Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

العمليات النمائية مثل الانتشار، والهجرة، وثمرة نورت هي غالباً بالقلق في الأمراض العصبية. وبالتالي، فإننا نقدم بروتوكولات لتقييم سرعة وتكاثر هذه العمليات النمائية في الشخصيات البشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية. كما تسمح هذه البروتوكولات تقييم آثار عوامل النمو ذات الصلة والمداواة في التنمية للمجلس الوطني.

Abstract

عائدات التنمية الدماغ البشري من خلال سلسلة من عمليات مدبرة تحديداً، مع المراحل السابقة المتميزة بالانتشار، والهجرة، وثمرة نورت؛ والمراحل اللاحقة التي تتميز بتكوين ثمرة والمشبك إكسون/تغصن. في الاضطرابات النمائية، غالباً ما واحد أو أكثر من هذه العمليات تتعطل، مما يؤدي إلى تشوهات في تكوين الدماغ ووظيفة. مع ظهور التكنولوجيا البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسك)، أن الباحثين الآن وفرة من الخلايا البشرية التي يمكن أن تكون متباينة في تقريبا أي نوع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة تطور الدماغ العادية والمرضية المرض. يميز عدد من البروتوكولات باستخدام هيبسكس نموذج استخدام الأمراض العصبية الميؤوس من شفائهم للخلايا العصبية أو استخدام الثقافة 3D النظم تسمى أورجانويدس. في حين أثبتت هذه الأساليب لا تقدر بثمن في دراسة الأمراض البشرية المرضية، هناك بعض العيوب. التفريق بين هيبسكس في الخلايا العصبية وجيل من أورجانويدس هي طويلة ومكلفة من العمليات التي يمكن أن تؤثر على العدد من المتغيرات التي يمكن تقييمها والتجارب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تسمح الخلايا العصبية بعد الانقسامية وأورجانويدس دراسة العمليات المتعلقة بالمرض، بما في ذلك ثمرة تغصن وسينابتوجينيسيس، يحول دون دراسة العمليات السابقة مثل الانتشار والهجرة. في الاضطرابات النمائية، مثل مرض التوحد، تشير أدلة وافرة على الجثة والوراثية إلى العيوب في العمليات الإنمائية المبكرة. قد تكون الخلايا العصبية السلائف (الشخصيات)، وعدد سكانها خلية التكاثري عالية، نموذج مناسب لطرح أسئلة حول عمليات موسمية وبدء المرض. الآن نتقدم بمنهجيات المستخلصة من دراسة التنمية في الثقافات القشرية الماوس وفار للشخصيات البشرية. استخدام الشخصيات يسمح لنا بالتحقيق تعمل المتعلقة بالمرض وتحديد مدى اختلاف المتغيرات (مثلعوامل النمو والمخدرات) أثر العمليات الإنمائية بما في ذلك الانتشار، والهجرة، والتمايز في بضعة أيام فقط. في نهاية المطاف، يمكن استخدام مجموعة أدوات هذا بطريقة استنساخه والفائق للتعرف على الآليات الخاصة بالمرض وتعمل في الاضطرابات النمائية.

Introduction

استخدام أبسط الكائنات الحية ونماذج الفأر قد توضيح آليات نمو الدماغ الأساسية، فضلا عن منشأ المرض. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال مسببات العديد من الاضطرابات العصبية بعيد المنال لأن ليس كل النتائج التي توصل إليها في أبسط الكائنات ذات الصلة المباشرة بالجوانب المعقدة للأمراض البشرية. علاوة على ذلك، درجة أكبر من التعقيد في الدماغ البشري غالباً ما يجعل من الصعب لنموذج التنمية البشرية واضطرابات في الحيوانات. ومع تطور وتقدم البشرية المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (هيبسكس) التكنولوجيا، يمكن برمجتها في الخلايا الجذعية خلايا جسدية وثم متباينة داخل الخلايا العصبية لدراسة الأمراض البشرية. التقدم في تكنولوجيات هيبسكس و "أوميك" (علم الجينوم، ترانسكريبتوميكس، البروتيوميات، وجميع) يبشر بأحداث ثورة في فهم تطور الدماغ البشري. هذه التكنولوجيات الآن تتيح نهجاً "طب دقة" لوصف الأمراض العصبية على أساس حالة بحالة.

هو المحصول الحالي في مجال النمذجة المرض هيبسك التفريق بين الخلايا في المخططات العصبية محددة في أحادي الطبقة أو استخدام نظام ثقافة 3D دعا أورجانويد بإيجاز جوانب الدماغ التنمية1،2، 3. وكانت هذه النظم بشكل لا يصدق قيمة في دراسة وكشف الجوانب الفريدة للتنمية البشرية والمرض4،5،،من67. ومع ذلك، الثقافات الخلايا العصبية وأورجانويدس غالباً ما تتطلب في أي مكان من أسابيع لأشهر في الثقافة قبل أنهم مستعدون لدراسة. طبيعة تستغرق وقتاً طويلاً لهذه البروتوكولات، ومقدار الموارد اللازمة للحفاظ على هذه النظم الثقافة كثيرا ما تحد من عدد التجارب التي يمكن القيام بها والعدد من المتغيرات (مثل عوامل النمو أو المخدرات) التي يمكن اختبارها. علاوة على ذلك، ركزت العديد من الدراسات استخدام الخلايا العصبية بعد الانقسامية وأورجانويدس على عمليات مثل تشكيل تغصن ثمرة أو المشبك، التي تحدث في وقت لاحق في التنمية. أثناء هذه العمليات قد تورطت في علم الأمراض اضطرابات النمو مثل التوحد وانفصام الشخصية، في وقت سابق الأحداث التنموية التي تحدث قبل تمايز الخلايا العصبية نهائي أيضا مهمة للمرض المرضية8 ،،من910،11،،من1213. والواقع أن الدراسات الجينية الحديثة تبين أن الفترة منتصف الجنين، التي تتألف من الانتشار وثمرة عملية، والهجرة، أهمية خاصة في التوحد المرضية11،14. وبالتالي، من المهم دراسة الجذعية العصبية والسكان خلية السلف فهم أفضل لهذه العمليات السابقة. نظم أورجانويد، وتنمية العقل البشري الخص مدروسة بشكل أفضل بسبب طبيعتها 3D وهيكل المنظمة، تحتوي على بركة السلف التي استخدمت لدراسة بعض هذه الأحداث السابقة. بيد أن السكان السلف في أورجانويدس في كثير من الأحيان متفرقة وأكثر مثل الخلايا الدبقية شعاعي من العصبية الجذعية أو السلف الخلايا5،15. وهكذا، فإنه سيكون مفيداً لأسلوب إنتاجية عالية لدراسة المراحل المبكرة من النماء العصبي في حالة خلية التكاثري بنشاط سكان.

لقد أنشأنا في المختبر، وهو بروتوكول يستخدم خلايا السلائف العصبية المشتقة من هيبسك (الشخصيات)، وعدد سكانها مختلطة العصبية الجذعية وخلايا السلف التي عالية التكاثري، دراسة العمليات النمائية مثل انتشار الهجرة الخلية، و تمديد العملية الأولية (نورت). ووضعت هذه الاختبارات من التقنيات المستخدمة في المختبر لدينا عقود بنجاح دراسة النماء العصبي في الفئران والفأر الثقافات القشرية16،17،،من1819،20، 21،،من2223. الأهم من ذلك، فإنه يظهر أيضا أن تعمل والإشارات التنظيمية المحددة في أنظمة الثقافة الجرذ والفأر تنبؤية عالية للآليات التي تكون نشطة في فيفو، مشيراً إلى قيمة هذه التقنيات16، 1718،،،من1924. بعد التفريق بين الأولية هيبسكس للشخصيات، هذه الأساليب تسمح لنا بدراسة العمليات الإنمائية الحيوية في غضون أيام. هذه الأساليب لها العديد من المزايا: (1) أنها تتطلب معدات متطورة قليلاً وهي سهلة التنفيذ، replicates التجريبية (2) عديدة يمكن أن تجري في فترة قصيرة من الوقت، مما يسمح لتأكيد السريع في إمكانية تكرار نتائج النتائج، و (3) ويمكن اختبار الثقافة متغيرات مثل مصفوفات الطلاء، وآثار عوامل النمو، والنشاط من المخدرات بسرعة وفعالية من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، علينا الاستفادة من دور راسخة من عوامل النمو خارج الخلية المنظمين الحرجة للعمليات الإنمائية المتنوعة. الشخصيات تعرضت لتحديد إشارات التنموية مباشرة تحفز الأحداث مثل الانتشار وثمرة نورت والهجرة الخلية، ووجدت أنها تعزز القدرة على تحديد العيوب التي ليست واضحة في مراقبة شروط19 , 25 , 26 , 27 , 28-وبالمثل، يوفر سهولة تقييم المخدرات وسيلة قوية اعتماد تقنيات الطب الدقة لاختبار فعالية التدخلات العلاجية المختلفة. وبالتالي، يسهل هذا البروتوكول إنتاجية عالية، قابل لإعادة الإنتاج، ومنهجية واضحة لدراسة تطور الدماغ المبكر والمرض المرضية، والآثار المفيدة المحتملة لعوامل النمو والمخدرات على النماء العصبي تعمل.

Protocol

1-سلامة الإجراءات وصيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء

  1. إجراءات السلامة في مستوى السلامة الحيوية-2 (BSL-2)
    1. اتبع المبادئ التوجيهية لهذه المؤسسة في العمل مع المواد BSL-2. التخلص من المواد BSL-2 وفقا للممارسات للمؤسسة. وتشير إلى الغرف والمعدات المستخدمة لمواد BSL-2. ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، بما في ذلك مختبر المعطف والقفازات.
  2. صيانة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء
    1. استخدام خزانة السلامة الأحيائية معتمدة لاستخدام مواد مستوى BSL-2.
    2. تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء لمدة 15 دقيقة على الأقل، ومن ثم رش الأسطح بمحلول التبييض 10%. تتيح حل التبييض للجلوس لمدة 15 دقيقة ومسح أسفل مجلس الوزراء بدوره على تدفق الهواء قبل الاستخدام.
  3. تريتياتيد المشعة [ح]3[-إجراءات السلامة thymidine (التريتيوم)
    ملاحظة: التريتيوم مصدر مشعة الفئة 5، 'معظم المحتمل أن تكون خطرة' الفئة. اتبع المبادئ التوجيهية للمؤسسة للعمل مع النشاط الإشعاعي. بعض المؤسسات قد تتطلب شهادات أو تراخيص للتعامل مع التريتيوم.
    1. تلقي التدريب من المؤسسة حول كيفية التعامل بشكل صحيح والتخلص من التريتيوم. التخلص من النفايات المشعة في أوعية مناسبة، وفقا لسياسات المؤسسة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية عند العمل مع التريتيوم.

2-العصبية الاستقراء من إيبسكس

ملاحظة: لجعل الشخصيات، أعقب نسخة معدلة قليلاً من البروتوكول التي ترافق مجموعة التعريفي العصبية متاحة تجارياً. الطقم يتكون من وسائل الإعلام نيوروباسال (ملحوظة) و 50 x ملحق الاستقراء العصبية (NIS)، الذي يستخدم لجعل 1 × العصبية التعريفي المتوسطة (نيم). شيكل إسرائيلي جديد يستخدم أيضا لجعل 100 ٪ "متوسطة التوسع" (انظر الفرع 3-1). تم العثور على ارتباط للبروتوكول في قسم المواد والمعدات والمراجع43.

  1. إيبسكس مرور عندما تصبح روافد 70-80%.
  2. لوحة 300,000 إيبسكس إلى 1 من هيسك-مؤهل خارج الخلية مصفوفة تقليد لوحة 6-جيدا هلام (جل تقليد ECM) المغلفة التي تحتوي على 2 مل من اللجنة التوجيهية خالية من التغذية المتوسطة مع 5 ميكرومترات المانع روك. انظر 3.2 الفرع للحصول على إرشادات على الآبار طلاء مع هلام تقليد إدارة المحتوى في المؤسسة.
  3. يوم واحد في وقت لاحق، إزالة المتوسطة اللجنة التوجيهية + روك إيبسكس المانع ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني x 1. إضافة 2 مل نيم إلى إيبسكس.
    ملاحظة: يرصد 50 مل نيم بإضافة 1 مل 50 x شيكل و 250 ميليلتر (50 وحدة/مل، 5 ميكروليتر/mL) للبنسلين/ستربتوميسين (P/S) لمل 49 NB وسائط الإعلام.
  4. تغير وسائل الإعلام التعريفي العصبية كل يومين قبل يسفط قضى المتوسطة واستبدال مع 2 مل نيم حتى تصبح المتلاقية الخلايا (حوالي 4-5 أيام). تغيير وسائل الإعلام يوميا، وبمجرد خلايا الجلد.
  5. مرور الخلايا بعد 7 أيام في نيم واللوحة إلى إدارة المحتوى في المؤسسة-تقليد جل لوحة 6-جيدا المغلفة التي تحتوي على 2 مل 100% "التوسع في وسائل الإعلام" ومثبط روك 5 ميكرومترات. وتعتبر الخلايا مرور 0 (P0) الشخصيات في هذه المرحلة. انظر الفرع 3-1 أدناه للحصول على إرشادات لجعل 100 ٪ التوسع في وسائل الإعلام.
  6. مرور الخلايا باستخدام الأساليب الموضحة في القسم 3-4. انتظر حتى وصلت P2 الخلايا وهي متكدسة أمام الناي بوصمة عار لنواب الشعب الصيني علامات والطلاء للتجارب (الشكل 1).

3-ثقافة الإعلام وطلاء وصيانة للشخصيات

  1. إعداد الوسائط لصيانة الشخصيات (وسائل الإعلام توسيع 100 ٪):
    1. جعل 50 مل 100% التوسع في وسائل الإعلام من خلال الجمع بين مل 24.5 من DMEM/F12 مع 24.5 mL NB.
    2. أضف 1 مل 50 س شيكل DMEM/F12 + الحل ملحوظة. إضافة 250 ميكروليتر من الحل P/S إلى وسائل الإعلام.
      ملاحظة: وسائل الإعلام يمكن أن تكون مبردة (4 درجة مئوية) وتستخدم لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن جعل كميات أصغر من وسائل الإعلام بضبط كميات دميم/F12 + NB + NIS باستخدام نسب نفسه أما بالنسبة لحجم 50 مل.
  2. إعداد ECM-تقليد هلام المغلفة لوحات الثقافة للحفاظ على المجلس الوطني
    1. اليكووت هلام ECM-تقليد في وحدة التخزين اللازمة لجعل 6 مل من محلول العامل. حساب حجم اليكووت بالنظر إلى شهادة ورقة تحليل منذ ECM-تقليد جل عامل إضعاف يختلف من دفعة لدفعة والكثير بالكثير.
    2. ذوبان الجليد تقليد ECM جل قاسمة على الجليد ويذوب في 6 مل من البرد DMEM/F12 الوسائط.
    3. أضف 1 مل من محلول هلام/DMEM/F12 ECM-تقليد لكل بئر من صفيحة جيدا 6. احتضان لوحة 6-جيدا مع الحل-جل تقليد إدارة المحتوى في المؤسسة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. نضح ECM-تقليد جل الحل بعد 30 دقيقة من الحضانة واستبدال 100% التوسع في وسائل الإعلام أو لوحات في الثلاجة (4 درجات مئوية، يصل إلى 1 في الأسبوع) دون يسفط ECM-تقليد جل-الحل.
  3. صيانة الشخصيات
    1. لوحة الشخصيات في كثافة الخلايا 1.5 مليون إلى تقليد ECM هلام المغلفة جيدا يحتوي على 2 مل 100% التوسع في وسائل الإعلام.
    2. احتضان الشخصيات في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة مع شركة 5%2.
    3. إضافة 5 ميكرومترات من الصخور مثبط لوسائط الإعلام للشخصيات في P3 أو أقل، أو للشخصيات المذابة، لمنع موت الخلايا المفرط. تغيير وسائل الإعلام بعد 24 ساعة لإزالة المانع روك.
    4. مرور خلايا كل أيام 4-9، اعتماداً على عندما يصبحون المتلاقية. وتعتبر الخلايا المتلاقية عندما يصبحون أحادي الطبقة وجبات كثيفة تغطي كامل أسفل سطح الطبق.
    5. لوحة الشخصيات في كثافة الخلايا 1 إلى 1.5 مليون في بئر واحدة للوحة 6-جيدا (انظر الفرع 3، 4). قم بإزالة الوسائط قضى كل ح 48 واستبدال مع 2 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام.
  4. رفع وننأى وبيليه الشخصيات للصيانة و/أو تصفيح للظروف التجريبية
    1. نضح الخلايا المتوسطة، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني x 1. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكروليتر 1 x الخلية المفرزة الحل إلى 1 من المتلاقية الشخصيات. إينكوباتي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 500 ميكروليتر من درجة حرارة الغرفة (RT) برنامج تلفزيوني وتغسل جيدا استخدام ماصة P-1000 لضمان التخلص خلايا. جمع الخلايا + حل برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي 15 مل. أغسل اللوحة مرة أخرى مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة السائل إلى الأنبوب.
    3. تدور الخلايا لأسفل في 300 غرام x لمدة 5 دقائق بيليه.
    4. إزالة المادة طافية من بيليه الخلية وتعليق إعادة الخلايا في 1-5 مل من وسائط الإعلام DMEM/F12 المعالجون مسبقاً. تمييع الخلايا بكثافة من 1 إلى 4 مليون خلايا/مل من وسائل الإعلام. تحديد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    5. لوحة العدد المطلوب من الخلايا، ومحددة لصيانة نواب (الفرع 3-3) أو المقايسة الفردية التي تجري (راجع الأقسام التالية لمزيد من التفاصيل).
    6. ضبط حجم تعليق الخلية مع وسائل الإعلام بحيث تستخدم بين 15 إلى 100 ميكروليتر من الخلايا لكل بئر/طبق. ويضمن هذا الطلاء الصغيرة الحجم أن هناك توزيع الخلية حتى وأن هي لم تضعف عوامل النمو، والمخدرات، أو ركائز على المديين المتوسط و.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة للصيانة لمجلس الشعب أو الاطلاع على تفاصيل محددة لفحوصات الفردية.
  5. إعداد الوسائط للظروف التجريبية (وسائل الإعلام توسيع 30%)
    1. تمييع وسائط الإعلام توسيع 100% بنسبة 70% (30% ووصف التوسع) بإضافة 1:1 DMEM/F12 + الحل ملحوظة لجعل وسائل الإعلام للظروف التجريبية.
    2. جعل 20 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام عن طريق إضافة 6 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام وتمييع مع 7 مل من NB و 7 مل من الإعلام DMEM/F12. إضافة 5 ميليلتر/مل من محلول P/S.
      ملاحظة: إذا كان يحتوي بالفعل على وسائل الإعلام 100% P/S، ثم إضافة 5 ميكروليتر/مليلتر بالنسبة دميم جنبا إلى جنب/F12 + NB = (14 مل) × (5 ميكروليتر/mL) = 70 ميكروليتر من P/S بدلاً من 100µL.
    3. إضافة ركائز طلاء وعوامل النمو في التركيزات المطلوبة لوسائل الإعلام توسيع 30%.

4-تقييم توليف الحمض النووي، ودخول مرحلة ثانية، وأرقام الخلية من الشخصيات

  1. التحضير لتركيب الدنا، ودخول المرحلة S، والمقايسة رقم الخلية
    1. جعل حل أسهم 1 ملغ/مل من بولي-د-يسين (PDL) في dH2س وتعقيم عامل التصفية. تمييع 01:10 في dH2س جعل 0.1 مغ/مل الحل PDL وإضافة 300 ميكروليتر لكل بئر من صفيحة جيدا 24 أو 1 مل إلى طبق 35 ملم. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت
    2. غسل الآبار PDL 3 مرات لمدة 5 دقائق مع2dH dH O. أسبيراتي2س وإضافة 300 ميكروليتر/بئر أو 1 مل/طبق من لامينين (5 ميكروغرام/مل) المخفف في برنامج تلفزيوني x 1. تغطي اللوحات مع بارافيلم وتبقى في السلامة الأحيائية عقيمة، مجلس الوزراء بين عشية وضحاها في الرايت (ح 12 إلى 24).
    3. تحضير الوسائط توسيع 30% (انظر القسم 3.5) بعد 12 إلى 24 h. إضافة مركبات، عوامل النمو، أو المخدرات لمصلحة في التركيز المطلوب في وحدات التخزين التي هي أقل من 10% الحل الكلي لتجنب إضعاف المؤسسات الوطنية في 30% "متوسطة التوسع".
    4. تغسل كل جيدا لصفيحة 24-جيدا مرتين مع 1 x برنامج تلفزيوني (5 دقيقة في كل). نضح 1 x PBS وإضافة 450 ميكروليتر من وسائل الإعلام (بدون أو مع عوامل المخدرات/النمو). احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا.
    5. لكل تجربة، إعداد الآبار أو أطباق كل الشرط 2-3.
    6. لوحة الشخصيات (انظر الفرع 3، 4):
    7. نواب الحمض النووي التوليف المقايسة: 100,000 الخلايا/بئر في صفيحة جيدا 24
    8. S-مرحلة الإدخال: 500,000 الخلايا/35 مم صحن
    9. المقايسة عدد الخلايا: 50,000 خلايا/بئر في صفيحة 24-جيدا
  2. السلائف العصبية خلايا الحمض النووي التوليف المقايسة
    1. لوحة 100,000 الخلايا/بئر في لوحة 24-جيدا وتقييم في ثلاث نسخ/الشرط.
    2. إضافة تريتياتيد المشعة، [ح]3[-التريتيوم للثقافة المتوسطة (1.5 μCi/mL) في كل بئر بعد ح 46 في الثقافة. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 2.
      ملاحظة: عند استخدام المواد المشعة، تتلقى التدريب من المؤسسة ومتابعة النشاط الإشعاعي بروتوكولات الأمان، والتخلص من المواد المشعة في أوعية النفايات المعينة على النحو المناسب.
    3. إزالة بشكل صحيح التصرف الإعلامي المشعة بعد حاء 2 إضافة 300 ميكروليتر من قبل استعد 0.25% التربسين-يدتا (0.5 ملم) لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بتشغيل حصاده الخلية (انظر المواد والمعدات قسم) والمضخة والتأكد من أن ضغط المضخة أدناه 200 رطل/بوصة مربعة. ضع ورق الترشيح من خلال الفضاء في حصاده الخلية والمسيل للدموع من الزاوية اليمنى بمناسبة اتجاه الورق.
    5. وضع أنابيب جمع من حصاده الخلية إلى علبة "فارغة" فارغة واضغط بروش ترطيب الورقة عامل التصفية. وضع أنابيب جمع في عينة الآبار وتشغيل (بدء).
    6. عند انتهاء حصاده خلية جمع العينات، ورفع المشبك ومقدماً ورقة مرشح لتكرار لجميع مجموعات عينة. بروش دائماً في صفيحة فارغة، "فارغة".
    7. الجاف لورق الترشيح تحت مصدر ضوء وإعداد قنينة المقابلة في علبة. لكمه من أصل تشادس الورقة في قنينات وإضافة 2 مل من سائل التﻷلؤ كوكتيل لكل قنينة. قارورة كاب والتسمية.
    8. احتضان القنينات في التﻷلؤ السائل كوكتيل على الأقل 1 ح قبل قراءة التهم في الدقيقة (CPMs) على جهاز التﻷلؤ.
  3. مقايسة دخول مرحلة ثانية للمجلس الوطني
    1. انظر 3.4 القسم لاتخاذ خطوات رفع وننأى وبيليه، وإعادة تعليق الخلايا.
    2. لوحة خلايا 500,000 كل طبق في الأطباق 35 ملم التي أعدت في الفرع 4-1، طبق فقط 1/شرطا لهذه الخطوة.
    3. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 46.
    4. إعداد ثلاث لوحات 35 ملم المغلفة مع PDL/لامينين كل حالة بعد 24 ساعة. على سبيل المثال، إذا كان هناك واحد طبق 35 ملم من 30% التوسع في وسائل الإعلام وطبق 35 ملم واحد من 30% التوسع في وسائل الإعلام + صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل) ثم معطف 6 لوحات PDL/لامينين لاستخدامها في اليوم التالي.
    5. إضافة 2 ميكروليتر/مل من 5 مم إيدو للثقافات بعد 46 h. إينكوباتي عن ح 2.
    6. فصل وبيليه الخلايا (انظر الفرع 3، 4). إعادة تعليق بيليه الخلية في 3 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام أو 3 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام + عوامل النمو المنشود/المخدرات.
    7. بلايت 1 مل كل صحن قبل المغلفة PDL/Laminin الأطباق. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية ح 2 للسماح للخلايا للانضمام إلى الطبق. انظر الشكل 2 لوضع جدول زمني مبسطة.
  4. تحليل دخول المرحلة S
    1. إصلاح الأطباق مع المثلج 4% بارافورمالدهيد (منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x) لمدة 20 دقيقة. ثم، غسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. أضف 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع 0.05% "أزيد الصوديوم" لمنع نمو البكتيريا والفطريات. ويمكن تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر إذا كان يتم الاحتفاظ بالاطباق (مختومة مع بارافيلم) في برنامج تلفزيوني + الصوديوم أزيد الحل، على الرغم من كل شيء لا المناعية المستضدات يتم الحفاظ عليها جيدا بعد تأخير طويل في التحليل.
    3. الاعتداء الخلايا باستخدام فعل إيدو تجاري كيت (انظر البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة). وصمة عار الخلايا باستخدام DAPI أو علامة نووية أخرى، والصورة باستخدام مجهر الأسفار.
    4. تقييم نسبة الخلايا إيجابية إيدو على مجموع الخلايا الحية (عدد الخلايا الإجمالي) الأعمى في 10 حقول عشوائية بشكل منهجي (10 x). ولا تشمل الخلايا الميتة في التحليل.
    5. الاستفادة من كل مرحلة التباين الصور والصور الفلورية إلى تحديد تلطيخ إيدو الإيجابية والتأكد من الخلايا التي هي ميتة أو حية (الشكل 3).
    6. حساب كافة الخلايا التي تحتوي على حد سواء على نحو سلس وحتى غشاء الخلية في مرحلة إعدادات التباين، ونواة المجزئة كبيرة بنيون DAPI النووية وصمة عار، كما هي تعيش هذه الخلايا (الشكل 3 أ-ب).
    7. استبعاد كافة الخلايا التي مرحلة مشرقة، غشاء الخلية غير متكافئ مكسورة، ويكون نواة صغيرة ومكثف كما تصور بنيون DAPI التصوير، كما أن هذه الخلايا ميتة (الشكل 3 أ-ب). تقييم الخلايا الحية للتعبير عن إيدو بتحديد الخلايا التي تحتوي على إيدو الفلورسنت مشرق وصمة عار تغطي نواة كاملة أو تلطيخ الفلورسنت الأرقط في النواة (الشكل 3).
  5. نواب المقايسة رقم الخلية
    1. بعد 2 يوما في الثقافة، تسمية وإعداد أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل و 0.5 مل أنابيب ميكروسينتريفوجي. في كل أنبوبة 0.5 مل، إضافة 5 ميكروليتر تريبان الأزرق.
    2. لكل بئر من صفيحة جيدا 24، إزالة المتوسطة وإضافة 200 ميكروليتر 1 × الخلية المفرزة الحل والمكان في الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة.
    3. بعد الوقت المخصص له، بمجرد رفعت الخلايا، إضافة المبلغ المطلوب من برنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر.
      ملاحظة: بشكل عام، في اليوم 2، إضافة 300 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x للخلايا التي تتضمن أيضا بالإضافة إلى 200 ميكروليتر من الحل مفرزة لإجمالي حجم 500 ميكروليتر. مع مرور الوقت احتضان ثقافة إضافية، كما تصبح الخلايا أكثر المتلاقية، زيادة حجم التخفيف حسب الضرورة. على سبيل المثال، في يوم 4، إضافة 500 ميكروليتر 1 × برنامج تلفزيوني، وفي يوم 6، إضافة 800 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x. سوف يكون إجمالي حجم 700 ميكروليتر ومل 1، على التوالي.
    4. استخدام ماصة P-1000، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً في كل جيدا من 4 إلى 5 مرات لإزالة الخلايا. فحص لوحة تحت مجهر للتأكد من أن كافة الخلايا وقد فصل. نقل الخلايا إلى أنابيب 1.5 مل.
    5. عكس أنابيب 1.5 مل مع خلايا المخفف 2 إلى 3 مرات. ثم تأخذ من 50 ميكروليتر الكوة من الخلايا في منتصف الأنبوبة وإضافة إلى أنابيب 0.5 مل مع تريبان الأزرق (انظر 4.5.1).
    6. حل الخلية الماصة صعودا وهبوطاً 2 إلى 3 مرات. إضافة خلايا إلى هيموسيتوميتير وتحليل فورا. الانتظار لفترة أطول من 10 دقيقة قد تزيد من موت الخلايا أو وجود خلايا التي اتخذت حتى تريبان الأزرق.
    7. إضافة 10 ميليلتر من خلية + خليط تريبان الأزرق بعناية على كل جانب من هيموسيتوميتير لإجراء نسخ متماثل التهم الموجهة إليه. حساب عدد الخلايا باستخدام المجهر الطوري. لا تحسب الخلايا الميتة أو الخلايا الزرقاء الداكنة التي اتخذت تريبان الأزرق.
    8. للحصول على استخدام رقم الخلية إجمالي المتوسط عدد الخلايا اعتبارا من 4 أركان هيموسيتوميتير وتطبيق المعادلة التالية:
      يعني عدد الخلايا × حجم الوسائط (mL) x 10,000 = خلية إجمالي عدد/جيد
    9. نضح وتكرار الإجراء على الآبار المتبقية. تغيير الوسائط في الخلايا التي لا يجري تحسب، كل حاء 48 تكرار الفحص في 4 أيام و 6.

5-المجلس الوطني نورت الإنزيم

  1. إعداد الأطباق ووسائط الإعلام للمقايسة نورت
    1. جعل حل أسهم 1 ملغ/مل من بولي-د-يسين (PDL) في dH2س وتعقيم عامل التصفية. تمييع 01:10 في dH2س لجعل حل PDL 0.1 مغ/مل وإضافة 1 مل لكل طبق 35 ملم. احتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت
    2. وفي الوقت نفسه، تحضير الوسائط توسيع 30% (انظر القسم 3.5) وإضافة 5 ميكروغرام/مل (5 ميليلتر/mL) من محلول فيبرونيكتين (1 ملغ/مل الأسهم) إلى وسائل الإعلام.
    3. مرة واحدة مستعدة، في وسائل الإعلام إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو العقاقير ذات الاهتمام في التركيزات المطلوبة.
      ملاحظة: من الأفضل إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو المخدرات، وفي وحدات التخزين < 10% من مجموع الحل لتجنب إضعاف فيبرونيكتين والمكونات الأخرى في المتوسط 30% التوسع.
    4. وبعد 20 دقيقة، غسل الأطباق PDL 3 مرات لمدة 5 دقائق مع dH2س لإزالة الزائدة PDL. ضمان جافة الأطباق قبل إضافة وسائط الإعلام.
    5. ضع 1 مل من وسائل الإعلام (مع أو بدون عوامل المخدرات/النمو) + الحل فيبرونيكتين في كل طبق المغلفة PDL.
    6. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا لضمان ارتباط السليم فيبرونيكتين PDL.
    7. لكل تجربة، قم بإعداد أطباق 2-3 كل شرط (مثلاً، الأطباق المحتوية على المركبات 3، 3 الأطباق التي تحتوي على المخدرات).
  2. تصفيح الشخصيات للمقايسة نورت
    1. انظر 3.4 القسم لاتخاذ خطوات رفع وننأى وبيليه، وريسوسبيند الخلايا.
    2. لوحة 50,000 الخلايا الواحدة وطبق في الأطباق التي أعدت في القسم 5-1. تحرض الأطباق ذهابا وإيابا في جميع الاتجاهات لضمان توزيع حتى من الخلايا.
    3. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 48.
  3. تحليل نيوريتيس
    1. بعد حضانة الخلايا ح 48، نضح المتوسطة، وإصلاح الأطباق مع الجليد الباردة 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة.
    2. وبعد 20 دقيقة، غسل الأطباق 3 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني 1 x. بعد الغسيل النهائي، أضف 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع 0.05% "أزيد الصوديوم".
    3. تحليل الأطباق عمياء على مجهر تباين المرحلة في 32 X. حساب مجموع الخلايا والخلايا مع نيوريتيس في الصفوف 1 سم 3،، تم اختيارهم عشوائياً من مواقف لكن استنساخه. حساب الحد ني خلايا 150 كل طبق لضمان أخذ العينات كافية.
      ملاحظة: يعرف نورت كملحق (العملية) من جسم الخلية هو > 2 أقطار الخلية الجسم في الطول. للخلايا مع عمليات متعددة، تعتبر عملية أطول للمعيار. الخلايا مع العمليات التي < جسم الخلية 2 أقطار في الطول لا تشمل (الشكل 4).
    4. إضافة معا العدد الإجمالي للخلايا، والعدد الكلي للخلايا مع نيوريتيس في كل طبق. حساب النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس. متوسط النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس عبر تكرار الأطباق. يتم تأسيس الثقة في إمكانية تكرار نتائج تجريبية عند كافة الصفوف داخل كل طبق متشابهة، والمتوسطات بين أطباق متشابهة جداً، مع الخطأ المعياري للوسط (SEM) < 10%.
    5. وبدلاً من ذلك، تحليل نيوريتيس بإجراء إيمونوسيتوتشيميستري لعلامات مثل بيتا-ثالثا-tubulin (TUJ1) أو MAP2. بعد تلطيخ لعلامة اهتمام، تأخذ 10 صور عشوائية بشكل منهجي على مجهر فلوري في 10 X. صورة الخلايا 200 على الأقل. وفي هذه الحالة، الحصول على الصور غير قريبة جداً إلى حافة الطبق. تحليل النسبة المئوية للخلايا مع نيوريتيس TUJ1 أو MAP2 + (انظر الشكل 10 على سبيل مثال).

6-مجلس الشعب نيوروسفيري الهجرة الإنزيم

  1. تشكيل نيوروسفيري
    1. إضافة 1 مل من 100% التوسع في وسائل الإعلام إلى طبق 35 ملم مع لا طلاء الركازة. احتضان الأطباق لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية قبل أن تصفيح الشخصيات. تحضير الأطباق 2-3 لضمان عدم وجود ما يكفي نيوروسفيريس لفحص الهجرة الخلية.
      ملاحظة: نظراً لغياب الركيزة طلاء يضمن أن الشخصيات تظل معلقة في وسائل الإعلام، هو أمر أساسي لتشكيل نيوروسفيري. طلاء أطباق سيمنع تشكيل نيوروسفيري.
    2. انظر القسم 3.4 في خطوات لرفع وننأى وبيليه الخلايا. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2-5 مل من قبل حرارة 100% "التوسع في وسائل الإعلام". الشخصيات بلايت 1 مليون إلى طبق 35 ملم كل إعداد في المقطع 6.1.1.
    3. احتضان الشخصيات في 37 درجة مئوية ح 48 إلى 96 للسماح للشخصيات بالكلية ونموذج نيوروسفيريس. تقييم حجم المجال باستخدام مسطرة يعيش في مجهر تباين مرحلة. الانتظار لمعظم المجالات للوصول إلى قطرها تقريبي من 100 ميكرومتر (± 20 ميكرومتر) (الشكل 5). سوف تفريق مجالات أصغر والتفكك أثناء فحص الهجرة تماما.
  2. إعداد لوحات لفحص الهجرة نيوروسفيري
    1. حل مختبرين جل ECM-تقليد (راجع قسم 3.2) إلى 6 مل من 30% التوسع في وسائل الإعلام. مرة واحدة على استعداد gel/30% ECM-تقليد حل "التوسع في وسائل الإعلام"، إضافة المركبات، وعوامل النمو، أو العقاقير للمصالح في التركيزات المطلوبة.
      ملاحظة: السيارة، والمخدرات، وتركيزات عامل النمو تحتاج إلى زيادة للحساب لإضافة 200 ميليلتر من نيوروسفيريس في القسم 6.3.
    2. بلايت 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة-تقليد جل حل "توسع وسائل الإعلام" 30% (± المركبات، وعوامل النمو، أو المخدرات) في بئر واحدة للوحة 6-جيدا. جعل الآبار 2-3 في حالة تجريبية. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأطباق 35 ملم. احتضان لوحات لمالا يقل عن 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لا نضح gel/30% ECM-تقليد حل "التوسع في وسائل الإعلام" لهذا التحليل. تصفيح المجالات على جل ECM-تقليد يستنشق سيؤدي إلى الهجرة السريعة والزائدة.
  3. طلاء نيوروسفيريس
    1. جمع نيوروسفيريس التي شكلت في القسم 6-1، ووضعها في أنبوب مخروطي. أغسل 35 ملم يتم جمع الأطباق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني x 1 لضمان جميع نيوروسفيريس. زيادة ونقصان لأسفل نيوروسفيريس التي تم جمعها في 100 غ س لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة تعليق في نيوروسفيريس في 1-3 مل من قبل حرارة 30% "التوسع في وسائل الإعلام". إذا كان يتم جمع الصحن 1 من نيوروسفيريس، يتم استخدام 1 مل من وسائل الإعلام ريسوسبيند المجالات. إذا كان يتم تجميع الأطباق 2، 2 مل من وسائل الإعلام إضافة إلى ريسوسبيند المجالات، إلخ "الماصة؛" بلطف واستخدام فقط P-1000 للتأكد من المجالات ليست مقطوعة.
    3. لوحة 200 ميكروليتر من نيوروسفيريس ريسوسبينديد في gel/30% ECM-تقليد توسيع الحل المقدمة في القسم 6-2. لوحات روك في كافة الاتجاهات لتوزيع نيوروسفيريس بالتساوي. احتضان لوحات ل 48 ساعة في 37درجة مئوية.
    4. إزالة المحتوى-تقليد gel/30% الحل "التوسع في وسائل الإعلام"، وإصلاح الخلايا في 4% منهاج عمل بيجين، والغسيل، وإبقاء الخلايا في 1 × برنامج تلفزيوني + 0.05% "أزيد الصوديوم".
  4. تحليل نيوروسفيريس
    1. الحصول على الصور من أسرة نيوروسفيريس باستخدام إعدادات التباين المرحلة في 10 X. ضمان مجالات عدم لمس كل منهما الآخر. قياس متوسط الهجرة باستخدام البرمجيات إيماجيج.
    2. تتبع المنحنى الخارجي من نيوروسفيري باستخدام أداة الخط اليدوي. يمكن الوصول إلى خط يدوي بالنقر على أيقونة "المستقيم". تتبع يدوياً باستخدام ماوس.
    3. استخدم الدالة التدبير لحساب مجال التتبع. تأكد من تحديد "المنطقة" كقراءة في الإطار "تعيين قياسات" الموجودة ضمن علامة التبويب تحليل. انظر الشكل 6 للتتبع للمحيط الخارجي باللون الأزرق.
    4. تتبع كتلة الخلايا الداخلية من ناحية المجال والتدبير. انظر الشكل 6 لتتبع كفاف الداخلية باللون الأحمر. قياس متوسط الهجرة بطرح كتلة الخلايا الداخلية من منطقة نيوروسفيري الإجمالي.
    5. نيوروسفيريس التدبير الذي يحمل كتلة خلية داخلية كثافة مع الخلايا المهاجرة بها كسجادة متجاورة (الشكل 6).
    6. لا تقم بتضمين الخلايا خارج السجاد أو بعيدة عن نيوروسفيري للقياس. انظر الشكل 6 للحصول على أمثلة من الخلايا (دائري باللون الأبيض) التي تستبعد من قياس السجاد الخارجي. تحليل الحد أدنى من 20 نيوروسفيريس لكل حالة.

النتائج

الهدف من هذه الدراسات تحديد النشاط التكاثري للشخصيات، وهي زيادة في إعداد الخلايا. ويتحقق ذلك بتقدير تركيب الدنا من خلية إجمالي السكان، نهجاً الفائق الذي يقيس إدماج thymidine تريتياتيد المشعة التتبع في مقتطفات الخلية، ويعكس جميع خلايا تعمل في مرحلة ثانية، سواء كانوا توليف ل?...

Discussion

البروتوكولات المقدمة هنا توضيح طرق سريعة وبسيطة دراسة العمليات النمائية الأساسية واختبار عوامل النمو والعقاقير استخدام الخلايا السليفة العصبية المشتقة من هيبسك. وثورة التكنولوجيا هيبسك دراسة الآلية المرضية للأمراض العصبية النمائية بتزويدنا بالوصول غير مسبوق يعيش الإنسان الخلايا الع?...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها مجلس حاكم ولاية نيو جيرسي للبحوث الطبية والعلاج من مرض التوحد (CAUT13APS010؛ CAUT14APL031؛ CAUT15APL041)، لوري نانسي يمثل مؤسسة الأسرة، والمبرات تؤدي ميندوركس، ومؤسسة الجالية اليهودية من أكبر مترويست نيوجيرسي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 MediumThermoFischer Scientific12634-010Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103049Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified MatrigelCorning354277hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302ROCK inhibitor
6 well platesCorningCOR-3506Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well platesThermoFischer Scientific2021-05Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishesThermoFischer Scientific2021-01Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse LamininInvitrogen23017-015Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
FibronectinSigmaF1141Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-LysineSigmaP0899Substrate for coating plates
Penicillin/StreptomycinThermoFischer Scientific15140122Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X)Gibco15090-04610X enzymatic solution
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidinePerkinElmerNET027E001Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation VialsFisherbrand03-337-1Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counterBeckman Coulter8043-30-1194Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging KitThermoFisher ScientificC10337EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paperGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2Peprotech100-18Bgrowth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)BACHEMH-8430neuropeptide

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved