АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Психомоторного развития процессы, такие, как распространение, миграции и neurite нарост часто возмущенных в психоневрологических заболеваний. Таким образом мы представляем протоколы можно воспроизвести и быстро оценить эти процессы нервной в человека iPSC производные РНУ. Эти протоколы позволяют также оценки воздействия соответствующих факторов роста и терапии по развитию NPC.

Аннотация

Развитие человеческого мозга проходит через ряд четко спланированных процессов, с ранних этапов распространения, миграции и neurite нарост; и более поздних стадиях характеризуются аксона/дендритов нарост и синапса формирования. В нервной расстройств часто один или несколько из этих процессов разрушаются, ведущих к аномалии в мозге формирования и функции. С появлением человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) технологии исследователи теперь имеют в избытке человеческих клеток, которые могут быть дифференцированы в практически любой тип клеток, включая нейронов. Эти клетки могут использоваться для изучения развития нормального мозга и патогенез болезни. Ряд протоколов, с помощью hiPSCs для моделирования использования психоневрологические заболевания неизлечимо продифференцировано нейронов или использование 3D культуры систем называется organoids. Хотя эти методы доказали неоценимое значение в изучении патогенеза заболеваний человека, есть некоторые недостатки. Дифференциация hiPSCs в нейроны и поколения organoids, длительных и дорогостоящих процессов, которые могут повлиять на количество экспериментов и переменных, которые могут быть оценены. Кроме того в то время как после митотическая нейронов и organoids позволяют исследования процессов, связанных с болезнями, включая дендритов нарост и synaptogenesis, они исключают изучения предыдущих процессов как миграции и распространения. В нервной расстройств, таких как аутизм обильные доказательства генетических и посмертные указывает дефекты в начале процессов развития. Клетки-предшественники нейронных (НПС), высокой пролиферативной клеток населения, может быть подходящую модель, в которой задавать вопросы о онтогенетические процессы и начало болезни. Теперь мы расширяем методологий, извлеченные из изучения развития в мышь и крыса корковых культур для человека РНУ. Использование НИПы позволяет нам исследовать связанные с болезнью фенотипы и определить как различные переменные (например, факторы роста, наркотики) воздействия процессов развития включая распространения, миграции и дифференциация лишь через несколько дней. В конечном итоге этот набор может использоваться в духе воспроизводимость и высок объём для выявления механизмов конкретных заболеваний и фенотипы в нервной расстройств.

Введение

Использование мыши модели и проще организмов выяснены механизмы развития основных мозга, а также патогенеза болезни. Несмотря на эти достижения этиологию многих психоневрологических расстройств ускользает, потому что не все результаты в более простые организмы имеют непосредственное отношение к сложные аспекты заболеваний человека. Кроме того большую сложность человеческого мозга часто делает его трудным для модели человеческого развития и расстройства в животных. С Эволюция и прогресс человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) технологии соматические клетки можно перепрограммировать в стволовые клетки и затем дифференцированной в нейрональные клетки для изучения болезней человека. Достижения в технологии hiPSCs и «omic» (геномика, transcriptomics, протеомики и метаболомики) обещает революционизировать понимание развития человеческого мозга. Эти технологии теперь сделать возможным «точность медицина» подход к характеристике психоневрологических заболеваний на основе case-by-case.

Текущий штапель в поле hiPSC заболевание моделирование является дифференцироваться в определенных нейронов подтипы в монослое клеток или использовать систему 3D культуры под названием органоид резюмировать аспекты мозга развития1,2, 3. Эти системы были невероятно ценным в изучении и расчехлять уникальные аспекты развития человеческого потенциала и болезни4,5,6,7. Однако нейронов культур и organoids часто требуют везде от недель до месяцев в культуре прежде чем они готовы учиться. Трудоемкий характер этих протоколов и количество ресурсов, необходимых для поддержания этих систем культуры часто ограничивают количество экспериментов, которые могут быть выполнены и количество переменных (как факторы роста или наркотиков), которые могут быть проверены. Кроме того многие исследования с использованием пост митотическая нейронов и organoids были сосредоточены на процессы такие как нарост или синапса образования дендритов, которые происходят позже в процессе развития. Хотя эти процессы были причастны к патологии развития расстройств, таких как аутизма и шизофрении, ранее развития события, которые происходят до окончательного нейрональных дифференциация также важны для патогенеза заболеваний8 ,9,10,11,12,13. Действительно недавние геномные исследования показывают, что периода середины плода, который состоит из распространения, процесс нарост и миграции, особенно важное значение в патогенезе аутизм11,14. Таким образом важно изучить нервных стволовых и прародитель клеточных популяций, чтобы лучше понять эти ранее процессов. Органоид систем, которые считаются лучше итог развития человеческого мозга из-за их 3D природа и организованную структуру, содержать прародителя бассейн, который был использован для изучения некоторых из этих более ранних событий. Однако прародитель населения organoids часто является редким и больше как радиальные глиальные клетки чем нервных стволовых и прогениторных клеток5,15. Таким образом было бы полезно иметь высокую пропускную способность метода для изучения ранних стадиях нейроразвития в популяции активно пролиферативной клеток.

В лаборатории, мы создали протокол, использующий hiPSC производные нейронных прекурсоров клетки (НПС), смешанного населения нервных стволовых и прогениторных клеток, что весьма пролиферативная, изучение неврологического процессов, таких как распространение, миграции клеток, и расширение начального процесса (neurite). Эти анализы были разработаны от методов, используемых в нашей лаборатории на протяжении десятилетий успешно учиться нейроразвития крысы и мыши корковых культур16,,1718,19,20, 21,,22-23. Важно отметить, что также было показано, что фенотипы и регулирования сигналов, определенных в системах культуры крысы и мыши очень интеллектуальный механизмов, которые активно в естественных условиях, указывающее значение этих методов16, 17,18,19,24. После первоначального дифференциации hiPSCs с НПС эти методы позволяют нам для изучения жизненно важных процессов развития в считанные дни. Эти методы имеют много преимуществ: (1) они требуют мало сложного оборудования и легко осуществить, (2) многочисленные экспериментальные реплицирует может проводиться в течение короткого времени, позволяя быстрое подтверждение воспроизводимости результатов, и (3) Культура переменных, таких как покрытие матрицы, эффекты факторов роста и активности препаратов могут быть проверены, быстро и экономично. Кроме того мы воспользоваться хорошо созданы роль внеклеточных факторов роста как критические регуляторы различных процессов развития. НПС были подвержены выбрать развития сигналы, которые непосредственно стимулировать такие события, как распространение, neurite нарост и миграции клеток и обнаружили, что они повышают способность выявлять дефекты, которые не проявляются в условиях управления19 , 25 , 26 , 27 , 28. Аналогичным образом, облегчения оценки наркотиков обеспечивает мощный авеню принять точности методов медицины для проверки эффективности различных терапевтических вмешательств. Таким образом этот протокол способствует высокой пропускной способности, воспроизводимость и простой методологии для изучения раннего развития мозга, патогенеза заболевания и потенциальных благотворно факторов роста и наркотиков на фенотипы психомоторного развития.

протокол

1. безопасность процедуры и обслуживание кабинета по биобезопасности

  1. Процедуры безопасности уровня биобезопасности-2 (BSL-2)
    1. Следуйте рекомендациям, учреждения по работе с материалами BSL-2. Утилизация материалов BSL-2 по данным Института практики. Укажите номера и оборудование, которые используются для материалов BSL-2. Носите все средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат и перчатки.
  2. Техническое обслуживание кабинета по биобезопасности
    1. Используйте биобезопасности кабинета, сертифицированные для использования BSL-2 уровня материалов.
    2. Включите УФ света в области биобезопасности, кабинет для по крайней мере 15 минут, а затем спрей поверхностей раствором отбеливателя 10%. Разрешить отбеливатель решение сидеть за 15 мин, протрите кабинета и включите воздуха перед использованием.
  3. Радиоактивные третируют [3H]-тимидина (тритий) процедуры и безопасности
    Примечание: Трития является радиоактивный источник категории 5, «наиболее вряд ли может быть опасно» Категория. Руководящим учреждением для работы с радиоактивностью. Некоторые учреждения могут требовать сертификаты или позволяет обрабатывать трития.
    1. Обучение от учреждения о том, как правильно обрабатывать и распоряжаться трития. Утилизация радиоактивных отходов в сосудов, по данным Института политики. Носите СИЗ при работе с тритием.

2. нейронной индукции от iPSCs

Примечание: Чтобы НИПы, затем слегка модифицированную версию протокола, который сопровождает коммерчески доступных нейронной индукции комплект. Комплект состоит из Neurobasal (NB) средства массовой информации и 50 x нейронной индукции дополнение (НИС), который используется для изготовления 1 x нейронной индукции среднего (NIM). Чтобы сделать 100% также используется NIS расширения среды (см. раздел 3.1). Ссылка на протокол находится в материалы и оборудование и ссылки на раздел43.

  1. Прохождение iPSCs, когда они становятся 70-80% притока.
  2. Плита 300 000 iPSCs в 1 хорошо квалифицированных Госкомсанэпиднадзором внеклеточная матрица имитируют гель (гель ECM-мнемосхемы) с покрытием 6-ну пластины, содержащий 2 мл с 5 мкм ингибитора рок фидер бесплатно iPSC среды. Инструкции по скважинам покрытие гелем ECM-имитировать смотрите раздел 3.2.
  3. Один день позже, удалите iPSC средний + ингибитор и мыть iPSCs рок с ПБС. Добавьте 2 мл NIM в iPSCs.
    Примечание: 50 мл NIM производится путем добавления 1 мл 50 x ННГ и 250 мкл (50 единиц/мл, 5 мкл/мл), пенициллин/стрептомицина (P/S) 49 мл NB средств массовой информации.
  4. Средства массовой информации изменения нейронной индукции каждые 2 дня, аспирационных провел средних и замене с 2 мл NIM до клетки становятся вырожденная (около 4-5 дней). Изменения средства массовой информации ежедневно, после того, как клетки вырожденная.
  5. Проход клетки после 7 дней в ним и пластины в ECM-имитировать гель с покрытием 6-ну пластины, содержащий 2 мл 100% расширения средств массовой информации и АБС битор рок 5 мкм. Клетки, считаются прохода 0 (P0) NPC на данный момент. Смотрите раздел 3.1 ниже инструкции сделать 100% расширения средств массовой информации.
  6. Проход клеток с использованием методов, описанных в разделе 3.4. Подождите, пока клетки достигли P2 и вырожденная до отделения пятно для маркеров NPC и покрытие для экспериментов (рис. 1).

3. Культура СМИ, покрытие и обслуживание РНУ

  1. Подготовка средств массовой информации для поддержания РНУ (100% расширения СМИ):
    1. Сделать 50 мл 100% расширения средств массовой информации путем объединения 24.5 мл DMEM/F12 с 24,5 мл NB.
    2. Добавьте 1 мл 50 x NIS в среде DMEM/F12 + NB решение. Добавьте 250 мкл раствора P/S в средствах массовой информации.
      Примечание: Средства массовой информации может быть охлажденных (4 ° C) и используется для до 2 недель. Меньшие объемы средств массовой информации могут быть сделаны корректировки объемов DMEM / F12 + NB + NIS с помощью же показатели, как объем 50 мл.
  2. Подготовка геля ECM-имитировать покрытием культуры пластин для обслуживания NPC
    1. Аликвота ECM-имитировать гель на тома, необходимо сделать 6 мл рабочего раствора. Вычислить аликвота тома, глядя на сертификат анализа листа, поскольку ECM-имитировать гель коэффициент разбавления меняется от партии к партии и много-много.
    2. Оттепель гель Алиготе ECM-имитировать на льду и растворяются в 6 мл холодной среде DMEM/F12 средств массовой информации.
    3. Добавьте 1 mL ECM-имитировать решения гелем/DMEM/F12 для каждой скважины 6 пластины хорошо. Инкубировать пластину 6-колодец с ECM-имитировать гель решение для 30 минут при 37 ° C.
    4. Аспирационная ECM-имитировать решения гелем после 30 минут инкубации и заменить 100% расширения СМИ или охладите пластины (4 ° C, до 1 недели) без аспирационных ECM-имитировать гель решение.
  3. Техническое обслуживание РНУ
    1. НИПы пластины на плотности 1,5 миллиона клеток в ECM-имитировать гель покрытием хорошо содержащие 2 мл 100% расширения средств массовой информации.
    2. Инкубируйте NPC при 37 ° C во влажной среде с 5% CO2.
    3. Добавьте 5 мкм ингибитора рок в СМИ для НПС на P3 или ниже, или талой NPC, чтобы предотвратить чрезмерное клеточной смерти. Изменить СМИ после 24 ч для удаления рок ингибитора.
    4. Клетки проход каждые 4-9 дней, в зависимости от когда они становятся вырожденная. Клетки, считаются вырожденная, когда они становятся плотно упакованных монослоя, охватывающих весь нижней поверхности блюдо.
    5. Пластина NPC на плотности 1 до 1,5 миллионов клеток на одной скважиной 6-ну плиты (см. раздел 3.4). Удаление отработанного СМИ каждые 48 ч и заменить 2 мл 100% расширения средств массовой информации.
  4. Поднять, разъединять и Пелле НПС для поддержания и/или покрытие для экспериментальных условий
    1. Аспирационная средний, вымыть клетки один раз с ПБС. Аспирационная PBS и добавьте 500 мкл раствора 1 x мобильный отряд в 1 хорошо вырожденная РНУ. инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
    2. Добавьте 500 мкл комнатной температуры (RT) PBS и мыть хорошо с помощью пипетки P-1000 обеспечить удаление клеток. Соберите клетки + решение PBS в 15 мл Конические трубки. Вымойте тарелку снова с 1 мл раствора PBS и добавить жидкость в трубе.
    3. Вращать клетки вниз на 300 g x 5 мин в гранулах.
    4. Удалить супернатант из клеток гранул и вновь приостановить клеток в 1-5 мл подогретым DMEM/F12 средств массовой информации. Разбавьте клетки к плотности 1 до 4 миллионов клеток/мл средств массовой информации. Подсчитать ячейки с помощью Горяева.
    5. Пластина необходимое количество клеток, специфические для обслуживания NPC (раздел 3.3) или отдельные проба проводится (см. Последующие разделы для получения более подробной информации).
    6. Отрегулируйте громкость подвеска клеток со средствами массовой информации так, что между 15 до 100 мкл ячеек используются для каждой скважины/блюдо. Этот небольшой обшивка объем гарантирует, что существует даже клеток распределения и не разбавленный факторы роста, наркотиков или подложек в среде.
    7. Инкубировать клетки при 37 ° C. Изменить СМИ каждые 48 ч, для поддержания NPC или увидеть конкретные детали для отдельных анализов.
  5. Средства массовой информации подготовка экспериментальных условий (30% расширения СМИ)
    1. Разбавить СМИ расширение 100% на 70% (называется 30% расширение), добавив 1:1 DMEM/F12 + NB решение сделать СМИ для экспериментальных условиях.
    2. Сделайте 20 мл 30% расширения СМИ, добавив 6 мл 100% расширения средств массовой информации и разбавления с 7 мл NB и 7 мл в среде DMEM/F12 средств массовой информации. Добавьте 5 мкл/мл раствора P/S.
      Примечание: Если 100% СМИ уже содержит P/S, затем добавить 5 мкл/мл на сочетании DMEM / F12 + NB = (14 мл) x (5 мкл/мл) = 70 мкл P/s вместо 100µL.
    3. В желаемой концентрации в 30% расширения СМИ добавьте покрытие подложек и факторы роста.

4. Оценка синтеза ДНК, S-фаза вход и число клеток РНУ

  1. Подготовка для синтеза ДНК, S-фаза вход и число Assay клетки
    1. Стоковый раствор 1 мг/мл поли D-лизина (PDL) в dH2O и стерилизовать фильтра. Разбавьте 1:10 в dH2O сделать 0,1 мг/мл раствора PDL и добавить 300 мкл в каждой скважине 24 хорошо плиты или 1 мл раствора для 35-мм блюдо. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
    2. Вымойте PDL Уэллс 3 раза за 5 мин с dH2O. аспирата dH2O и добавить 300 мкл/колодец или 1 мл/блюдо Ламинин (5 мкг/мл) разводят в 1 x PBS. Накладки с парафина и держать в стерильные, биобезопасности кабинета на ночь на RT (12-24 ч).
    3. Подготовка 30% расширения средств массовой информации (см. раздел 3.5) после 12 до 24 ч. добавить транспортные средства, факторы роста или наркотиков интерес в нужной концентрации в объемах, которые являются менее 10% всего решения, чтобы избежать разбавления NIS в 30% расширения среды.
    4. Мыть каждый хорошо из 24-ну пластины дважды с ПБС (5 мин). Аспирационная ПБС и добавьте 450 мкл СМИ (без или с наркотиками/роста факторов). Инкубируйте пластины при 37 ° C по меньшей мере 15 мин до гальванических клеток.
    5. Для каждого эксперимента установите вверх 2-3 скважины или блюд в условием.
    6. Пластина NPC (см. раздел 3.4):
    7. Assay синтеза ДНК NPC: 100000 клеток/колодец в 24 хорошо пластины
    8. S-фаза вход: 500000 клеток/35 мм блюдо
    9. Номер Assay клетки: 50,000 клетки/колодец в пластине 24-а
  2. Assay синтеза ДНК клетки нервной прекурсоров
    1. Пластина 100000 клеток/колодец в пластине 24-Ну и оценить в трех экземплярах/состояние.
    2. Добавить радиоактивных, третируют [3H]-тимидина к питательной среды (1,5 мкКи/мл) в каждый хорошо после 46 h в культуре. Инкубируйте клетки при 37 ° C на 2 ч.
      Примечание: При использовании радиоактивных материалов, проходят подготовку от учреждения, протоколы безопасности следуйте радиоактивности и утилизации радиоактивных материалов в отходах сосудов надлежащим образом назначенного.
    3. Удалите и надлежащим образом распоряжаться радиоактивных средств массовой информации после 2 ч. добавить 300 мкл предварительно разогретую 0,25% трипсина ЭДТА (0.5 мм) для каждой скважины и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C.
    4. Включите комбайн клеток (см. материалы и оборудование раздел) и насос и убедитесь, что давление насоса ниже 200 PSI. Фильтр бумага через пространство в ячейку комбайн и оторвать правом углу, чтобы отметить ориентацию бумаги.
    5. Место сбора трубок сотовый харвестерная в пустой «пустой» лоток и нажмите программ смачивать фильтровальной бумаги. Место сбора трубок в образце скважины и запустить (старт).
    6. По завершении сбора образцов клеток комбайн Поднимите зажим и предварительный фильтр бумага повторить для всех наборов образцов. Всегда prewash в пустой, «пустой» пластины.
    7. Высушить фильтровальную бумагу под источником света и настроить соответствующие флаконов в лоток. Выбивать Чадс бумаги в флаконах и добавить 2 мл ЖС коктейль для каждого флакона. Колпачок и label флаконов.
    8. Инкубируйте флаконов в ЖС коктейль для по крайней мере 1 час перед чтением отсчеты в минуту (СУВП) на машине сцинтилляции.
  3. NPC S-фаза вход Assay
    1. Смотрите раздел 3.4 шаги чтобы поднять, разъединять, окатышей и вновь приостановить клетки.
    2. Пластина 500 000 ячеек на блюдо в 35 мм блюд, приготовленных в разделе 4.1, только 1 блюдо/условие для этого шага.
    3. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 46 h.
    4. Подготовьте три тарелки 35 мм, покрытые PDL/Ламинин за состояние после 24 ч. Например, если существует одно блюдо 35 мм 30% расширения средств массовой информации и одно блюдо 35 мм 30% расширения СМИ + ФБП (10 нг/мл) затем пальто 6 PDL/Ламинин пластин для использования на следующий день.
    5. Добавьте 2 мкл/мл по 5 мм EdU культур после 46 h. инкубировать на 2 ч.
    6. Разъединять и Пелле клетки (см. раздел 3.4). Вновь приостановите Пелле клеток в 3 мл 30% расширения средств массовой информации или 3 мл 30% расширения СМИ + желаемого роста факторы/наркотиков.
    7. Плита 1 мл на блюдо на предварительно покрытых PDL/Ламинин блюда. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте при 37 ° C за 2 ч до позволяют клеткам придерживаться блюдо. Смотрите Рисунок 2 для упрощенной шкалы.
  4. Вход S-фаза анализа
    1. Исправить блюда с ледяной 4% параформальдегида (ПФА в однократном ПБС) за 20 мин. Затем мыть посуду 3 раза за 5 мин с ПБС.
    2. Добавьте 1 mL 1 x PBS с 0,05% азид натрия для предотвращения роста бактерий и грибков. Клетки могут храниться при температуре 4 ° C на срок до 6 месяцев, если блюда (запечатанный с парафина) хранятся в PBS + натрия азид решение, хотя не все иммунологические антигены являются хорошо сохранившиеся после длительных задержек в анализе.
    3. Assay клетки, с помощью коммерческих реакции EdU комплекта (см. Протокол изготовителя). Пятно клеток с использованием DAPI или другой ядерной маркер и изображения с помощью микроскопии флуоресцирования.
    4. Определить долю EdU позитивных клеток более всего живой клетки (всего мобильный номер) слепых в 10 систематически случайных полей (10 x). Не включать в анализ мертвые клетки.
    5. Используйте этап контраст изображения и флуоресцентных изображений для определения положительный пятнать EdU и выяснить, какие клетки мертвы или жив (рис. 3).
    6. Граф все ячейки, которые имеют оба гладкой и даже клеточной мембраны в этап настройки контрастности и большое нефрагментированный ядро, флуоресцентный DAPI ядерной пятно, как эти клетки являются жить (Рисунок 3А-B).
    7. Исключить все ячейки, которые являются фазы яркий, сломанной неравномерным клеточной мембраны и маленький, конденсированной ядро как визуализированное DAPI флуоресцентных изображений, как эти клетки являются мертвых (Рисунок 3А-B). Оцените живой клетки для выражения EdU путем выявления клеток, которые имеют яркие флуоресцентные EdU пятно охватывающих весь ядро или пятнистым флуоресцентные пятнать в ядре (рис. 3 c).
  5. Номер Assay клетки NPC
    1. После 2 дней в культуре этикетки и подготовить 0,5 мл и 1,5 мл microcentrifuge труб microcentrifuge трубы. В каждом 0,5 мл трубки добавьте 5 мкл Трипановый синий.
    2. В каждую лунку 24 хорошо плиты удалите среднего и добавьте 200 мкл 1 x мобильный отряд решение и место в инкубаторе для 10-15 мин.
    3. После отведенное время после того, как клетки сняли, добавьте нужное количество ПБС в каждой скважине.
      Примечание: Как правило, на 2 день, добавьте 300 мкл ПБС хорошо содержащие клетки плюс 200 мкл раствора отряда, для общего объема 500 мкл. С дополнительной культуры время инкубации как клетки становятся более вырожденная, увеличьте объем разрежения в случае необходимости. К примеру на 4 день, добавить 500 мкл 1 x PBS и на 6 день, добавить 800 мкл ПБС. Всего тома будет 700 мкл и 1 мл, соответственно.
    4. С помощью пипетки P-1000, Пипетка вверх и вниз в каждом хорошо 4-5 раз для удаления клеток. Изучите пластину под микроскопом, чтобы обеспечить, что все клетки отдельный. Клетки перехода для 1.5 мл пробирок.
    5. Инвертируйте 1.5 мл пробирок с разбавленным клетки 2-3 раза. Затем возьмите 50 мкл аликвота клеток от середины трубы и добавить 0,5 мл пробирок с Трипановый синий (см. 4.5.1).
    6. Пипеткой раствор клеток вверх и вниз 2-3 раза. Добавление ячеек в Горяева и анализировать сразу. Ждать больше 10 мин может увеличить клеточной гибели или наличие клеток, которые заняли Трипановый синий.
    7. Тщательно мкл 10 клеток + Трипановый синий смеси для каждой стороны Горяева для выполнения репликации графов. Подсчет количества ячеек с помощью контраста микроскоп этапа. Не рассчитывать отмершие клетки или темно синие клетки, которые заняли Трипановый синий.
    8. Для получения общей ячейки номер, использовать средний мобильный номер отсчитывается от 4 углов Горяева и применить следующее уравнение:
      Означают номер ячейки x СМИ объем (мл) x 10,000 = ячейке номер/а
    9. Аспирационная и повторите процедуру на оставшихся скважинах. Измените СМИ на клетки, которые не засчитываются, пробирного повторять каждые 48 ч. на 4 дней и 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Подготовка блюда и СМИ для Neurite Assay
    1. Стоковый раствор 1 мг/мл поли d-лизина (PDL) в dH2O и стерилизовать фильтра. Разбавьте 1:10 в dH2O сделать 0,1 мг/мл раствора PDL и добавьте 1 mL к каждому блюду 35-мм. Проинкубируйте втечение 20 мин на RT.
    2. В то же время готовить 30% расширения средств массовой информации (см. раздел 3.5) и добавить 5 мкг/мл (5 мкл/мл) раствора фибронектина (1 мг/мл бульона) в средствах массовой информации.
    3. После того, как средства массовой информации готовится, добавьте транспортные средства, факторы роста или наркотиков интереса в желаемой концентрации.
      Примечание: Это лучше добавить транспортное средство, факторы роста или наркотиков, в тома < 10% всего решения, чтобы избежать разбавления фибронектина и других компонентов в средстве расширения 30%.
    4. После 20 минут мыть посуду PDL 3 раза за 5 мин с dH2O для удаления избыточных PDL. Убедитесь, что блюда сухой перед добавлением средств массовой информации.
    5. Место 1 мл СМИ (с или без лекарств/роста факторов) + фибронектин решение в каждом PDL покрытием блюдо.
    6. Инкубируйте блюд при 37 ° C для по крайней мере 30 минут до гальванических клеток для обеспечения надлежащего крепления фибронектин к PDL.
    7. Для каждого эксперимента установите вверх 2-3 блюда за состояния (например, 3 автомобиля содержащих, блюда 3 наркотиков содержащих).
  2. Покрытие для Neurite Assay РНУ
    1. Смотрите раздел 3.4 для шагов поднять, разъединять, окатышей и Ресуспензируйте клетки.
    2. Пластина 50 000 ячеек на блюдо в блюда, приготовленные в разделе 5.1. Агитируйте блюда взад и вперед во всех направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток.
    3. Инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 48 часов.
  3. Анализ плекситы
    1. После инкубации клеток для 48 ч, аспирационная среднего и исправить блюда с лед холодной 4% PFA для 20 мин.
    2. После 20 минут мыть посуду 3 раза за 5 мин с ПБС. После окончательной стирки, добавьте 1 mL 1 x PBS с 0,05% азид натрия.
    3. Анализируйте блюда слепо на этап микроскопа контраст на 32 X. Подсчет общей клетки и клетки с невритов 3, рядами 1 см, наугад, но воспроизводимые позиции. Граф минимум 150 ячеек на блюдо для обеспечения адекватного выборки.
      Примечание: Neurite определяется как расширение (процесс) из тела клетки, что является > 2 диаметров клетки тела в длину. Для ячеек с несколькими процессами длинный процесс считается для критерия. Клетки с процессами, которые являются < 2 клетки тела диаметром в длину, не включены (рис. 4).
    4. Сложите общее количество клеток и общее количество клеток с невритов в каждое блюдо. Вычислите % клеток с невритов. Средний процент клеток с невритов через репликацию блюда. Уверенность в экспериментальной воспроизводимость устанавливается, когда все строки в каждое блюдо похожи, и средние среди блюд очень похожи, с Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) < 10%.
    5. Кроме того, анализ невритов, проводя immunocytochemistry для маркеров, такие как бета III-тубулина (TUJ1) или MAP2. После окрашивания для маркера интерес, принять 10 систематически случайных изображений на флуоресцентный микроскоп 10 X. Изображения по крайней мере 200 клеток. В этом случае приобретать изображения не слишком близко к краю блюдо. Анализируйте процент клеток с TUJ1 или MAP2 + невритов (см. рис. 10 в качестве примера).

6. NPC нейросферы миграции Assay

  1. Формирование нейросфера
    1. Добавьте 1 mL 100% расширения средств массовой информации в 35-мм блюдо с не покрытие субстрата. Инкубируйте блюда по крайней мере 15 минут при 37 ° C, прежде чем покрытие РНУ. Подготовка 2-3 блюда для обеспечения будет достаточно neurospheres для миграции assay клетки.
      Примечание: Отсутствие покрытие субстрата гарантирует, что НПС по-прежнему приостановлено в средствах массовой информации, которая необходима для формирования нейросферы. Покрытие блюда будет предотвратить образование нейросферы.
    2. Смотрите раздел 3.4 на шаги, чтобы поднять, разъединять и Пелле клетки. Ресуспензируйте Пелле клетки в 2-5 мл подогретым 100% расширения средств массовой информации. Пластина 1 миллион НИПы в каждом 35-мм блюдо, приготовленное в разделе 6.1.1.
    3. Инкубируйте NPC при 37 ° C для 48-96 h позволять NPC агрегатных и формы neurospheres. Оцените размер сферы, с использованием живой правителя на микроскопе фазово контрастной. Ждать для большинства сфер для достижения приблизительный диаметр 100 мкм (± 20 мкм) (Рисунок 5). Меньших сфер будет полностью дисперсных и разбить во время миграции assay.
  2. Подготовка пластин для Assay переноса нейросфера
    1. Наплыв ECM-имитировать гель аликвоты (см. раздел 3.2) 6 мл 30% расширения средств массовой информации. После подготовки ECM-имитировать gel/30% расширения СМИ решения добавьте транспортных средств, факторы роста или наркотиков интересов в желаемой концентрации.
      Примечание: Транспортное средство, наркотиков и фактор роста концентрации необходимо увеличить до учетной записи для добавления 200 мкл neurospheres в разделе 6.3.
    2. Пластина 1 мл ECM-мнемосхемы гель решение расширения Media /30% (± транспортных средств, факторы роста или наркотики) в одну скважину 6-ну плиты. Сделайте 2-3 скважины в экспериментальной условие. Кроме того 35-мм блюда могут быть использованы. Инкубировать пластины для по крайней мере 30 минут при 37 ° C.
      Примечание: Не аспирационная ECM-имитировать gel/30% расширение медиа решения для этого анализа. Покрытие сферах на атмосферный ECM-имитировать гель приведет к быстрому и избыточной миграции.
  3. Покрытие Neurospheres
    1. Сбор neurospheres, образованная в разделе 6.1 и поместите их в коническую пробирку. Вымойте 35 мм, собранные блюда с 1 мл раствора 1 x PBS для обеспечения всех neurospheres. Спин вниз собранных neurospheres на 100 g x 5 мин.
    2. Вновь приостановить neurospheres в 1-3 мл подогретым 30% расширения средств массовой информации. Если собирается 1 блюдо neurospheres, 1 мл средства массовой информации используется для Ресуспензируйте сферах. Если собираются 2 блюда, 2 мл средства массовой информации добавляются Ресуспензируйте сферах, и т.д. Пипетка мягко и использовать только P-1000 чтобы убедиться, что сферы не сломаны.
    3. Плита 200 мкл ресуспензированы neurospheres в ECM-имитировать gel/30% решение расширения в разделе 6.2. Пластины рок во всех направлениях, чтобы равномерно распределить neurospheres. Инкубировать пластины для 48 ч при 37° C.
    4. Удалите расширение медиа-решение ECM-имитировать gel/30% и исправить клетки в 4% PFA, мыть и хранить клетки в 1 x PBS + 0,05% азид натрия.
  4. Анализ Neurospheres
    1. Получение изображений всей neurospheres с использованием фазы настройки контрастности 10 X. Убедитесь, что сферы не соприкасаются друг с другом. Измерить средний миграции с помощью программного обеспечения ImageJ.
    2. Отслеживать внешний контур нейросферы, используя средство произвольной линии. Произвольной линии можно, щелкнув правой кнопкой на значке «прямой». Вручную трассировку с помощью мыши.
    3. Используйте функцию измерения для вычисления области трассировки. Убедитесь, что «район» выбран как считывание в окне «Набор измерений», найти на вкладке анализировать. Рисунок 6 см для трассировки внешнего контура синим цветом.
    4. Трассировка внутренней клеточной массы области сферы и меры. Рисунок 6 см для трассировки внутреннего контура в красном. Подсчитать среднее миграции путем вычитания внутренней клеточной массы из области общей нейросферы.
    5. Neurospheres мера, который exhibit плотно упакованных внутренней клеточной массы с клетками, миграция как непрерывный ковер (рис. 6).
    6. Не включать клетки вне ковра или отделяться от нейросферы для измерения. Смотрите Рисунок 6 примеры (кружил в белом) клеток, которые исключены из измерения внешней ковер. Анализируйте как минимум 20 neurospheres для каждого условия.

Результаты

Одна из целей этих исследований является определение пролиферативной активности НПС, то есть, увеличение числа клеток. Это достигается путем оценки синтеза ДНК клеток всего населения, высок объём подход, который измеряет включение радиоактивных трассирующими третир...

Обсуждение

Здесь представлены протоколы свидетельствуют быстрые и простые методы для изучения фундаментальных неврологического процессов и тестирования факторы роста и наркотиков с использованием клеток hiPSC производные нейронных прекурсоров. hiPSC технология революционизировал изучение патог?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана губернатор Нью-Джерси Совета медицинских исследований и лечения аутизм (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Нэнси Lurie знаменует Фонд семьи, Mindworks благотворительный фонд свинца и еврейская община фонд более Метроуэст NJ.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 MediumThermoFischer Scientific12634-010Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103049Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified MatrigelCorning354277hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302ROCK inhibitor
6 well platesCorningCOR-3506Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well platesThermoFischer Scientific2021-05Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishesThermoFischer Scientific2021-01Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse LamininInvitrogen23017-015Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
FibronectinSigmaF1141Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-LysineSigmaP0899Substrate for coating plates
Penicillin/StreptomycinThermoFischer Scientific15140122Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X)Gibco15090-04610X enzymatic solution
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidinePerkinElmerNET027E001Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation VialsFisherbrand03-337-1Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counterBeckman Coulter8043-30-1194Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging KitThermoFisher ScientificC10337EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paperGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2Peprotech100-18Bgrowth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)BACHEMH-8430neuropeptide

Ссылки

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. . GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017)
  44. . Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133iPSCneurite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены