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要約

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC 発育に及ぼす関連成長因子と治療の評価ができます。

要約

一連の増殖、移行、および神経突起伸長; によって区別以前の段階で、正確に管弦楽に編曲されたプロセスを経て人間の脳の発達後の段階が軸索・樹状突起やシナプスの形成によって特徴付けられます。神経発達障害にしばしばこれらのプロセスの 1 つ以上が破壊され、脳の形成と機能の異常に 。ひと誘導多能性幹細胞 (こと) 技術の出現により、研究者は今ニューロンを含む、あらゆる細胞に分化できる細胞の豊富な供給を持っています。これらの細胞は、通常の脳の発達と病気の発症を検討する使用ことができます。末期神経病の使用をモデル化する hiPSCs を使用してプロトコル数区別ニューロンまたは使用 3次元培養システムと呼ぶ organoids。これらのメソッドは、人間の病気の病因を調査で非常に貴重な証明されている、いくつかの欠点があります。HiPSCs ニューロンへの分化とオルガノイドの生成は、実験と評価することができる変数の数に影響を与えることができる時間のかかる、高価なプロセスです。さらに、ポスト mitotic ニューロンと organoids 樹状突起やシナプス形成など、疾患に関連するプロセスの研究を許可する拡散と移行のような以前のプロセスの研究彼ら排除します。自閉症などの発達障害では、十分な遺伝学的および事後の証拠は初期発達過程における欠陥を示します。神経系前駆細胞 (Npc)、増殖性が高い細胞集団、個体発生のプロセスと病気発生について質問するための適切なモデルがあります。我々 は今、人間 Npc をマウスおよびラットの皮質の文化の開発を勉強から学んだ方法論を拡張します。Npc の使用は、私たち病気に関連した表現を調査し、わずか数日で増殖、移行、および分化を含むどのように異なる変数 (例えば、成長因子、薬物) 影響発達プロセスを定義することができます。最終的には、病気特有のメカニズムと神経発達障害における表現型を識別するために、再現性と高スループット方法でこのツールセットを使用できます。

概要

単純な生物とマウス モデルの使用は、基本的な脳の発達と病気の発症のメカニズムを解明しました。これらの進歩にもかかわらず多くの神経疾患の病因は、単純な生物でないすべての調査結果がヒトの疾患の複雑な側面に直接関連するのでとらえどころのないままです。さらに、複雑な人間の脳はしばしばモデル発達困難し、動物の疾患します。進化とひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の技術の進歩で、体細胞は幹細胞に再プログラム、人間の病気を研究する神経細胞に分化できます。(ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス) hiPSCs と「弔」技術進歩は、人間の脳の発達の理解に革命を約束します。これらの技術今可能する「精密医療」アプローチ ケースバイ ケースに基づいて精神神経疾患評価に。

による疾患モデリング] フィールドに現在の主食は、単分子膜の特定の神経細胞に細胞を区別するためにまたは脳開発1、2の面を要約する、organoid と呼ばれる 3次元培養システムを使用するには 3。これらのシステムは、非常に貴重な勉強と人間の発達と病気4,5,6、7のユニークな側面の覆いを取るされています。ただし、培養神経細胞およびオルガノイドしばしば必要どこでも数週間から文化ヶ月勉強する準備ができている前に。これらのプロトコルおよびこれらの文化のシステムは多くの場合実行できる実験の数とテストすることができます (成長因子や薬物) のような変数の数を制限を維持するために必要なリソースの量の時間がかかる性質。また、ポスト mitotic ニューロンとオルガノイドを利用した多くの研究は、樹状突起やシナプス形成などの開発で後で発生するプロセスに焦点を当てています。これらのプロセスは、自閉症や統合失調症などの発達障害の病理に関与している中、決定的な神経分化する前に発生する発達イベント前、にとっても重要病因8 ,9,10、11,12,13。確かに、最近のゲノム研究は増殖、プロセスの副産物と移行で構成されます - 胎児の期間は自閉症病因11,14で特に重要であるを示す.したがって、神経幹・前駆細胞集団これら以前のプロセスを理解するを検討することが重要です。Organoid システムは、人間の脳の開発のより良い考えを要約を自分の 3 D 自然と組織構造のため、これらの以前のイベントのいくつかの研究に利用されている前駆プール含みます。しかし、オルガノイドの前駆細胞の人口は疎頻繁、神経幹や前駆細胞5,15よりも放射状グリア細胞のましょう。したがって、積極的に増殖の細胞の神経発達の初期の段階を勉強する高スループット方法を持つことが有益ででしょう。

演習では、我々 はこと由来神経前駆細胞 (Npc) は増殖性が高い、増殖、細胞遊走などの神経発達のプロセスを研究する神経幹・前駆細胞の混合された人口を使用してプロトコルを作成していると初期過程 (突起) の拡張機能です。これらの試金は正常ラットとマウス皮質文化16,17,18,19,20、神経発達を研究する何十年も私たちの研究室で使用される技術から開発されました。 21,22,23。重要なは、それも表現型およびラットおよびマウスの培養システムで定義されている規制信号がアクティブある生体内で、これらのテクニックの16,の値を示すメカニズムの有力な予測が示された17,18,19,24。Npc に hiPSCs の初期分化後これらのメソッドにより数日のうちで重要な発達過程を研究することであります。これらのメソッドは、多くの利点を持っている: (1) 彼らは、少し高度な機器を必要と簡単に実装できる、結果、および (3) の再現性の迅速な確認を可能にする時間の短い期間で実験 (2) 多数のレプリケートを行うことが迅速かつ低コストでコーティング行列、成長因子の影響、薬の活動など文化変数をテストできます。さらに、我々 は多様な発達過程の重要な調節因子として細胞の成長因子の役割を確立の活用します。Npc が直接増殖、神経突起の伸長と細胞移動のようなイベントを刺激し、彼らは制御条件19で明白ではない欠陥を発見する能力を高めるために発見した発達の信号を選択にさらされました。,25,26,27,28します。 同様に、薬の評価のしやすさは様々 な治療上の介在の有効性をテストする精密医学技術を採用する強力な道を提供します。したがって、このプロトコルは高スループット、再現性、および初期の脳の発達、病気の発症や神経発達学的表現型の増殖因子と薬の潜在的な有益な効果を勉強する簡単な方法を促進します。

プロトコル

1. 安全手順と安全キャビネットのメンテナンス

  1. バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 安全手順
    1. BSL 2 材料での作業で機関のガイドラインに従ってください。金融機関のプラクティスに従って BSL 2 材料の処分します。部屋および BSL 2 材料に使用される装置を示します。すべて個人保護用具 (PPE)、白衣、手袋などを着用してください。
  2. 安全キャビネットのメンテナンス
    1. BSL 2 レベルの材料の使用が認定されて安全キャビネットを使用します。
    2. 少なくとも 15 分間、キャビネット、バイオ セーフティにおける紫外光を有効におよび 10% の漂白剤溶液で表面をスプレーします。15 分間座っているし、キャビネットを拭いて使用前に空気の流れをオンに漂白剤の解決を許可します。
  3. 放射性トリチウム [3H]-チミジン (トリチウム) 安全手順
    注: トリチウムは、カテゴリ 5 の放射性ソース、'最も危険なことに低い' カテゴリー。放射能を扱うための機関のガイドラインに従ってください。いくつかの機関の認定またはトリチウムを処理することができます。
    1. 正しく処理し、トリチウムの処分方法の機関から訓練を受けます。金融機関のポリシーに従って適切な容器の放射性廃棄物の処分します。トリチウムを使用するときは、PPE を着用します。

2. Ips からの神経誘導

注: Npc をするためには、市販の神経誘導キットに付属するプロトコルのわずかに変更されたバージョンが続いていた。キットは、Neurobasal (NB) メディアと神経誘導培地 (NIM) x 1 を行うための神経誘導サプリメント (NIS) x 50 で構成されています。NIS は 100% を確認する使用されても拡張中 (3.1 節参照)。材料、機器、参照セクション43にプロトコルへのリンクがあります。

  1. 70-80% の合流になるときは、Ips を通過。
  2. HESC 修飾の 1 プレート 300,000 Ips 細胞外マトリックス模倣 ROCK 阻害剤の 5 μ M と iPSC のフィーダー無料媒体の 2 mL を含むゲル (ECM 模倣ゲル) コーティング 6 ウェル プレート。ECM 模倣ゲルでコーティング井戸については、セクション 3.2 を参照してください。
  3. 1 日後、iPSC ミディアム + 1x PBS で 1 回岩阻害剤および洗浄 Ips を削除します。Ips に NIM の 2 mL を追加します。
    注: ニムの 50 mL は NB メディア 49 mL に NIS とペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) の 250 μ L (50 単位/mL、5 μ L/) x 50 の 1 mL を追加することによって行われます。
  4. 神経誘導吸引で 2 日ごとの変化メディアは、コンフルエントになる細胞 (約 4-5 日) まで中小 2 ml の NIM の交換を過ごした。セルが合流したら、毎日メディアを変更します。
  5. ニムと ECM 模倣ゲルにプレートで 7 日後に通過細胞被覆 6 ウェル プレート 2 mL 100% 拡張メディアと 5 μ M ROCK 阻害剤を含みます。セルは 0 (P0) の通路にある Npc をこの時点で。100% 拡張メディアを作る指示の下セクション 3.1 を参照してください。
  6. セクション 3.4 で説明する方法を使用して通路セル。セルが P2 に達している NPC マーカーと実験 (図 1) のメッキのステインに解離する前に合流がまで待ちます。

3. Npc のメンテナンス、コーティング、文化メディア

  1. Npc (100% 拡張メディア) の維持のためのメディアの準備:
    1. 注意の 24.5 ml 24.5 mL DMEM/f12 キーを組み合わせることで 100% 拡張メディアの 50 mL を作る
    2. 50 x NIS の 1 mL を DMEM/f12 キー + NB ソリューションに追加します。P/秒ソリューションの 250 μ L をメディアに追加します。
      注: メディア冷蔵 (4 ° C) をすることができます、2 週間使用します。小さいボリュームのメディアは DMEM のボリュームを調整することによって行うことができます/f12 キー + NB + NIS 量は 50 mL の同じ比率を使用して。
  2. ECM 模倣ゲルの調製培養皿をコーティングした NPC のメンテナンスのため
    1. 実用的なソリューションの 6 mL を作るために必要なボリュームで割り切れる ECM 模倣ゲル。ECM 模倣ゲル希釈倍率から分析証明書シートを見て因数のボリューム変化バッチからバッチ、ロットごとに計算します。
    2. 氷の上の ECM 模倣ゲル因数を解凍し、冷たい DMEM/F12 メディアの 6 mL に溶かします。
    3. 6 ウェル プレートの各ウェルに ECM 模倣ゲル/DMEM/F12 溶液 1 mL を追加します。37 ° C で 30 分間 ECM 模倣ゲル溶液 6 ウェル プレートを孵化させなさい
    4. インキュベーションの 30 分後 ECM 模倣ゲル溶液を吸引し 100% 拡張メディア置き換えますまたはプレートを冷蔵 (4 ° C、1 週間) ECM 模倣ゲル溶液を吸引せず。
  3. Npc のメンテナンス
    1. ECM 模倣のゲル被覆も含む 100% 増殖培地 2 mL に 150 万セルの密度でプレート Npc。
    2. 37 ° c 5% CO2と湿った環境で Npc を孵化させなさい。
    3. Npc の P3 または下、または過剰な細胞死を防ぐために、解凍の Npc、ROCK 阻害剤の 5 μ M をメディアに追加します。ROCK 阻害剤を削除する 24 h 後に、メディアを変更します。
    4. 通路細胞合流なったらによってすべての 4-9 日。皿の表面の全体の底面を覆っている密集単分子膜になるとき、合流のセルと見なされます。
    5. 6 ウェル プレートのウェル 1 個あたり 1 に 150 万セルの密度で Npc をプレート (セクション 3.4 を参照)。使用済みメディアごとの 48 h を削除し、100% 増殖培地 2 mL に置き換えます。
  4. リフト、分離してメンテナンスやめっきの実験条件の Npc をペレット
    1. 1x PBS で 1 回の中、洗浄細胞を吸引します。PBS を吸引し、37 ° C で 10 分間合流 Npc。 加温の 1 に 1 x 細胞剥離液 500 μ L を追加
    2. 室温 (RT) PBS の 500 μ L を追加し、よくピペットを使用して P-1000 細胞の除去を確実に洗浄します。15 mL の円錐管に PBS ソリューション + 細胞を収集します。1 mL の PBS を再度洗浄し、液をチューブに追加します。
    3. ペレットに 5 分間、300 x g でセルを回しなさい。
    4. 細胞ペレットから上澄みを削除し、再に予め温めておいた DMEM/F12 メディアの 1-5 mL のセルを中断します。メディアの 1 に 400 万セル/ml の密度に細胞を希釈します。診断を使用してセルを定量化します。
    5. 板細胞、NPC メンテナンス (セクション 3.3) または (詳細については、以降のセクションを参照) が行われている個々 のアッセイのために特定の必要な数。
    6. 細胞の 15 に 100 μ L の間ごとの井戸/料理が使用されるように、メディアに細胞懸濁液容積を調整します。この小さなめっきボリューム確実にも細胞の分布があることと、成長因子、薬、または、中の基板が希釈されていませんが。
    7. 37 ° C でセルを孵化させなさいメディア NPC メンテナンスのためすべての 48 時間を変更したり、個々 の試金のための特定の詳細を参照してください。
  5. 実験条件 (30% 拡張メディア) のためのメディアの準備
    1. 70% 100% 拡張メディアを希釈 (30% と呼ばれる拡張) メディア実験条件のために 1:1 DMEM/F12 + NB ソリューションを追加することによって。
    2. 100% 拡張メディアの 6 mL を追加して 7 mL NB、DMEM/F12 メディア 7 mL で希釈 20 mL 30% 拡張メディアを作る。P/S 溶液 5 μ L/mL を追加します。
      注: 100% メディアは、P/S を既に存在する場合、追加結合 DMEM の 5 μ L/mL/f12 キー + NB (14 mL) = (5 μ L/mL) x = 100µL の代わりに P/S の 70 μ L。
    3. 30% 拡張メディアに必要な濃度でコーティング基板と成長因子を追加します。

4. DNA 合成、S 期エントリと Npc の携帯電話番号を評価します。

  1. DNA 合成、S 期エントリ、セル番号の試金のための準備
    1. DH2O でポリ-D-リジン (PDL) の 1 mg/mL の原液を行い、フィルター殺菌します。希釈 1:10 dH2O PDL ソリューションの 0.1 mg/mL を行い、各 24 well プレートまたは 35 mm ディッシュに 1 mL を 300 μ L を追加します。室温 20 分間インキュベートします。
    2. 3 回 dH2O. 吸引 dH2O 分の PDL 井戸を洗浄し、300 μ L/ウェルまたは 1 mL/皿ラミニン (5 μ g/mL) 1x PBS で希釈したを追加します。パラフィルムでプレートをカバーして、滅菌、バイオ セーフティにおける RT (12 ~ 24 時間) で一晩キャビネット。
    3. 12 に 24 h. 追加車両、成長因子、または 30% で NIS を希釈を避けるためにソリューション全体の 10% 未満にあるボリュームで必要な濃度で興味の薬剤の後 30% 拡張メディア (セクション 3.5 を参照) を準備拡大中。
    4. それぞれを洗う 1 × PBS (5 分) で 2 回 24 ウェル プレートのも。1x PBS を吸引し、メディア (なしまたは薬/成長因子) の 450 μ L を追加します。細胞をメッキする前に少なくとも 15 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
    5. 各実験 2-3 井戸または料理 1 つの条件を設定します。
    6. プレートの Npc (セクション 3.4 を参照):
    7. NPC DNA 合成試金: 100,000 細胞/ウェル 24 well プレートに
    8. S 期のエントリ: 500,000 セル/35 mm ディッシュ
    9. 細胞/ウェル 24 ウェル プレートでのセル番号の試金: 50,000
  2. 神経系前駆細胞 DNA 合成試験
    1. 24 ウェル プレートで 100,000 細胞/ウェルをプレートし、3 通/状態で評価します。
    2. 追加、放射性トリチウム [3H]-チミジン培 (1.5 μCi/mL) 各文化で 46 時間後にします。2 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
      注: 放射性物質を使用している場合は、あなたの機関、フォロー放射能安全プロトコル、および適切に指定廃棄物の容器の放射性物質の処分から訓練を受けます。
    3. 削除して正しく各ウェルに 2 h. 追加 300 μ L の 0.25% トリプシン-EDTA (0.5 mM) で加温後放射性メディアの処分し、37 ° C で 20 分間インキュベート
    4. セル収穫機をオンに (材料および装置を参照してくださいセクション) とポンプおよびポンプの圧力が 200 PSI 以下を確認します。セル収穫機で宇宙空間をろ紙を置き、用紙の向きをマークする右をはがします。
    5. 空の「空白」トレイにセル ハーベスタの収集の管を置き、フィルター ペーパーを湿らせて prewash を押します。サンプル井戸に収集の管を置き、(開始) を実行します。
    6. セル ハーベスタのサンプルの収集が終了している場合、すべてのサンプル セットを繰り返すクランプと事前のフィルター ペーパーを持ち上げます。常に「空白」板の空、prewash します。
    7. 光源の下でろ紙を乾燥し、トレイに対応するバイアルを設定します。瓶に紙 chads はパンチアウトし、液体シンチレーション カクテルの 2 mL を各バイアルに追加します。キャップとラベルの瓶。
    8. 液体のシンチレーション シンチレーション マシン上 (インプレッション単価) 1 分あたりカウントを読む前に、少なくとも 1 時間のためのカクテルでバイアルを孵化させなさい。
  3. NPC S 期エントリ アッセイ
    1. リフト、分離、ペレット、細胞を再停止する手順のセクション 3.4 を参照してください。
    2. セクション 4.1 では、この手順のみ 1 皿/条件の 35 mm 料理に皿あたりの 500,000 の細胞をプレートします。
    3. 細胞の均一な配分を確保するためのすべての方向で、前後の料理を揺り動かしなさい。46 h 37 ° C でセルを孵化させなさい。
    4. 24 h 後条件ごとに PDL/ラミニンとコーティングされた 3 つの 35 mm プレートを準備します。たとえば、30% 拡張メディアの 1 つの 35 mm ディッシュと 30% 拡張メディア + FGF の 1 つの 35 mm ディッシュがある (10 ng/mL)、次の日に使用するため 6 PDL/ラミニン プレートをコートします。
    5. 46 h. 加温 2 時間後の文化に 2 μ L/5 mM エドゥの mL を追加します。
    6. 切り離して、ペレット セル (セクション 3.4 を参照)。再増殖培地 30% または 30% 拡張メディア + 希望成長因子/薬 3 mL 3 mL の細胞ペレットを中断します。
    7. プレコート PDL/ラミニン料理の皿あたり 1 mL のプレート。細胞の均一な配分を確保するためのすべての方向で、前後の料理を揺り動かしなさい。シャーレに付着する細胞を許可するように 2 h の 37 ° C で孵化させなさい。簡略化されたタイムラインは、図 2を参照してください。
  4. S 期エントリの分析
    1. 冷えた 4% と料理を修正パラホルムアルデヒド (PFA 1x PBS で) 20 分。1x PBS で 5 分間 3 回皿を洗います。
    2. 0.05 %1 × PBS の 1 mL を追加し細菌や真菌の増殖を防ぐためにアジ化ナトリウム。細胞保存できる 4 ° C で最大 6 ヶ月料理 (パラフィルムでシール) が PBS + ナトリウムの場合アジ化ソリューションでは、しかしないすべて免疫学的抗原がよく保存された解析に長時間の遅延の後。
    3. 商業エドゥ反応を用いた細胞アッセイ キット (製造元のプロトコルを見なさい)。DAPI または別の核マーカーを使用して細胞を染色し、蛍光顕微鏡を用いた画像します。
    4. 10 体系的にランダム フィールド (10 倍) の総生きているセル (細胞数) ブラインドでエドゥ陽性細胞の割合を評価します。分析では、死んだ細胞を含めないでください。
    5. 位相コントラスト画像、蛍光画像エドゥ染色陽性を確認して、細胞は死んでいるを確かめることや生きている (図 3) の両方を利用します。
    6. 両方を滑らかに持っているすべてのセルのカウントとも位相コントラスト設定で細胞膜と核蛍光 DAPI による大規模な断片化核染色、これらの細胞 (図 3 aB) に住んでいると。
    7. 明るい段階のすべてのセルを除外する、壊れた不均一な細胞膜 DAPI 蛍光イメージング、これらの細胞は死んでいる (図 3 aB) による可視化小型、凝縮核があります。明るい蛍光エドゥ カバー全体の核や核 (図 3) まだら蛍光染色の染色があるセルを識別する、エドゥの表現のための生きているセルを評価します。
  5. NPC 細胞数測定
    1. 2 日間培養後にラベルを付けるし、1.5 mL マイクロ遠心チューブ用、0.5 mL 遠心チューブを用意します。各 0.5 mL チューブでトリパン ブルーの 5 μ L を追加します。
    2. 24 well プレートの各ウェル、培地を取り除き、10 〜 15 分のためのインキュベーターで x 細胞剥離液と場所 1 の 200 μ L を追加します。
    3. 割り当てられた時間後セルが持ち上げた後は、各ウェルに 1x PBS の希望の金額を追加します。
      注: 通常は、2 日目、300 μ L を追加 1 × PBS のも含むセル プラス 500 μ L の総ボリュームの剥離溶液 200 μ L を。追加のカルチャの培養時間、細胞がより合流になるは、必要に応じて希釈ボリュームを上げます。たとえば、4 日目に 500 μ L の PBS、x と 6 日目の 1 を追加、1 × PBS の 800 μ L を追加します。総量 700 μ L となります 1 mL、それぞれ。
    4. P-1000 ピペットを使用して、ピペット、上下各も 4 〜 5 回セルを削除するのに。すべてのセルが切り離されることを確認するには顕微鏡の下でプレートを確認します。1.5 mL チューブに細胞を転送します。
    5. 2 倍から 3 倍希釈した細胞と 1.5 mL チューブを反転します。管の中から細胞の分注 50 μ L を取るし、トリパン ブルーで 0.5 mL チューブに追加 (4.5.1 参照)。
    6. 上下に 2 〜 3 回ピペット携帯ソリューション。検定にセルを追加し、すぐに分析します。10 分は細胞死や細胞はトリパン ブルーを取り上げているの存在を高める可能性がありますよりも長く待っています。
    7. 慎重にレプリケート カウントを実行する検定の両側に 10 μ L のセル + トリパン ブルーの混合物を追加します。位相差顕微鏡を使用してセルをカウントします。死んだ細胞やトリパン ブルーを取り上げている暗い青色のセルはカウントしません。
    8. 平均総細胞数、使用を取得するには、細胞数は、検定の 4 コーナーからカウントされ、次の方程式を適用します。
      メディア ボリューム (mL) x 10,000 × セル数を意味 = 総細胞数/ウェル
    9. 吸引し、残りの井戸で手順を繰り返します。カウントされていない、4 日間のすべての 48 h. 繰り返しアッセイ & 6 セル上のメディアを変更します。

5. NPC 突起アッセイ

  1. 神経突起の試金のための料理とメディアの準備
    1. DH2O でポリ-d-リジン (PDL) の 1 mg/mL の原液を行い、フィルター殺菌します。希釈 1:10 dH2O 0.1 mg/mL の PDL 溶液 1 mL を各 35 mm ディッシュに追加します。室温 20 分間インキュベートします。
    2. 一方で、30% 拡張メディア (セクション 3.5 を参照) を準備し、フィブロネクチン溶液 (1 mg/mL 在庫) の 5 μ g/mL (5 μ L/mL) をメディアに追加します。
    3. メディアを準備すると、必要な濃度で車、成長因子、または関心の薬を追加します。
      注: それは最高のボリュームで車両、成長因子、または薬を追加する < 10%、フィブロネクチンと 30% 拡大中の他のコンポーネントを希釈することを避けるために、トータル ・ ソリューション。
    4. 20 分後に、3 回 dH2O 過剰歯根膜を削除すると 5 分のため PDL 皿を洗います。メディアを追加する前に乾燥している料理を確認します。
    5. 各 PDL コーティング皿にメディア (薬/成長因子の有無にかかわらず) + フィブロネクチン液の 1 mL を配置します。
    6. PDL にはフィブロネクチンの適切な添付ファイルを確保するため細胞をメッキする前に少なくとも 30 分の 37 ° C で料理を孵化させなさい。
    7. 各実験条件 (例えば、3 車を含む料理、3 薬剤を含む料理) あたり 2-3 料理を設定します。
  2. 神経突起の試金のための Npc をめっき
    1. 持ち上げ、分離、ペレット、細胞を再懸濁します手順のセクション 3.4 を参照してください。
    2. セクション 5.1 での料理に皿あたりプレート 50,000 セルです。細胞の均一な配分を確保するためのすべての方向で、前後の料理を揺り動かしなさい。
    3. 48 h の 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  3. 神経突起の解析
    1. 48 h のための細胞を培養後、培地を吸引し、冷たい 4% 氷で料理を修正 PFA 20 分。
    2. 20 分後、5 分 1 × PBS のための 3 回皿を洗います。最終的な洗浄後追加 1 mL の 1x PBS 0.05% アジ化ナトリウム。
    3. 32 X で位相差顕微鏡に盲目的に料理を分析します。総細胞と神経突起が、再現可能な位置はランダムに選択、3、1 cm 行のセルをカウントします。適切なサンプリングが確実に皿あたり 150 セルの最小値をカウントします。
      注: は、細胞体から拡張機能 (プロセス) としてその、神経突起の定義は > 2 の細胞体直径の長さ。複数のプロセスの細胞、最も長いプロセス基準のと見なされます。細胞のプロセスと < 2 細胞体直径の長さではない含まれる (図 4)。
    4. それぞれの料理のセルの合計数と神経突起と細胞の総数を一緒に追加します。神経突起と細胞の % を計算します。レプリケート料理に突起を持つ細胞の割合を平均します。各皿内のすべての行が同様に、皿の間で平均 (SEM) 平均値の標準誤差と、非常に類似するいると実験の再現性で信頼が確立される < 10%。
    5. また、ベータ版-III-チューブリン (TUJ1) のようなマーカーの免疫細胞化学を行うことにより神経突起を分析または MAP2。興味のマーカーの染色後、10 X 蛍光顕微鏡で 10 体系的にランダムな画像を撮影します。少なくとも 200 セルをイメージします。この場合、皿の端に余りに近くないの画像を取得します。TUJ1 または MAP2 + 神経突起 (例については図 10を参照) で細胞の割合を分析します。

6. NPC Neurosphere 移行アッセイ

  1. Neurosphere 形成
    1. コーティング基板と 35 mm ディッシュに 100% 拡張メディアの 1 つの mL を追加します。めっき Npc。 準備ことを確認して 2-3 料理がするに十分な神経幹細胞の細胞遊走アッセイによる料理 37 ° C で少なくとも 15 分間、インキュベートします。
      メモ: コーティング基板がない場合は、Npc が neurosphere 形成に必要なメディアで中断されて残ることを確認します。コーティング料理 neurosphere 形成を防止します。
    2. リフト、分離、および細胞のペレット手順セクション 3.4 を参照してください。予め温めておいた 100% の 2-5 mL の細胞ペレットを再懸濁します拡張メディア。セクション 6.1.1 で準備各 35 mm ディッシュにプレート 100 万 Npc。
    3. 骨材とフォームの神経幹細胞を Npc を許可する 48 に 96 h の 37 ° C で Npc を孵化させなさい。位相差顕微鏡でライブの定規を使用して球のサイズを評価します。100 μ m (± 20 μ m) のおおよその直径に到達するほとんどの球を待つ (図 5)。小さい球完全に分散、遊走試験中に分解します。
  2. Neurosphere 移行アッセイ用プレートの準備
    1. ECM 模倣ゲル因数 (セクション 3.2 を参照してください) を 30% 拡大メディアの 6 mL に溶解します。ECM 模倣 gel/30% 拡張メディア ソリューションを準備すると、必要な濃度で車、成長因子、または利益の薬を追加します。
      注: 自動車・医薬品・成長因子濃度アカウント セクション 6.3 で神経幹細胞を 200 μ l 添加の付加のために増加する必要があります。
    2. プレート ECM 模倣の 1 mL のゲル 6 ウェル プレートの 1 つのウェルに 30% 拡張メディア ソリューション (± 車、成長因子、または薬)。1 つの実験条件 2-3 井戸を作る。また、35 mm 料理を使用する可能性があります。37 ° C.で少なくとも 30 分の版を孵化させなさい
      注: は、ECM 模倣 gel/30% この試金のための拡張メディア ソリューションを吸い出してはいけない。吸気の ECM 模倣ジェルの上に球をめっきは、急速かつ過剰な移行に します。
  3. 神経幹細胞をめっき
    1. セクション 6.1 で形成された神経幹細胞を収集し、円錐管にそれらを置きます。1 ml の 1x PBS すべて神経幹細胞を確保するための料理を収集 35 mm を洗います。5 分間 100 x g で収集した神経幹細胞をスピンします。
    2. 予め温めておいた 30 %1 3 mL に、神経幹細胞を再停止拡張メディア。神経幹細胞の 1 皿を収集すると、メディアの 1 mL が球を再懸濁しますに使用されます。2 皿を集め、メディアの 2 mL が球を再懸濁しますに追加など優しくピペットし P-1000 にのみを使用して球が破られていないことを確認します。
    3. ECM 模倣 gel/30% セクション 6.2 で行われた拡張ソリューションに再懸濁細胞の 200 μ L をプレートします。神経幹細胞が均等にすべての方向のロック プレート。37° Cで 48 h 用の版を孵化させなさい
    4. ECM 模倣 gel/30% 拡張メディア ソリューションを削除し、4 %pfa、洗浄、1 × PBS + 0.05% で維持セルでセルを修正アジ化ナトリウム。
  4. 神経幹細胞の解析
    1. 10 X の位相コントラスト設定を使用して全体の神経幹細胞の画像を取得します。球がお互いに触れていないことを確認します。ImageJ ソフトウェアを使用して平均の移行を測定します。
    2. フリーハンド ツールを使用して neurosphere の外側輪郭線をトレースします。フリーハンドの線は、「直線」アイコンを右クリックしてアクセスできます。マウスを使用して手動でトレース。
    3. トレースの面積を計算するのにメジャーの関数を使用します。[分析] タブの下にある「設定測定」ウィンドウで読み出しとして「面積」が選択されているを確認します。ブルーの外側の輪郭のトレースは、図 6を参照してください。
    4. 球と測定領域の内部細胞塊をトレースします。赤で内側の輪郭線のトレースは、図 6を参照してください。合計 neurosphere 領域から内部細胞塊を引いて平均移行を定量化します。
    5. メジャー神経幹細胞は、細胞として連続したカーペット (図 6) を移行すると密集の内部細胞塊を展示します。
    6. カーペットの外または測定 neurosphere から切り離されたセルは含まれません。外側カーペット測定から除外されている (白枠) セルの例については、図 6を参照してください。最低条件ごとに 20 の神経幹細胞を分析します。

結果

これらの研究の 1 つの目標は、npc の細胞数の増加は、増殖活動を定義します。合計セル人口の細胞抽出液に放射性トレーサー トリチウム チミジンの取り込みを測定し、S 期に従事しているすべてのセルを反映しているかどうかは高スループット方法の DNA 合成を評価するこ5 分や 2 時間の全体の合成。さらに、これらの試金は S 相と総細胞数, 単一細胞のより労働集?...

ディスカッション

ここに示すプロトコルは基本的な神経発達のプロセスを研究し、成長因子と薬による由来神経前駆細胞を用いたテスト迅速かつ簡単な方法を示しています。による技術は、影響を受けた個人から人間の神経細胞をライブに前例のないアクセスをご提供する、神経疾患の病態に関する研究に革命をもたらしました。確かに、レット症候群、ティモシー症候群、脆弱 X 症候群を含む発達障害の多?...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

この作品は、医学研究と自閉症の治療 (CAUT13APS010; ニュージャージーの知事の評議会によって支えられました。CAUT14APL031;CAUT15APL041)、ナンシー Lurie マークの家族財団、Mindworks 慈善鉛信頼、および大きい MetroWest ニュージャージーのユダヤ人のコミュニティ基礎。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 MediumThermoFischer Scientific12634-010Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103049Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified MatrigelCorning354277hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302ROCK inhibitor
6 well platesCorningCOR-3506Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well platesThermoFischer Scientific2021-05Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishesThermoFischer Scientific2021-01Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse LamininInvitrogen23017-015Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
FibronectinSigmaF1141Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-LysineSigmaP0899Substrate for coating plates
Penicillin/StreptomycinThermoFischer Scientific15140122Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X)Gibco15090-04610X enzymatic solution
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidinePerkinElmerNET027E001Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation VialsFisherbrand03-337-1Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counterBeckman Coulter8043-30-1194Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging KitThermoFisher ScientificC10337EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paperGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2Peprotech100-18Bgrowth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38)BACHEMH-8430neuropeptide

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