superfície com etanol a 70%.
      2. Coloque um rato em um aparelho de condicionamento com condições específicas (forma de aparelho, cor da parede, material do piso, odor, iluminação e volume do ruído de fundo devem ser pre-determinadas). Por exemplo, o aparelho de condicionamento utilizado aqui foi um aparato quadrado com paredes claras do plexiglás, um piso de grade metálica, um odor de etanol, brilho de 100 lux e ruído de 65 dB de fundo branco.
      3. Condicionar o mouse pelo pé-choque com sincronismo pseudo-aleatório de choques elétricos de 0.1-mA por 2 s x 3 vezes ao longo de 5 min.
      4. Retorne o rato da gaiola para casa após condicionamento.
   2. Avaliação de memória
      1. Antes de cada avaliação, limpe o aparato experimental por limpar a superfície com etanol a 70%.
      2. No dia seguinte seguir condicionado, posicione o mouse no interior do aparelho mesmo como condição de choque e medir o tempo de congelação ao longo de 5 min.
      3. Mais tarde no mesmo dia, coloque o mouse em um novo aparelho e medir o tempo de congelação durante uma avaliação de 5 min. Um aparelho triangular com paredes brancas do plexiglás, assoalho da placa, sem odor, brilho de 30 lux e ruído de 70 dB branco foi usado aqui.
      4. Compare o tempo de congelação entre a mesma condição e a condição de romance. Os ratos com uma capacidade de memória normal congelará mais nas mesmas condições do que na condição de romance. O congelamento é definida imobilidade do animal para mais de 2 s.

Resultados

Injeção repetitiva de PTZ induz um aumento na severidade de apreensão. Seis camundongos C57BL/6 foram tratados com PTZ, e outro de 6 ratos foram tratados com soro fisiológico como um grupo de controle. A dose PTZ foi 35 mg/kg e 10 injeções foram administradas. A pontuação de ataque aumentado gradualmente com injeções de PTZ, Considerando que sem convulsões ou comportamentos anormais foram evocados por injeções de solução Salinas (Figura 2). ANO...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo amplamente acessível para o estabelecimento de um modelo animal farmacológico de epilepsia. Mediada por PTZ inflamação química tem uma longa história e é um modelo comumente aceitado para o estudo da patologia celular e histopatologia de epilepsia⁴¹. O modelo de inflamação química da epilepsia tem sido avaliado anteriormente por Suzdak e Jansen, 1995⁴². Indução de convulsão farmacológica, especialmente com PTZ, é um método fá...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi