JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم طريقة فعالة واستنساخه لعزل وثقافة الخلايا العصبية السلف من الأنسجة الجنينية والولادة في الدماغ إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من هستون 3 يسين 79 ديميثيليشن (H3K79me2)--علامة هيستون تقع داخل مجال كروي من هستون 3.

Abstract

نمو الدماغ هو عملية معقدة، التي يسيطر عليها التدرجات مورفوجينس والبرامج النسخي المختلفة بطريقة الصدغي مكانية. بالإضافة إلى ذلك، تعديلات جينية الكروماتين، مثل مثلايشن هستون، دوراً هاما لإنشاء والحفاظ على مصائر الخلية المحددة في إطار هذه العملية. تحدث الغالبية العظمى من هيستون مثلايشن على ذيل مرنة هستون، الذي الوصول إلى معدلات هستون، ومحايات والبروتينات هستون القارئ. وفي المقابل، مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3 والمتورطة في المهام الإنمائية المختلفة. مثلايشن H3K79 هي تقحم المصانة ويمكن أن تكون وجدت في طائفة واسعة من الأنواع من الإنسان العاقل إلى Saccharomyces cerevisiae. حدث التعديل في خلية مختلفة السكان داخل الكائنات الحية، بما في ذلك فروعه العصبية. موقع مثلايشن H3K79 في مجال كروي من هستون 3 يجعل من الصعب تقييم. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة القشرية السلف الخلايا (Cpc) من الأنسجة الجنينية الدماغ القشرية (E11.5-E14.5) أو فروعه الدماغ العصبية الحبيبية (كجنبس) من الأنسجة بعد الولادة (P5-P7)، وإلى كفاءة إيمونوبريسيبيتاتي H3K79me2 PCR الكمي (qPCR) وتسلسل الجينوم على نطاق المنظومة.

Introduction

الوظائف الحسية والحركية والإدراكية للدماغ معقدة للغاية وعرضه للتغيرات المادية والبيئية. يتكون الدماغ من ثلاثة أجزاء عامة هند-، منتصف، وفوريبرين، التي ترتبط عميق. ضمن forebrain، يمكن تقسيم تيلينسيفالون تيلينسيفالون الظهرية (DT) وتيلينسيفالون البطني (فاتو). DT الفئران يتكون من ست طبقات القشرية التي تتشكل بين E11.5 و E18.5 بطريقة "من الداخل إلى الخارج"1. ويشمل فاتو امينينسيس جانجليونيك في التنمية، التي تشكل في وقت لاحق2،ganglia القاعدية3. ويمكن تصنيف في الثدييات الجهاز العصبي المركزي مثل الخلايا العصبية، أستروسيتيس، أو أوليجوديندروسيتيس4، الذي وضع في طريقة الصدغي مكانية5العديد من أنواع الخلايا. أولاً، تثير الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) لأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، إينتيرنيورونس في فاتو، وإسقاط الخلايا العصبية في ديناراً، وفي وقت لاحق إلى الخلايا الدبقية (مثلاً، أستروسيتيس6). خلال التنمية القشرية، والطبقة الأكثر سطحية (طبقة أنا)، الذي يحتوي على خلايا ريتزيوس كيال، تتشكل أولاً. ثم، بين E12.5 و E14.5، تولد الشخصيات العصبية طبقات أعمق (الخامس والسادس) بينما بين 14.5 و 16.5، المتكفل تؤدي إلى الطبقة العليا (رابعا-ثانيا) من الخلايا العصبية7،8. يتم تحديد هوية الخلايا العصبية التي يسببها مورفوجين الصدغي المكانية النسخي البرامج المختلفة وبرامج جينية2بالإضافة إلى ذلك.

يقع في هيندبرين المخيخ، الذي تورط في التنسيق الحركي، وتطور بين E10 وتقريبا P20 في الفئران9. أنه يحتوي على قشرة الدماغ و نوى الدماغ10. قشرة الدماغ الكبار يتكون من ثلاث طبقات والطبقة الجزيئية الأبعد، طبقة خلايا بوركنجي والطبقة الحبيبية الأعمق التي تحتوي على الخلايا العصبية محبب10. الخلايا الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية أصغر وتمثل حوالي 80 في المائة من جميع الخلايا العصبية في الدماغ الفقاريات11. وضع من السلائف التي تقع في منطقة جيرمنال الخارجية والهجرة من خلال طبقة خلايا بوركنجي إلى تلك الوجهة12. مثل ينظم وضع المخيخ في telencephalon، مورفوجينس مهمة عدة، التي لها وظائف محددة الوقت والفضاء التابعة والشروع في تعريف برامج النسخي10.

يتم التحكم في وضع الطبقات القشرية والدماغ النسخي التعبير عن مورفوجينس محددة، ومن ثم الدولة الكروماتين للحمض النووي. في طريقة عرض مبسط، يمكن تقسيم الدول الكروماتين euchromatin كنشاط ترانسكريبتيونالي وهيتيروتشروماتين كمناطق صامتة ترانسكريبتيونالي. نوكليوسومي كوحدة أساسية من الكروماتين يحتوي على نسختين من كل هيستون الأساسية H2A، H2B و H3 و H4، محاطة بزوج قاعدي 147 من الحمض الخلوي الصبغي13. يتم تعديل هيستونيس عالية بوستترانسلاتيونالي مثلايشن acetylation، الفسفرة، أوبيكويتينيشن، سومويليشن، ريبوسيليشن ADP، deamination وبرولين isomerization14،15. يعتبر مثلايشن يسين هستون تعديل هيستون الأكثر استقرارا التي تتحكم في النسخ والنسخ المتماثل وممارسو16، تلف الحمض النووي استجابة17وطابعه الجينوم18. ويمكن ليسينيس مونو-دي-أو ثلاثي ميثليته19 وتظهر ليس فقط في ذيول هيستون موجوداً ولكن أيضا داخل نطاق كروي histones20. ميثيليشنز المحددة في H3K4 و H3K36 ترتبط أساسا يوتشروماتين، ميثيليشنز محددة في H3K9، أو H3K27، أو H4K20 توجد أساسا في مناطق heterochromatic، على الرغم من أن جميع مخلفات تقع داخل الذيل هيستون14، 19،21. مثلايشن H3K79 يقع ضمن مجال كروي هيستون وارتبطت بنشاط النسخي، بل أيضا مع مناطق الجينوم خاملة ترانسكريبتيونالي22. هي تقحم حفظت التعديل نظراً لأنه قد لوحظ في الخميرة والغدة الصعترية العجل والدجاج و الإنسان23. H3K79 مونو ودي تريميثيليشن (H3K79me1، me2، me3) هي تحفزها هيستون ميثيلترانسفيراسيس DOT1L24،25 و النووية مجموعة المجال التي تحتوي على بروتين 2 (Nsd2)26. DOT1L المتورطة في الانتشار وإصلاح الحمض النووي الخلوي ريبروجرامينج27. فقدان Dot1l في الفئران يؤدي إلى وفاة قبل الولادة حوالي28،E10.5 المرحلة الإنمائية29. أثناء تطوير القلب والتمايز ميوكارديوسيتي، DOT1L ضروري ل تنظيم التعبير الجيني30. في الجهاز العصبي المركزي، وقد تورط الدالة DOT1L في الأنبوب العصبي التنمية31، وهي تشارك في قمع Tbr1-التعبير خلال forebrain التنمية32، وقد تعمل في تنظيم ER-الإجهاد استجابة الجينات33. تعتمد على سياق تنشيط أو عمل تقطعون من H3K79me، لا سيما مع حالات في فيفو مثل تطوير الجهاز العصبي المركزي، التاريخ فقط يفهم جزئيا32. منذ مثلايشن H3K79 يقع في مجال كروي من هستون 3، أنها ستيريكالي الوصول إليها أقل بالمقارنة مع تعديلات في ذيول هيستون مرنة23. هناك حاجة لفهم وظيفة مثلايشن H3K79، أساليب تحليل موثوق واستنساخه لتحديد موقعها وبيئة الجينوم. نقدم في هذه الورقة، وأساليب طرق عزل مختلف فروعه العصبية (Cpc للقشرة) وكجنبس المخيخ والعلاج مثبطات DOT1L الفعال وأسلوب رقاقة لتحليل مثلايشن H3K79 عن طريق قبكر أو التسلسل في وقت مختلف النقاط خلال التنمية القشرية والدماغ. لإلقاء نظرة عامة على البروتوكول وإمكانياتها، انظر الشكل 1.

Protocol

وافقت لجان رعاية الحيوان من جامعة فرايبورغ والسلطات المحلية جميع التجارب الحيوانية (G12/13، G16/11) المشار إليها في البروتوكول التالية.

1-الأعمال التحضيرية

  1. الأعمال التحضيرية لعزل Cpc
    1. قم بإعداد فواصل التزاوج للحصول على الأجنة في مراحل مختلفة من التنمية اللحاء (بين E11.5 و E14.5). استخدام فئران سلالة الرنين (معهد البحوث الطبية البحرية) التي على الأقل 8 أسابيع من العمر. بعد التزاوج، تنظر سداده مهبلية إيجابية في E0.5.
    2. للحصول على ما يكفي من المواد، استخدام القمامة واحد من الفئران الرنين لرقاقة H3K79me2 واحد من كورتيسيس من E12.5 أو E14.5. بعد المراحل الجنينية، استخدام القمامة واحد لمزيد من التحليلات رقاقة (متوسط حجم القمامة الرنين: 10 أجنة).
    3. بريكول Hank´s متوازن الملح الحل (حبس) والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 4 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في RT).
    4. حجته 4 درجات مئوية المخزنة يدتا التربسين (0.05% w/v) إلى 37 درجة مئوية.
    5. تحضير الخلية القشرية متوسطة (CCM): تكملة المتوسطة للخلايا العصبية (انظر الجدول للمواد) مع التركيزات النهائية الملحق B-27 2% (v/v)، 5 ميكروغرام/مل ترانسفيرين Apo، 1 ميكروغرام/مل الجلوتاثيون، 0.5 مم L-الجلوتامين، الفاءق دسموتاز 0.8 ميكروغرام/مل و 1% (v/v) خليط المضادات الحيوية البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين. تخزينها في 4 درجات مئوية. للتجربة، حجته المتوسط إلى 37 درجة مئوية.
    6. ذوبان الجليد مصل العجل الجنين (FCS)، الكوة من (50 مل في كل)، وحجته قاسمة واحد إلى 37 درجة مئوية (التخزين الطويل الأجل في-20 درجة مئوية).
    7. إعداد مخزون من الدناز 1 (10 مغ/مل) في ح2س لثقافة الخلية. تخزين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    8. إذا لزم الأمر، حل مثبطات DOT1L محددة 5676 مناطق تجهيز الصادرات أو SGC0946 في [دمس] لتركيز أسهم من 100 ملم. يطبق بتركيز 1-5 ميكرومتر نهاية للخلايا في اليوم 0 وتطبيق المانع كل يومين.
    9. للحزب الشيوعي الصيني زراعة، معطف خلية ثقافة لوحات (بئر 6 أو 12 جيدا) مع هيدروبروميد بولي-L-ornithine (1 ملغ/مل في 150 مم الماء المقطر pH 8.4) على الأقل 1 ح في RT، وبعد ذلك مع laminin (1 ملغ/مل) في المتوسط CCM عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. الأعمال التحضيرية لعزل كجنب
    1. تنظيم التزاوج المناسب من الفئران لتوليد الحيوانات P5-P7 لعزل المخيخ (3-5 الحيوانات كل رقاقة والشرط).
    2. إعداد حبس/الجلوكوز عن طريق إضافة 6 مغ/مل الجلوكوز إلى حبس المخزن المؤقت.
    3. إعداد متوسطة الثقافة الخلية كجنب (الجمعية العمومية) بإضافة الملحق 1% (v/v) N2، 1% (v/v) البنسلين-ستربتوميسين-النيوميسين، 25 مم FCS بوكل و 10% دميم-F12. لزراعة كجنب إعداد متوسطة CGM دون FCS ولكن بما في ذلك 0.6 ميكروغرام/مل سونيك القنفذ (SHH) (CGM-SHH) وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
    4. معطف لوحات ثقافة الخلية 6-جيدا مع 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين ح 1-2 على RT لإزالة خلايا إطلاق. بعد ذلك يغسل مرتين مع ddH العقيمة2س واسمحوا لوحات الجاف. تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    5. لزراعة كجنبس معطف الخلية جيدا 6 لوحات الثقافة مع بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك يغسل مرتين مع ح2س لخلية ثقافة واسمحوا لوحات الجاف.
      ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات لمدة أسبوع واحد كحد أقصى عند 4 درجة مئوية.
    6. إعداد التربسين 0.025% (w/v) في حبس/الجلوكوز وحجته أنه إلى 37 درجة مئوية عند الحاجة.
  3. الأعمال التحضيرية لشريحة من H3K79me2
    1. إعداد منهاج عمل بيجين (1% في برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 8) طازجة قبل crosslinking الكروماتين. إعداد منهاج عمل بيجين الحرارة 50 مل برنامج تلفزيوني في الموجات الدقيقة إلى الحد الأقصى من 65 درجة مئوية. أثناء التحريك المستمر إضافة 0.5 ملغ منهاج عمل بيجين إلى برنامج تلفزيوني. قم بإضافة 50 ميليلتر 10 M هيدروكسيد الصوديوم وانتظر حتى يتم حل منهاج عمل بيجين. بعد ذلك، أضف ميليلتر 42.5 HCl (37% v/v) للحصول درجة وضه 8. التحقق من درجة الحموضة مرة أخرى والسماح ثم حل منهاج العمل 1% الوصول إلى الرايت
    2. إعداد الأرصدة رناسي (1 ملغ/مل) و "بروتيناز ك" (20 ميكروغرام/ميليلتر) بشكل منفصل في ddH العقيمة تخزين2سين مختبرين في-20 درجة مئوية.
    3. إعداد الكواشف والمخازن المؤقتة التالية: برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين، تحلل العازلة، جليكاين، المخزن المؤقت، وتمييع رقاقة رقاقة العازلة 2 والرقائق العازلة 3، المخزن المؤقت 1 والمخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتخزينها في 4 درجات مئوية. إعداد المخزن المؤقت شطف طازجة في كل مرة.
      1. إعداد برنامج تلفزيوني يتضمن 0.02 ٪ توين. متجر لمعظم أسبوعا واحداً في 4 درجات مئوية.
      2. إعداد تحلل المخزن المؤقت باستخدام 50 مم تريس على درجة الحموضة 8.0، 10 مم يدتا والصوديوم 1% (w/v) دوديسيل كبريتات (SDS) 1 × مثبطات البروتياز.
      3. إعداد جليكاين 2.5 م.
      4. إعداد إضعاف المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) Triton X-100 والحزب الديمقراطي الصربي 0.25% (w/v) 1 × مثبطات البروتياز.
      5. إعداد الرقائق العازلة 1 استخدام 20 مم تريس في pH 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      6. إعداد الرقائق العازلة 2 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم يدتا، 1% (v/v) X-100 تريتون، و 0.2% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      7. إعداد الرقائق العازلة 3 استخدام 20 مم تريس pH 8.0، 250 ملم ليكل، 2 مم يدتا، 1% (v/v) NP-40، و 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي.
      8. تعد الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس pH 8.0 و 2 مم يدتا.
      9. إعداد المخزن المؤقت شطف الطازجة التي تحتوي على 1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 100 ملم ناكو3.

2-العصبية السلف العزلة من أنسجة المخ

  1. عزل وزراعة الاختياري Cpc
    1. Euthanize الحيوانات الحوامل بخلع سرطان عنق الرحم، ونقل الأجنة إلى حبس المثلج.
    2. إزالة الجمجمة مع المقص وعزل الدماغ، ثم إزالة السحايا، إذا كان ذلك ممكناً، مع ملقط صغير وعزل كورتيسيس (الجامعة، DT، أو فاتو) من كلا نصفي الكرة الأرضية عن طريق إزالة جميع أجزاء الدماغ الأخرى تحت مجهر نطاق استخدام الملقط الصغيرة، وإذا كان مقص اللازمة، والصغيرة. تخزين كورتيسيس معزولة في المخزن المؤقت لحبس 5 مل عند 4 درجة مئوية في أنبوب 15 مل.
    3. الطرد المركزي المواد المعزولة من المخ لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية.
    4. أغسل كورتيسيس مع 5 مل حبس المثلج وتجانسه لهم مع تلميح ماصة 1 مل من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. إذا لزم الأمر، قص غيض غيض ماصة.
    5. الطرد المركزي العينة المتجانس لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. إزالة حبس.
    6. أضف 3 مل التربسين واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    7. أضف 1 مل FCS ومل 5 CCM 30 ميليلتر من الدناز 1 للعينة وتجانسه مع ماصة زجاجية 5 مل العينة التي بيبيتينج بعناية صعودا وهبوطاً.
    8. الطرد المركزي الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق في 1000 x ز و 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وإضافة 5 مل CCM ومجانسة العينة مرة أخرى.
    9. تمييع قاسمة العينة وتعول عليه نويباور عد-دائرة. ومن المتوقع متوسط مبلغ 4.5 × 106 خلايا للجنين. لزراعة Cpc معزولة المضي قدما خطوة 2.1.10. للرقائق، تشرع فورا بالخطوة 3.
    10. للزراعة، والاطباق في كثافة بين 8 × 104 و 2.5 × 105 خلايا/سم2 في المتوسط CCM لوحة Cpc في بولي-L-أورنيثيني (0.1 مغ/مل) ولامينين (1 ملغ/مل) المغلفة واحتضانها لهم في 5% CO2, 37 درجة مئوية والرطوبة النسبية 100%.
    11. منذ البداية Cpc للتفريق في الخلايا العصبية في ثقافة الخلية (بعد 4 أيام تقريبا)، النظر في تاريخ التشريح كيوم في المختبر 0 (يوم 0). لمدة أطول من زراعة، تغيير نصف المتوسط كل يوم الرابع مع الطازجة CCM المتوسطة.
    12. تطبيق 1-5 ميكرومتر SGC0946 أو EPZ5676 حله في [دمس] في اليوم 0 (4-5 ح بعد عزل الخلية) وتحديثها كل يوم الثاني. استخدام [دمس] كعلاج لعنصر تحكم. اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت، إذا لزم الأمر.
  2. عزل وزراعة كجنبس اختياري
    1. Euthanize الحيوانات P5-7 بقطع الرأس باستخدام مقص. إزالة الجلد فروة الرأس وفتح الجمجمة وإزالة الدماغ باستخدام مقص صغير والملقط. عزل المخيخ وأنه نقل إلى هبس/السكر المثلج. إزالة كافة السحايا والأوعية الدموية ونقل سيريبيلا إلى 15 مل أنابيب مملوءة بالبرد هبس/الجلوكوز.
    2. أغسل سيريبيلا ثلاث مرات مع 10 مل هبس المثلج/الجلوكوز (جمع لهم بالطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية) ومجانسة سيريبيلا بعد ذلك بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة 1 مل (الحد الأقصى 2-3 مرات) للحصول على 0.5-1 ملم3 الشظايا.
    3. إضافة 5 مل التربسين 0.025% في حبس/الجلوكوز واحتضان الأنسجة تحت التحريك المستمر في حمام مائي 37 درجة مئوية عن 15 دقيقة توقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل من الجمعية العمومية وجمع الأنسجة باستخدام الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. إزالة المادة طافية وتريتوراتي الأنسجة مع تلميح بيبيت مل 1 في 1 مل CGM وتحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة.
      ملاحظة: من المهم تجنب فقاعات الهواء.
      1. إضافة 5 مل CGM واحتضان الخليط لمدة 2 دقيقة على الجليد لتسوية مخلفات الأنسجة. نقل المادة طافية في أنبوب 15 مل جديدة. إضافة 2 مل CGM إلى الأنسجة المتبقية وكرر الإجراء تريتوريشن.
    5. تجمع سوبيرناتانتس (بدون مخلفات الأنسجة، حوالي 10 مل في المجموع) والطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لجمع خلايا الدماغ. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM.
    6. منذ astrocytes التمسك بشكل أسرع وأقوى بولي-د-يسين من كجنبس، لوحة الخلايا على 100 ميكروغرام/مل بولي-د-يسين المغلفة 6-جيدا-لوحات (تصل إلى 4 مل في البئر) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لإزالة أستروسيتيس.
    7. هز اللوحة وجمع المادة طافية. ثم الطرد المركزي في 650 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في أنبوب 15 مل. ريسوسبيند بيليه في 10 مل CGM وعد الخلايا مع نويباور العد الدائرة.
      ملاحظة: كجنبس هي جولة، صغيرة، وتظهر هالة عند تصويرها باستخدام الطوري.
    8. إذا كان المطلوب، والبذور الخلايا في 37 درجة مئوية قبل استعد CGM على ألواح بولي-L-أورنيثيني-المغلفة (3 × 106 خلايا الواحدة 6-جيدا) واحتضانها لهم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 الرطوبة النسبية 100%.
      ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ البذر، انتقل إلى الخطوة 3، 1.
      1. بعد 6-12 ساعة، تبادل المتوسط إلى CGM SHH. علاج ح 6 كجنبس معزولة (أو عند تغيير إلى CGM SHH) بعد عزلة مع مثبط DOT1L و [دمس] التحكم وتجديدها كل يوم الثاني (مقارنة مع 2-1-12). اختبار كفاءة العلاج المانع عن طريق الأساليب القياسية إيمونوبلوت إذا لزم الأمر. للرقائق، المضي في الخطوة 3، 3.
        ملاحظة: ترك CGM على اللوحات (ومع ذلك FBS) سيؤدي في التفريق بين كجنبس في الدماغ الخلايا العصبية الحبيبية (كنس).

3-تثبيت الخلايا والقص من الكروماتين

ملاحظة: إجراء الخطوات 3.1 و 3.2 إذا لم تستزرع خلايا، إذا لم تكن للانتقال إلى الخطوة 3، 3.

  1. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 س ز وإضافة 1.3 مل برنامج تلفزيوني. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة دقيقة 4 في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع 1.3 مل برنامج تلفزيوني.
  2. الخطوة الحاسمة: إضافة 350 ميليلتر 1% منهاج عمل بيجين للعينة واحتضان عليه لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية. للتوقف عن رد فعل، أضف 18.4 ميليلتر جليكاين، وبرنامج تلفزيوني 1 مل. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية.
    1. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1,000 س ز و 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون وقت التثبيت 5 دقيقة بالضبط للحصول على أفضل النتائج. أرقام خلية مختلفة قد تتطلب تعديلات الوقت.
  3. الخطوة الحاسمة: كجنبس المستزرعة (أو Cpc)، إضافة إلى 1 مل 1% منهاج عمل بيجين إلى الآبار لوحة الثقافة الخلية مباشرة. بعد 5 دقيقة حضانة عند 22 درجة مئوية، إضافة مبلغ مناسب جليكاين وبرنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا مع مكشطة خلية.
    1. نقل الخلايا في أنابيب 1.5 مل والطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق ب 000 1 × ز و 4 درجة مئوية. تغسل العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني المثلج. جمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي لابتداء 5 1,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تبقى العينات على الجليد من الآن فصاعدا.
  4. الخطوة الحاسمة: إضافة 700 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (+ مثبطات البروتياز) واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. دوامة العينة كل دقيقة 5 القص الكروماتين الخلايا ليسيد 3 × 10 دقيقة في سونيكاتور (30 s نبض، 30 s وقفه) في الحد الأقصى من الطاقة.
    1. تأكد من أن وحدة التخزين لا تتجاوز 350 ميليلتر كل أنبوب. دوامة فحص العينات كل دقيقة 10 للنوى المتبقية مع مجهر تباين مرحلة.
      ملاحظة: من المهم للحصول على أفضل النتائج القص (مقارنة مع الشكل 1B) لتحليلها في وقت لاحق. في حالة استخدام أساليب أخرى للقص الكروماتين، تحسين القص إلى شظايا الكروماتين الحجم بين 200-500 bp.
  5. بيليه مخلفات الخلية عن 10 دقيقة، 13,000 س ز، 4 درجة مئوية. استخدام المادة طافية لخطوة بريكليرينج 5.2. تجميد العينة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.

4-إعداد الخرز وبريكليرينج

  1. أغسل 45 ميليلتر البروتين A المغناطيسي الخرز/رقاقة و 20 ميليلتر المغناطيسي الخرز/عينة مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين ثلاث مرات استخدام موقفا مغناطيسية. ثم أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج الخرز.
  2. 1 مل المثلج برنامج تلفزيوني والخرز ميليلتر 45/رقاقة، إضافة 3 ميكروغرام من جسم/تشيب (H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار لربط الأضداد الخرز. اعتماداً الضد، استخدم ~ 3 ميكروغرام جسم/رقاقة.
  3. أغسل الجسم-منضم-الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني المثلج 1 مل تحتوي على 0.02% توين. إضافة حجم حبة المناسبة (ابتداء من حجم الخرز المغناطيسية المستخدمة) لبرنامج تلفزيوني المثلج ليغسل الجسم-إلى جانب-الخرز.
  4. إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع و 20 ميليلتر من حبات مغناطيسية غسلها للعينة بريكليرينج (الحجم الإجمالي 1,320 ميليلتر) واحتضانها ح 2 في 4 درجات مئوية في دوار. إزالة الخرز استخدام موقفا مغناطيسية. تأخذ 5% (33 ميليلتر) من ليساتيس كنماذج الإدخال وتجميدها في-20 درجة مئوية.

5-الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن

  1. تقسيم استخراج بريكليريد أنبوبين (حوالي 643.5 ميليلتر)، وإضافة نفس حجم المخزن المؤقت لتمييع والجسم-منضم-الخرز (45 ميليلتر في العينة؛ H3K79me2 أو أرنب مفتش). احتضان العينات عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في دوار.
  2. تغسل الخرز مع المثلج الرقائق العازلة 1 والرقائق العازلة 2 والرقائق العازلة 3 لكل 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في دوار. وبعد ذلك يغسل ثلاث مرات مع المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في دوار.
  3. الوت الخرز مع شطف المخزن المؤقت لح 1 1,400 لفة في الدقيقة في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة 10 ميكروغرام رناسي (1 ملغ/مل) كل عينة رقاقة و 5 ميكروغرام لنماذج الإدخال واحتضان هذه العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (1,400 لفة في الدقيقة).
  5. إضافة 100 ميكروغرام "ك البروتيناز" (20 ميكروغرام/ميليلتر) كل رقاقة عينة و 50 ميكروغرام كل المدخلات واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية في 1,400 في الدقيقة.

6-تنقية العينات رقاقة

  1. تنقية شرائح وعينات الإدخال مع تنقية الحمض النووي كيت (انظر الجدول للمواد) وفقا للدليل. استخدام أعمدة تنقية أكثر عندما يتوقع أكثر من 5 ميكروغرام من الحمض النووي. الوت العينة مع 2 × 15 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف الحمض النووي المنصوص عليها في هذه المجموعة.
  2. إجراء التقدير الكمي لهذه العينات (استخدام 1 ميليلتر) باستخدام fluorophore نحققها ومن فلوروسبيكتروميتير (انظر الجدول للمواد).

7-تحليل "العينات رقاقة" عبر قبكر

  1. التصميم التمهيدي لتحليل قبكر، استرداد تسلسل الجينوم للفائدة من المستعرض عارض الجينوم التكاملية (IGV)34. تصميم كبسولة تفجير حول موقع بدء النسخي (TSS) الجينات، حيث H3K79me2 من المحتمل أن يكون موجوداً هناك. كعنصر تحكم، تنظر غير ترميز الجينوم الأقاليم أو المناطق حوالي 10 كيلو بايت المنبع لخدمات الدعم التقني أو 10 كيلو بايت المصب نهاية النسخي الموقع (قسم التدريب والامتحانات).
    1. توليد الإشعال باستخدام https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/مسبقاً بحجم منتج بين 70 و 200 شركة بريتيش بتروليوم، ودرجة حرارة مثلى من 60 درجة مئوية. لأغراض المحاكمة، استخدم كبسولة تفجير لمناطق الجينوم Aft4، Ddit3، Scd1، Aft3، و Npm1 المدرجة في الجدول 1.
  2. اختبار الإشعال المصممة حديثا مع البرنامج قبكر التالية ومزيج الرئيسي تدرج درجة الحرارة انلينغ بين 58 و 63 درجة مئوية، وتحديد درجة حرارة انلينغ بأعلى المنتج كمية ونوعية.
    1. تطبيق الحمض النووي جل التفريد التحكم في حجم الناتج المتوقع. لتحليل قبكر، واستخدام "نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي" (انظر الجدول للمواد).
    2. إعداد مزيج الرئيسي باستخدام 10 ميليلتر بوليميراز الدنا الرئيسي ميكس التمهيدي ميليلتر 0.5 إلى الأمام (10 ميكرون)، 0.5 ميليلتر التمهيدي عكس (10 ميكرون)، 4 المياه خالية من نوكلاس ميليلتر والحمض النووي 5 ميليلتر (1 نانوغرام/ميليلتر).
    3. استخدام برنامج قبكر 2-خطوة على النحو التالي: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية، 50 x (30 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية-63 درجة مئوية)، والانحدار تمسخ باستمرار عند 4 درجات مئوية.
  3. إنشاء سلسلة تمييع للجينوم والمنفصمة وتنقية عينات من الحمض النووي (2 نانوغرام/ميليلتر و 1 نانوغرام/ميليلتر، 0.5 نانوغرام/ميليلتر، 0.25 ng/ميليلتر و 0.125 نانوغرام/ميليلتر) واستخدام 5 ميليلتر لاختبار كفاءة استخدام قبكر. تحديد منحدر المنحنى المعياري وحساب كفاءة التمهيدي بالصيغة التالية:
    الكفاءة (%) = (^(-1/slope)-1 من 10) * 100.
    1. استخدام أجهزة الإشعال مع الفعالية بين 90% و 105% في حالة مثالية، أو في الأقل مع الكفاءة بين 85% و 115%.
  4. لتحليل شرائح وعينات الإدخال، قم بتطبيق 0.1-1 نانوغرام من "رقاقة الحمض النووي" مختلطة مع كل منهما إلى الأمام وعكس التمهيدي والمياه خالية من نوكلاس بوليميريز الحمض النووي الرئيسي في وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر لكل رد فعل qPCR مزيج.
  5. تحديد قيم العتبة دورة (Ct) شرائح ونماذج الإدخال وتطبيع العينة جر إلى قيمt C من المدخلات لحساب تخصيب (الإدخال %) بالصيغة التالية. استخدام جر القيم التي تم الحصول عليها من مراقبة مفتش لتحديد مستوى الخلفية.
    الإدخال % = 100-2^(norm. − الإدخال هو القاعدة. رقاقة)
    القواعد والمعايير. الإدخال = جر (مدخلات) − سجل2(عامل التخفيف)
    القواعد والمعايير. رقاقة = جر (رقاقة) − سجل2(عامل التخفيف)
    ملاحظة: القاعدة. = تم تسويتها

8-تحليل عينات رقاقة عبر التسلسل

  1. نقل العينات رقاقة (الإدخال وإيمونوبريسيبيتاتيد عينة الحمض النووي) إلى مرفق لتسلسل.
  2. لإعداد باستخدام مكتبة مسبقاً، إعداد مكتبة مناسبة كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحويل 2 نانوغرام المدخلات الحمض النووي وكل شيء من الحمض النووي إيمونوبريسيبيتاتيد في المكتبات المفهرسة للجيل القادم متعدد التسلسل في وأشارت إلى منصة (انظر الجدول للمواد).
  3. الخطوة الحاسمة: اتباع الإرشادات كيت، اضطر محولات التسلسل (مع تركيز عمل من 15 ميكرون) لوضع حد لإصلاحه والذيل دا شظايا من الحمض النووي. محولات التسلسل وبكر استخدام كبسولة تفجير أوليجوس المناسبة (انظر الجدول للمواد). لهذا المبلغ لإدخال الحمض النووي، استخدام دورات بكر 6-9 لإثراء شظايا من الحمض النووي محول متصلة.
    ملاحظة: عادة، فإنه لا يلزم القيام بتحديد حجم الحمض النووي محول متصلة. فمن الأفضل لاستخدام عدد قليل من PCR دورات ممكن، منذ التضخيم بكر العديد من دورات نتيجة في التكرارات بكر وتحيز GC عالية.
  4. لإجراء فحص نهائي مكتبة، تأخذ 0.5 ميليلتر من رد فعل مجموع إلى تصور حجم التوزيع على جهاز مناسب للتحليل (انظر الجدول للمواد). للتحديد الكمي، استخدام صبغة نحققها في تركيبة مع فلوروسبيكتروميتير أو الأساليب الأخرى (انظر الجدول للمواد).
  5. حيث يبدو أن H3K79me2 تعديل هستون، الذي ينتشر على نطاق واسع على مناطق الجينوم أكبر، تسلسل العينات المزدوجة-النهاية مع طول قراءة من 50 بي بي ومع عمق 75 ميو يقرأ تسلسل.
  6. تحليل البيانات seq رقاقة مع "الملقم فرايبورغ" المجرة/يوني (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. أداء مراقبة الجودة مع تشيبسيق التي تم الحصول عليها مع فاستقك، وإذا كان ذلك مناسباً، خريطة لهم مباشرة مع Bowtie2 الإصدار 2.2.035 مع أو بدون اقتطاع. استخدام الجينوم الجمعية كمرجع mm9 أو mm10 الإصدار الأحدث؛ ومرجع تعليق توضيحي الإصدار FTP انسيمبل 79.
  8. اختياري: قراءة إزالة التكرارات باستخدام "ماركدوبليكاتيس بيكار" (http://broadinstitute.github.io/picard) قبل استدعاء الذروة.
  9. استدعاء قمم مع MACS2 الإصدار 2.1.036 استخدام الخيار 'الواسع' ل H3K79me2.
  10. للحصول على نسبة2 سجل بين رقاقة وإدخال عينة، سجل2 عدد من يقرأ يقرأ استخدام نسبة من كلا عينات بامكوفيراجي وبامكومباري.
  11. لجميع الأخرى seq شرائح محددة من التحليل المتعمق، تطبيق deepTools2 النسخة 2.3.5 أو 2.4.137، أي لتوليد تغطية مسار الملفات (بامكوفيراجي لشرائح فقط، بامكومباري للمقارنة رقاقة للإدخال)، لتقدير رقاقة استخدام الأداء بلوتفينجيربرينت وتوليد استخدام لمحة عامة كومبوتيماتريكس، بلوثياتماب. حدد K-يعني تجميع أثناء عملية كومبوتيماتريكس إلى الكتلة مناطق الجينوم وفقا للتوزيع H3K79me2.
  12. استخدام seq رقاقة البيانات المنشورة ك H3K79me2 DT E14.5 أودعت في نكبي لأغراض المحاكمة (رقم الانضمام: SRP057733).

النتائج

المخطط العام لعزل السلف العصبية، زراعة، وأساليب التحليل رقاقة H3K79me2 والرقائق: ويبين الشكل 1 مخطط انسيابي لأداء رقاقة H3K79me2 الخلايا القشرية السلف عند نقاط زمنية مختلفة خلال نمو الدماغ الجنينية أو فروعه العصبية الحبيبية الدماغ في المراحل اللاحقة ل...

Discussion

هناك طريقتان الرئيسي لأداء إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين للكشف عن الجينوم شغل التعديلات هستون، عوامل النسخ، هستون رمز القراء، والكتاب، أو ومحايات. واحد هو الأسلوب رقاقة الأصلي باستخدام nuclease هضمها، الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن، والآخر هو أن أسلوب عرضها باستخدام الكروماتين ثاب?...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية

Acknowledgements

ونحن نشكر هنرييت بيرتيميس للمساعدة على إنشاء البروتوكول زراعة CGN داخل المختبر. وأيد هذه الورقة أسلوب "التخلق الطبية" الممولة من DFG CRC992 بتمويل للتلفزيون. يعترف الكتاب الدعم من "فريق غالاكسي فرايبورغ": فيديم بافانكومار، بيورن Grüning، والبروفيسور رولف باكوفين، المعلوماتية الحيوية، جامعة فرايبورغ، ألمانيا تمول "التعاونية أبحاث المركز 992 الطبية اللاجيني" (منحة DFG SFB 2012 992/1) والوزارة الألمانية الاتحادية للتعليم والبحوث (الفدرالية منحة 031 A538A ربك (دي. مبادرة حوض النيل)).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

References

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 H3K79 DOT1L DOT1L

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved