Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Resumen

Este protocolo describe un método de química inflamación con pentylenetetrazole y proporciona un modelo de ratón de la epilepsia. Este protocolo también puede utilizarse para investigar la vulnerabilidad a la inducción de convulsiones y de la patogenesia después de las crisis epilépticas en los ratones.

Resumen

Pentylenetetrazole (PTZ) es un antagonista del receptor GABA-A. La inyección intraperitoneal de PTZ en un animal induce una convulsión aguda, severa a una dosis alta, mientras que las inyecciones secuenciales de una dosis de subconvulsive se han utilizado para el desarrollo de la química, Yesca, un modelo de epilepsia. Una sola inyección de dosis bajas de PTZ induce una convulsión leve sin convulsión. Sin embargo, repetidas inyecciones de dosis bajas de PTZ disminuyen el umbral para evocar un ataque convulsivo. Por último, la administración continua de dosis bajas de PTZ induce una severa convulsión tónico-clónica. Este método es simple y ampliamente aplicable a investigar la patofisiología de la epilepsia, que se define como una enfermedad crónica que involucra convulsiones repetitivas. Este producto químico Yesca protocolo causa convulsiones repetitivas en animales. Con este método, se estimó la vulnerabilidad a ataques de PTZ-mediada o el grado de agravación de las crisis epilépticas. Estas ventajas han llevado a la utilización de este método para la detección de drogas antiepilépticas y genes relacionados con la epilepsia. Además, este método se ha utilizado para investigar daño neuronal después de ataques epilépticos debido a los cambios histológicos observados en los cerebros de pacientes epilépticos también aparecen en los cerebros de animales encendido química. Así, este protocolo es útil para la producción conveniente de modelos animales de epilepsia.

Introducción

La epilepsia es un trastorno neurológico crónico que se caracteriza por convulsiones recurrentes y afecta aproximadamente al 1% de las personas. Los mecanismos subyacentes de generación epileptogénesis y convulsiones en pacientes con epilepsia no pueden ser totalmente clarificados en estudios clínicos. Por lo tanto, un modelo animal apropiado es necesario para el estudio de la epilepsia¹.

Una gran variedad de modelos animales de epilepsia se han utilizado para investigar la fisiología de la epilepsia y para identificar los fármacos antiepilépticos^2,3. Entre estos modelos, la inducción de convulsiones farmacológicas es un método común utilizado para generar un modelo animal para la investigación de la patología de la epilepsia⁴. Este método es barato y simple. Inflamación mediada por electrodo es también un método comúnmente utilizado, pero los costos de este procedimiento son más altos, y el método requiere habilidades quirúrgicas y eléctricos para inducir convulsiones repetitivas⁵.

Inducción farmacológica también es ventajosa porque el tiempo y el número de convulsiones se controlan fácilmente. Modelos de ratón genético que presentan convulsiones espontáneas también se utilizan en el estudio de la epilepsia. Sin embargo, la predicción de Cuándo y con qué frecuencia las convulsiones se presentan en estos modelos genéticos puede ser imposible⁶. Un sistema de seguimiento es necesario para observar el comportamiento epiléptico de ratones modificados genéticamente⁶.

Ácido kaínico, la pilocarpina y la pentylenetetrazole (PTZ) son ampliamente utilizados como inductores de incautación drogas⁷. El Ácido kaínico es un agonista de los receptores de glutamato, y pilocarpina activa los receptores colinérgicos. PTZ es un ácido gamma aminobutírico (GABA)-un antagonista del receptor del⁸. PTZ suprime la función de las sinapsis inhibitorias, una mayor actividad neuronal. Presente Reglamento causa asimientos generalizados en animales⁹. Una sola inyección de Ácido kaínico y pilocarpina puede inducir convulsiones agudas, especialmente status epiléptico (SE)^10,11 y kaínico ácido o pilocarpina-mediada SE promueve crónica espontánea y recurrente asimientos^{12 , 13}. las grabaciones electroencephalographic (EEG) y análisis de la conducta han indicado que las crisis recurrentes espontáneas se observan un mes después de una sola inyección^12,13. Una sola inyección de una dosis convulsiva de PTZ también induce crisis aguda. Sin embargo, asimientos crónicos espontáneos después de una inyección única de PTZ son difíciles de promover. La administración crónica de PTZ es necesaria para inducir convulsiones repetitivas¹⁴. En cualquiera de los métodos, la generación de convulsiones repetitivas es capaz de inducir una patología más similar a la de la epilepsia humana que la generación de convulsiones agudas. En el caso de PTZ, cada inyección evoca una convulsión, y severidad de la crisis se convierte en más grave en una manera paso a paso con cada inyección. Por último, una sola inyección de PTZ de dosis bajas induce una severa convulsión tónico-clónica. En esta fase, cada inyección evoca las convulsiones severas. Además, la latencia de la convulsión y la duración también cambian en el transcurso de las inyecciones. La latencia a asimiento tónico se convierte a menudo más corta en esta última fase de inflamación¹⁵. Además, agravamiento de la convulsión se acompaña de una convulsión prolongada duración¹⁶. Investigar el mecanismo molecular que regula la gravedad de la crisis, latencia y duración es útil para la detección de drogas antiepilépticas^17,18,19.

Comúnmente los asimientos son inducidos por una sola administración sistémica de PTZ y la recuperación es muy rápida, dentro de 30 min^4,5. Así, el número de las convulsiones es más controlable en el modelo PTZ-astillas. Sin embargo, la supervisión de EEG ha indicado que pueden verse picos generalizadas hasta 12 h después de PTZ-medió incautación²⁰. Por lo tanto, los animales preferiblemente deben permanecer bajo observación durante 24 h después de las convulsiones mioclónicas o tónico²¹ para análisis más preciso de los mecanismos de inflamación.

La administración de los fármacos antiepilépticos, como la etosuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina y retigabine³, antes o después de la inyección de PTZ mitiga el agravamiento de la convulsión severidad^{3,22, 23}. Asimismo, ratones knockout que falta genes implicados en la exacerbación de convulsiones, como matriz metaloproteinasa-9²⁴,²⁵ y neuritin FGF-22²⁶, han demostrado exhibir convulsiones reducida gravedad después de inyecciones múltiples de PTZ. Además, observando alteraciones histopatológicas después de las crisis epilépticas es posible con este método. En pacientes con epilepsia del lóbulo temporal, hay cambios histológicos típicos en el cerebro, como la fibra musgosa brotación^27,28, gránulo anormal neurona migración²⁹, astrogliosis³⁰, células neuronales muerte en el hipocampo^31,32y esclerosis hipocampal³³. Cambios similares se observan en animales epilépticos modelo. Entre los métodos disponibles, inflamación química mediada por PTZ es un método bueno, reproducible y barato para producir un modelo animal de epilepsia. En un modelo SE mediada por pilocarpina, control de las convulsiones es difícil y muchos ratones mueren o no a desarrollar SE³⁴. En contraste, la mortalidad y la gravedad de la crisis son más controlables en el modelo PTZ. Además, PTZ es menos costoso que el Ácido kaínico y habilidades en cirugía de cerebro de ratón no son necesarios para la administración de la droga.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el cuidado Animal y uso de la Tokyo Metropolitan Instituto de ciencias médicas. 8 postnatal - ratones de 16 semanas de edad se recomiendan. Cualquier cepa consanguínea es aceptable para el experimento. Ratones C57BL/6 son más resistentes a PTZ, que ratones albinos BALB/c y Suiza son más sensibles a PTZ. C57BL/6 fueron utilizados en este estudio. Vulnerabilidad a PTZ también depende de la edad del ratón. En comparación con ratones pequeños, ratones más viejos son más refractarios a PTZ³⁵. El número de animales usados para este método puede variar, pero por lo menos 6 a 10 animales se requieren para cada condición.

1. preparación de PTZ

1. Disolver 2 mg/mL PTZ en estéril 0,9% (p/v) de NaCl. Preparar PTZ en el día de uso.

2. inyección de PTZ

1. Realizar todos los experimentos entre 9:00 y 12:00 (mediodía).
2. Medir el peso del cuerpo del animal.
3. Coloque el animal en una cámara de observación para la habituación.
4. Durante el período de habituación (3 min), calcular el volumen de solución PTZ para la inyección basada en el peso corporal del animal y la dosis de inyección previamente determinado.
   Nota: por ejemplo, cuando se utiliza 35 mg/kg PTZ, 0,875 mg de PTZ es necesario para un ratón pesa 25 g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Por lo tanto, se debe inyectar 437.5 μL de una solución de 2 mg/mL PTZ (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). La dosis de inyección de PTZ depende del genotipo del ratón y cepa. Para los ratones de tipo salvaje C57BL/6, se recomienda una dosis de 30-35 mg PTZ/kg de peso corporal para el primer ensayo. Sensibilidad a PTZ depende el ratón cepa utilizada^36,37. La dosis de la inyección varía según el propósito del experimento.
5. Inyectar por vía intraperitoneal PTZ con una jeringa de 1 mL conectada a una aguja de calibre 27 en el cuadrante derecho o izquierdo del abdomen del animal. Evitar inyectar en la línea media.
   1. Evitar inyecciones repetidas en la misma posición.
6. Observar el comportamiento de los animales durante 30 minutos después de la administración de PTZ (figura 1A) y clasificar y anotar el comportamiento anormal, tal como se muestra a continuación. Si es posible, mantener los animales bajo observación por 24 horas o menos después de la inyección adicional de 6-10 h, especialmente una vez que llega a la puntuación de gravedad de la crisis 3 o superior.
   1. Tenga en cuenta cualquier convulsiones suaves o cambios de comportamiento en los animales más allá del período de observación de 30 minutos. Esta prolongada observación período podrá dirigir un efecto particularmente importante y completo de una dosis subconvulsive de PTZ en la generación de crónica unprovoked asimientos en epilepsia.
   2. Además, medir la duración de la convulsión de cada asimiento observada como cambios en la duración de la convulsión se relacionan con la severidad de convulsiones. Por otra parte, la latencia a la primera crisis después de la inyección de PTZ es otra medida importante para recoger. Monitoreo de la frecuencia de convulsiones, duración y latencia es fundamental para cualquier estudio molecular después del asimiento.
7. Inyecte PTZ todos los días (figura 1A). El número de inyecciones depende del objetivo del experimento. Ejemplos representativos son los siguientes.
   1. Para generar animales totalmente encendidos, una vez que un animal experimenta una convulsión con una puntuación de 5 (convulsión tónico-clónica), final de la inyección dentro de tres administraciones más. En este caso, aumentar la dosis de inyección si el puntaje de convulsiones aumenta por tres administraciones consecutivas. Cada animal puede recibir un diferente número y dosis de las inyecciones de PTZ.
   2. Fijar el número y dosis de la inyección de PTZ en todas las condiciones para evaluar la vulnerabilidad a PTZ, incluyendo en las evaluaciones de fármacos antiepilépticos y estudios del fenotipo de ratones modificados genéticamente. Dar a todos los animales el mismo número de inyecciones de PTZ; se recomienda un total de 8 a 12 inyecciones. Si un animal muere, la puntuación de ataque debe ser denotada como 6.
   3. Determinar la dosis de inyección necesaria para mantener un asimiento alta puntuación (4 o 5) para que 10 o mas inyecciones para el estudio de los cambios histopatológicos que se producen las crisis epilépticas. En este caso, el número total de inyección debe estar comprendida entre 25 a 30. Disminuir la dosis de inyección si la puntuación de ataque llega a 5. Si la puntuación de ataque disminuye a 3 o más bajo, aumentar la dosis de la inyección.

3. convulsión puntuación

1. Observar el comportamiento de los animales y registrar los resultados.
   1. Clasificar y anotar las conductas epilépticas como sigue^38,39 (figura 1B):
      0: el comportamiento normal, ninguna anormalidad.
      1: inmovilización, acostado sobre el vientre.
      2: cabeza mioclono asintiendo con la cabeza, facial, extremidad delantera o trasera.
      3: mioclono continuo de todo el cuerpo, mioclónica sacudidas, cola se mantuvo rígidamente.
      4: cría, tónico asimiento, cayendo a su lado.
      5: convulsión tónico-clónica, cayendo de espaldas, salvaje corriendo y saltando.
      6: la muerte.
2. Cambiar los criterios de comportamiento basados en el Racine puntuación⁴⁰, dependiendo de las condiciones experimentales.

4. Análisis de la incautación de

1. Análisis immunohistopathological
   1. Fijación de perfusión
      1. Preparación
         1. Disolver paraformaldehido (PFA) de 4% (p/v) en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4). Calentar la solución a aproximadamente 70 ° C con la adición de una gota de 1 M NaOH (aproximadamente 1 μl de 1 M NaOH para 50 mL de solución de PFA).
         2. Preparar helado 4% PFA y tampón fosfato salino (PBS).
         3. Configurar una bomba peristáltica, con tubo y aguja. Ejecutar aproximadamente 20 mL de agua a través del tubo para eliminar residuos. Luego, coloque el extremo abierto del tubo en PBS helado.
      2. Transcardial la perfusión y preparación del cerebro fijado
         1. Anestesiar profundamente el ratón con etanol a 50% isoflurane/50% en un pequeño recipiente.
         2. Mantenga el ratón en una posición supina fijando las puntas de sus extremidades anteriores y posteriores.
         3. Corta la línea media ventral del abdomen y exponer el diafragma.
         4. Cortar el diafragma a lo largo de la margen costal. Luego, corte ambos lados laterales de las costillas y el cuerpo. Pellizque el proceso xifoides por las pinzas de bloqueo y vuelque la caja torácica. Mantener la posición del proceso xifoides por fijación con una aguja o pellizcarla con fórceps. Exponer el corazón.
         5. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo y hacer un corte en el atrio derecho con unas tijeras. Tenga en cuenta no para empujar la aguja demasiado lejos en el corazón, como puede perforar una pared interior.
         6. Comenzar un flujo constante de PBS helado a través de la aguja para vaciar la sangre (aproximadamente 15-20 mL/min).
         7. Cuando la sangre ha desaparecido del cuerpo, hacia el tubo una solución de paraformaldehído al 4% (aproximadamente 60 mL) sin la adición de las burbujas. A continuación, detener la perfusión.
         8. Cortar el cuello trasero y la columna vertebral y pele la piel de la cabeza y la parte dorsal del cráneo con tijeras de disección.
         9. Cortar los huesos premaxilares entre las órbitas de los ojos y quitar totalmente la parte dorsal del cráneo.
         10. Crear un espacio entre el cerebro y el hueso yugal del lado posterior y cortar los nervios de trigeminal y el quiasma óptico por debajo del cerebro. Cuidadosamente Remueva el cerebro y colocarlo en un frasco que contiene 4% PFA. Después fije el cerebro a 4 ° C durante 12-16 h.
   2. Preparación de corte de cerebro
      1. Transferir el cerebro fijado al 20% sacarosa/PBS hasta el cerebro se hunde en la solución para crioprotección.
      2. Cortar el cerebro fijado basado en el sector requiere orientación y necesaria parte del cerebro.
      3. Establecer la cryomicrotome. La hoja en posición y mantener la etapa de microtomo a temperaturas debajo de-20 ° C.
      4. Coloque el cerebro cortado en el escenario y el cerebro con 20% sacarosa/PBS de la capa. La solución de sacarosa/PBS congelará gradualmente, que cubre el cerebro en el escenario, hasta que el cerebro está completamente integrado en congelados 20% sacarosa/PBS.
      5. Cortar el cerebro (30 μm de espesor), deslizando la hoja a través del tejido. Transfiera las rebanadas de PBS y conservar a 4 ° C.
   3. Immunohistochemistry fluorescente
      1. Lave los cortes necesarios en 0,1% Triton X-100/PBS (SAFT) durante 10 minutos, 3 veces a temperatura ambiente (RT).
      2. Bloquear las rebanadas por los incubando previamente en SAFT con 2% cabra suero o 5% albúmina de suero bovino (BSA) para 1-2 h a TA.
      3. Incubar las rebanadas en una solución de anticuerpo con la concentración adecuada de anticuerpo primario previamente en SAFT con 2% cabra BSA suero o el 5% de 1 a 7 noches a 4 ° C.
      4. Lavar las rodajas en SAFT durante 10 min, 3 veces a TA.
      5. Incubar las rebanadas en una solución de anticuerpo secundario con la concentración adecuada de anticuerpos secundarios en SAFT para 1-2 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      6. Montar los cortes sobre portaobjetos de vidrio y cubrir con medio de montaje y cubierta de vidrio.
      7. Observar las láminas con microscopía de fluorescencia.
2. Prueba de tres cámaras
   1. Preparación
      1. Preparar por lo menos 2 2 - ratones 129/Sv de 6 meses de edad del mismo sexo como los ratones de tema que el "ratón extraño." Habituarse a todos los ratones en la jaula antes del análisis. Para cada sesión de entrenamiento, coloque el ratón en la jaula y deje el ratón durante 15 minutos.
      2. Antes de cada fase de habituación con el mouse del objeto, limpiar todo el aparato y dos jaulas frotando la superficie con etanol al 70%.
      3. Colocar las jaulas vacías en los compartimientos laterales de los aparatos de cámara de 3 y abrir las puertas entre las cámaras.
      4. Habituar el ratón tema, colocar un ratón del tema en la cámara del centro y permitir el ratón moverse libremente en todo el aparato hasta que el ratón ha investigado dos jaulas, más animales tema 5 minutos adicionales que pueden estar temerosos de la jaula no investigar la jaula por 20 min y no debe ser utilizado para este análisis. Estos animales Evite la jaula y raramente se acercan a la jaula.
      5. Después de que el animal se mueve en la sala centro, cerrar las puertas y dejar que el ratón se mueven libremente en el compartimiento de centro durante 5 minutos. Durante este período, uno de los ratones 129/Sv pone en una jaula para habituarse a la jaula.
   2. Análisis de la sociabilidad
      1. Llevar a cabo este análisis inmediatamente después del período de habituación del ratón tema.
      2. Colocar la jaula con un ratón 129/Sv, denominado la "jaula del extraño 1", en una de las cámaras del lado y la jaula vacía, denominada la "jaula del objeto", en la otra cámara de lado.
      3. Abra la puerta y monitorear el comportamiento del ratón tema.
      4. Permitir que el ratón tema moverse libremente durante 10 min y registrar los siguientes parámetros conductuales. Si el ratón tema tiene miedo del ratón en la jaula 1 extranjero, según lo indicado por el ratón evitando la extraño 1 jaula y queda en la esquina de una de las cámaras, el animal no puede usarse para el análisis.
         un) tiempo invertido en cada cámara, la cámara desconocido 1, cámara de objeto y compartimiento de centro.
         b) tiempo investigando cada jaula, la jaula 1 extranjero y la jaula del objeto. (El ratón se clasifica como investigar la jaula si el ratón es oler o toughing el ratón o jaula)
         c) el número de entradas en cada cámara (opcional)
         d) distancia total recorrida (opcional)
      5. Después de que el ratón se mueve en la sala del centro, cerca de las puertas.
   3. Análisis de novedad social
      1. Llevar a cabo este análisis inmediatamente después del análisis de la sociabilidad.
      2. Limpie ambas jaulas con etanol al 70%.
      3. Coloque otro ratón 129/Sv en una de las jaulas, denominadas la "Extraño 2 jaula" y el lugar el extraño 2 jaula en una de las cámaras. Colocar el ratón extraño 1 en la jaula, denominada la "jaula del extranjero 1" y la jaula 1 desconocido en la otra cámara.
      4. Abra la puerta y monitorear el comportamiento del ratón tema.
      5. Permite el ratón tema para moverse libremente durante 10 min y medir los mismos parámetros conductuales descritos para el análisis de la sociabilidad.
         Nota: El ratón forastero 1 y 2 de extraño debe ser elegido al azar. La cámara desconocido 1 y objeto cámara así como el extraño 1 cámara y cámara extranjero 2 se deben determinar al azar.
3. Discriminación miedo contextual
   1. Acondicionamiento
      1. Antes de cada ensayo de condicionamiento, limpiando la superficie con etanol al 70% para limpiar el aparato experimental.
      2. Colocar un ratón en un aparato de acondicionado con condiciones específicas (aparato forma, color de la pared, material del piso, olor, iluminación y volumen de ruido de fondo deben ser predeterminados). Por ejemplo, el aparato de acondicionado utilizado aquí fue un aparato cuadrado con paredes de plexiglás transparente, un piso de rejilla metálica, un olor de etanol, brillo de 100 lux y 65 dB ruido blanco.
      3. El ratón de la condición de pie-choque con pseudo-random tiempo de descargas eléctricas 0.1 mA para 2 s x 3 veces a lo largo de 5 minutos.
      4. Volver el ratón a la jaula casera después de acondicionado.
   2. Evaluación de la memoria
      1. Antes de cada evaluación, limpiando la superficie con etanol al 70% para limpiar el aparato experimental.
      2. Al día siguiente siguiente acondicionado, coloque el ratón en el mismo aparato como condición del choque y medir el tiempo de congelación a lo largo de 5 minutos.
      3. Más tarde el mismo día, coloque el ratón en un nuevo aparato y medir el tiempo de congelación durante una evaluación de 5 minutos. Aquí se utilizó un aparato triangular paredes de plexiglás blanco, piso de la placa, sin olor, brillo de 30 lux, y ruido de 70 dB blanco.
      4. Comparar el tiempo de congelación entre el mismo estado y condición de novela. Los ratones con una capacidad normal de memoria se congelarán más en las mismas condiciones que en la condición de novela. Congelación es definido inmovilidad del animal durante más de 2 s.

Resultados

Inyección repetitiva de PTZ induce un aumento en la severidad de convulsiones. Seis ratones C57BL/6 fueron tratados con PTZ, y otro 6 ratones fueron tratados con solución salina como grupo de control. La dosis PTZ fue de 35 mg/kg, y 10 inyecciones fueron administradas. La puntuación de ataque aumentó gradualmente con inyecciones de PTZ, considerando que no hay ataques o comportamientos anormales fueron evocados por las inyecciones de solución Salinas (figura 2

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo ampliamente accesible para el establecimiento de un modelo farmacológico de la epilepsia. Inflamación química mediada por PTZ tiene una larga historia y es un modelo comúnmente aceptado para el estudio de la patología celular y la histopatología de epilepsia⁴¹. El modelo de inflamación química de la epilepsia ha sido revisado previamente por Suzdak y Jansen, 1995⁴². Inducción de convulsiones farmacológicas, especialmente con PTZ, es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi