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Resumen

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Resumen

Desarrollo del cerebro es un proceso complejo, que es controlado en forma temporo-espacial por gradientes de morfógenos y diferentes programas transcripcionales. Además, modificaciones epigenéticas de la cromatina, como la metilación de las histonas, tienen un papel importante para establecer y mantener destinos celulares específicas dentro de este proceso. La gran mayoría de la metilación de las histonas se produce en la cola de la histona flexible, que es accesible a los modificadores de las histonas, los borradores y proteínas de histona lector. En cambio, metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3 y está implicada en diversas funciones del desarrollo. H3K79 metilación evolutionarily se conserva y puede encontrarse en una amplia gama de especies de Homo sapiens a Saccharomyces cerevisiae. La modificación se produce en diferentes poblaciones celulares dentro de los organismos, incluyendo progenitores neuronales. La ubicación de la metilación de H3K79 en el dominio globular de la histona 3 hace difícil evaluar. Aquí se presentan métodos para aislar y progenitor cortical cultura (CPCs) con células de tejido embrionario cerebro cortical (E11.5-E14.5) o progenitores de neuronas granulares cerebelosas (CGNPs) del tejido postnatal (P5-P7) y eficientemente immunoprecipitate H3K79me2 para PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación del genoma.

Introducción

Las funciones sensoriales, motores y cognitivas del cerebro son altamente complejas y susceptibles a los cambios físicos y ambientales. El cerebro consta de tres partes generales el hind-, mediados de y prosencéfalo, que están profundamente conectados. En el prosencéfalo, el telencéfalo puede dividirse en un telencéfalo dorsal (DT) y un telencéfalo ventral (VT). El DT de los ratones consiste en seis capas corticales que se forman entre E11.5 y E18.5 en una manera de "inside-out"1. El VT incluye las eminencias ganglionares en desarrollo, que posteriormente forman los ganglios basales2,3. Varios tipos celulares se pueden clasificar en mamífero sistema nervioso central tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos4, que se convierten en una forma temporo-espacial5. En primer lugar, las células progenitoras neurales (PNJ) dan lugar a diferentes tipos de neuronas, interneuronas en las VT y las neuronas de proyección en el despegue y más tarde en las células gliales (p. ej., astrocitos6). Durante el desarrollo cortical, la capa más superficial (capa I), que contiene las células de Cajal-Retzius, está formado en primer lugar. Luego, entre E12.5 y E14.5, NPCs generan capas más profundas neuronales (VI, V) mientras que entre 14,5 y 16,5, progenitores dan lugar a las neuronas de la capa superior (IV-II)7,8. Identidad neuronal está especificado por diferentes programas transcripcionales temporo-espacial inducida por morfógeno y además por programas epigenéticos2.

El cerebelo, que está implicado en la coordinación motora, se encuentra en el cerebelo y se desarrolla entre E10 y P20 en ratones9. Contiene la corteza cerebelosa y los núcleos cerebelosos10. La corteza cerebelosa adultos consta de tres capas, la capa molecular externa, la capa de células de Purkinje y la capa granular más interna que contiene las neuronas granulares10. Las células del gránulo cerebeloso son las neuronas más pequeñas y representan alrededor del 80% de todas las neuronas en el cerebro vertebrados11. Se desarrollan a partir de precursores en la zona germinal externa y migran a través de la capa de células de Purkinje a su destino12. Como en el telencéfalo, el desarrollo del cerebelo está regulado por varios importantes morfógenos, que tienen funciones específicas de tiempo y espacio dependiente e iniciar define programas transcripcionales10.

El desarrollo de capas corticales y cerebelosas es controlado por la expresión transcripcional de morfógenos específicos y, por tanto, el estado de la cromatina de la DNA. En una visión simplificada, Estados de la cromatina pueden dividirse en eucromatina como transcripcionalmente activo y heterocromatina regiones transcripcionalmente silencioso. Como la unidad básica de la cromatina nucleosoma contiene dos copias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 y H4, rodeado de 147 pares de bases de ADN13. Las histonas son modificadas altamente postraduccional por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, la sumoilación, ADP-ribosylation, desaminación y prolina isomerización14,15. La metilación de lisina de las histonas se considera que la modificación de las histonas más estable que controla la transcripción, replicación, recombinación16, daño de la DNA respuesta17e impresión genómica18. Lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metilados19 y aparecer en las colas de las histonas accesible, sino también en el dominio globular de las histonas20. Metilaciones específicas en H3K4 y H3K36 se asocian principalmente a eucromatina, metilaciones específicas en H3K9 H3K27 y H4K20 se encuentran principalmente en regiones heterochromatic, aunque todos los residuos se encuentran a la cola de las histonas14, 19,21. Metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de las histonas y se ha asociado con la actividad transcripcional, sino también con las regiones genomic transcripcionalmente inerte22. La modificación evolutionarily se conserva ya que se ha observado en levaduras, timo de ternero, pollo y humana23. H3K79 mono, di y trimetilación (H3K79me1, me2 y me3) son catalizadas por la histona metiltransferasas DOT1L24,25 y la Nuclear conjunto dominio-que contienen la proteína 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicado en la proliferación y reparación del ADN celular reprogramación27. Pérdida de Dot1l en ratones conduce a una muerte prenatal alrededor de la etapa de desarrollo E10.528,29. Durante el desarrollo del corazón y en la diferenciación de myocardiocyte, DOT1L es esencial para gene expresión Reglamento30. En el sistema nervioso central, función DOT1L podría estar implicada en el tubo neural desarrollo31, está implicado en la supresión de Tbr1-expresión durante el desarrollo de cerebro anterior32y puede funcionar en la regulación de la tensión ER de genes de respuesta33. Contexto-dependiente de la activación o represión acción de H3K79me, especialmente con en vivo situaciones como el desarrollo del sistema nervioso central, es hasta la fecha sólo parcialmente entendida32. Puesto que la metilación del H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3, es sterically menos accesible en comparación con modificaciones de la histona flexible cola23. Para entender la función de la metilación de H3K79, se necesitan métodos de análisis fiables y reproducibles para determinar su ubicación y entorno genómico. En este trabajo métodos, presentamos métodos de aislamiento de diferentes progenitores neuronales (CPCs de la corteza) y CGNPs para el cerebelo, eficaz tratamiento del inhibidor de DOT1L y un método de ChIP para analizar H3K79 metilación mediante qPCR o secuenciación en tiempo diferente puntos durante el desarrollo cortical y cerebeloso. Para tener una visión general del protocolo y sus posibilidades, vea la figura 1.

Protocolo

Comités de bienestar animal de la Universidad de Freiburg y las autoridades locales aprobaron todos los experimentos con animales (G12/13, 11 G16) mencionados en el siguiente protocolo.

1. preparaciones

  1. Preparativos para el aislamiento de CPCs
    1. Configurar tiempo de apareamiento para obtener embriones en diferentes etapas de desarrollo de la corteza (entre E11.5 y E14.5). Utilizar ratones de la cepa NMRI (Instituto de investigación médica Naval) que son al menos 8 semanas de edad. Después de aparearse, considere un tapón vaginal positivo E0.5.
    2. Para tener suficiente material, utilizar una camada de ratones NMRI para un ChIP de H3K79me2 de cortezas de E12.5 o E14.5. Para más adelante etapas embrionarias, utilice una camada para más análisis de ChIP (promedio de tamaño de camada NMRI: 10 embriones).
    3. Preenfriar Hank´s balanceado sal solución (HBSS) y solución salina con tampón fosfato (PBS) a 4 ° C (almacenamiento a largo plazo en RT).
    4. Equilibrar los 4 ° C almacenado tripsina-EDTA (0.05% p/v) a 37 ° C.
    5. Medio de preparar células corticales (CCM): Suplementar el medio de las neuronas (véase Tabla de materiales) con concentraciones finales de 2% (v/v) B-27 suplemento, 5 μg/mL Apo-transferrina, glutatión de 1 μg/mL, 0,5 mM L-glutamina, dismutasa del superóxido de 0,8 μg/mL y 1% (v/v) Mezcla antibiótica de penicilina-estreptomicina-neomicina. Almacenar a 4 ° C. Para el experimento, equilibrar el medio a 37 ° C.
    6. Descongelar el suero fetal de ternero (FCS), alícuota que (50 mL cada uno) y alcancen una alícuota a 37 ° C (almacenamiento a largo plazo a-20 ° C).
    7. Preparar las acciones de la DNasa 1 (10 mg/mL) en H2O para el cultivo celular. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.
    8. Si es necesario, disolver los inhibidores específicos de la DOT1L zona franca-5676 o SGC0946 en DMSO a una concentración stock de 100 mM. Una concentración final de 1-5 μm se aplican a las células en el día 0 y vuelva a aplicar el inhibidor cada dos días.
    9. Para el cultivo de la CPC, la capa celular placas (pozo 12 o 6 bien) con poli-L-ornitina bromhidrato (1 mg/mL en 150 mM ácido bórico de pH 8,4) durante al menos 1 h a temperatura ambiente y luego con laminina (1 mg/mL) en medio de la CCM a 37 ° C durante la noche.
  2. Preparativos para el aislamiento de CGNP
    1. Organizar un adecuado apareamiento de ratones para generar animales P5-P7 para el aislamiento del cerebelo (3-5 animales por ChIP y condición).
    2. Preparar HBSS glucosa mediante la adición de 6 mg/mL glucosa al buffer HBSS.
    3. Preparar el medio de cultivo de células CGNP (CGM) mediante la adición de 1% (v/v) N2 suplemento, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM KCl y 10% FCS a DMEM-F12. Para el cultivo de CGNP prepare medio CGM sin FCS pero incluyendo erizo sonic de 0,6 μg/mL (SHH) (CGM-SHH) y equilibrar a 37 ° C cuando sea necesario.
    4. Capa de placas 6-pozo de la célula con 100 μg/mL poly-D-lisina para 1-2 h a temperatura ambiente para la eliminación de células de la glia. Luego lavar dos veces con ddH estéril2O y deje que se seque las placas. Almacenar las placas para una semana máximo a 4 ° C.
    5. Para el cultivo de CGNPs capa celular bien 6 placas con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 ° C durante la noche. Luego lavar dos veces con H2O para el cultivo celular y deje que se seque las placas.
      Nota: Las placas pueden guardarse durante una semana máximo a 4 ° C.
    6. Preparar tripsina 0,025% (p/v) en glucosa HBSS y equilibre a 37 ° C cuando sea necesario.
  3. Preparaciones para el ChIP de H3K79me2
    1. Preparar la PFA (1% en PBS, pH 8) recién antes de cromatina de reticulación. Para preparar PFA calentar 50 mL de PBS en el microondas a máxima 65 ° C. En constante agitación añadir 0,5 mg PFA al PBS. Luego agregar 50 μl 10 M NaOH y espere hasta que se disuelva la PFA. Luego, añadir 42,5 μl HCl (37% v/v) para obtener un pH de 8. Verificar el pH otra vez y luego dejar la solución al 1% PFA llegar a RT
    2. Preparar acciones de Rnasa (1 mg/mL) y proteinasa K (20 μg/μl) por separado en ddH estéril2O. almacenar las alícuotas a-20 ° C.
    3. Preparar los siguientes buffers y reactivos: que contiene 0,02% de PBS Tween, tampón de lisis, glicina, buffer de dilución, ChIP tampón 1, buffer ChIP 2, buffer ChIP 3 y buffer TE y almacenar a 4 ° C. Preparar el tampón de elución recién cada vez.
      1. Preparar que contiene 0,02% de PBS Tween. Tienda en más de una semana a 4 ° C.
      2. Preparar el tampón de lisis utilizando 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS) y 1 x inhibidor de la proteasa.
      3. Preparar 2,5 M glicina.
      4. Preparar el tampón de dilución con 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Tritón X-100, 0.25% (p/v) de SDS y 1 x inhibidor de la proteasa.
      5. Preparación de buffer ChIP 1 con 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Tritón X-100 y 0.2% (p/v) de SDS.
      6. Preparar el tampón de ChIP 2 con 20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 y 0.2% (p/v) de SDS.
      7. Preparación de buffer ChIP 3 usando 20 mM Tris, pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40 (v/v) y 1% (p/v) de SDS.
      8. Preparar el tampón TE utilizando 20 mM Tris pH 8.0 y 2 mM EDTA.
      9. Preparar el tampón de elución fresco contiene 1% (p/v) de SDS, 100 mM NaHCO3.

2. nervios del Progenitor aislamiento de tejido cerebral

  1. Aislamiento y cultivo opcional de CPCs
    1. Eutanasia de los animales embarazados por dislocación cervical y transferir los embriones a HBSS helada.
    2. Quitar el cráneo con tijeras y aislar el cerebro, luego quitar las meninges, en su caso, con pinzas pequeñas y cortezas aislante (entero, DT o VT) de ambos hemisferios mediante la eliminación de todas las otras partes cerebrales en el ámbito binocular utilizando pinzas pequeñas y, si es necesarios, pequeñas tijeras. Almacenar las cortezas aisladas en tampón HBSS de 5 mL a 4 ° C en un tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar el material de cerebro aislado durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C.
    4. Lavar las cortezas con 5 mL helado HBSS y homogeneizarlas con una pipeta de 1 mL por pipeteo arriba y abajo. Si es necesario, cortar la punta de la pipeta.
    5. Centrifugue la muestra homogeneizada durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C. Retire la HBSS.
    6. Añadir 3 mL de tripsina e incubar la muestra durante 5 min a 37 ° C.
    7. Añadir 1 mL de FCS, 5 mL CCM y 30 μl de DNasa 1 a la muestra y homogeneizar la muestra con una pipeta de vidrio de 5 mL por Pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo.
    8. Centrifugar las células aisladas durante 5 minutos a 1000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante, agregar 5 mL CCM y homogeneizar la muestra una vez más.
    9. Diluir una alícuota de la muestra y cuenta con una cámara de conteo Neubauer. Se espera un promedio de 4.5 x 106 células por embrión. Para el cultivo de las CPCs aislados continúe con el paso 2.1.10. Para ChIP, inmediatamente proceder con el paso 3.
    10. Para el cultivo, placa CPCs en poly-L-ornitina (0,1 mg/mL) y laminina (1 mg/mL) cubierto platos con una densidad entre 8 x 104 y 2.5 x 105 células/cm2 en medio de la CCM e incubar a 37 ° C, 5% CO2y 100% de humedad relativa.
    11. Como los CPCs comienzan a diferenciarse en neuronas en cultivo celular (después de aproximadamente 4 días), considerar la disección fecha del día en vitro 0 (día 0). Para más condiciones de cultivo, cambiar la mitad del medio cada cuarto día con medio fresco de CCM.
    12. Aplicar 1-5 μm de SGC0946 o EPZ5676 disuelto en DMSO en el día 0 (4-5 h después de aislamiento de células) y actualice cada segundo día. Uso de DMSO como tratamiento control. Comprobar la eficiencia del tratamiento del inhibidor mediante métodos estándar immunoblot, si es necesario.
  2. Aislamiento y cultivo opcional de CGNPs
    1. Eutanasia a P5-7 animales por decapitación con unas tijeras. Quitar la piel del cuero cabelludo, abrir el cráneo y quitar el cerebro utilizando pinzas y tijeras pequeñas. Aislar el cerebelo y traslado a glucosa HBSS helada. Retire todas las meninges y los vasos sanguíneos y transferir el cerebelo en tubos de 15 mL con glucosa HBSS frío.
    2. Lavar el cerebelo tres veces con 10 mL glucosa HBSS helada (recogerlos por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 ° C) y homogeneizar cerebelo posteriormente transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL (máximo 2 - 3 veces) a 0.5-1 mm3 los fragmentos.
    3. Añadir 5 mL de tripsina de 0.025% en HBSS glucosa e incubar el tejido bajo agitación constante en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos parada la digestión agregando 5 mL de CGM y recoger el tejido por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 ° C.
    4. Quite el sobrenadante y triturate el tejido con una punta de la pipeta de 1 mL en 1 mL CGM y transferirlo a un nuevo tubo de 15 mL.
      Nota: Es importante evitar burbujas de aire.
      1. Añadir 5 mL CGM e incubar la mezcla por 2 min en hielo para colocar restos de tejido. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL. Añadir 2 mL CGM el tejido residual y repita el procedimiento de trituración.
    5. Piscina los sobrenadantes (sin restos de tejido, aproximadamente 10 mL en total) y centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 ° C para recoger las células cerebelosas. Resuspender el precipitado en 10 mL CGM.
    6. Ya que los astrocitos se adhieren más rápido y más fuerte a poly-D-lisina que CGNPs, las células en 100 μg/mL poly-D-Lisina 6-pozo-placas cubiertas de la placa (hasta 4 mL por pozo) e incubar por 20 min a 37 ° C para eliminar los astrocitos.
    7. Agitar la placa y recoger el sobrenadante. Luego centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 ° C en un tubo de 15 mL. Resuspender el precipitado en 10 mL CGM y contar las células con una cámara de recuento de Neubauer.
      Nota: CGNPs son redondos, pequeños y muestran un halo cuando reflejada mediante microscopía de contraste de fase.
    8. Si necesario, semilla las células en 37 ° C previamente calentado CGM en placas de poly-L-ornitina-cubierto (3 x 106 células por pocillo 6) e incuban a 37 ° C, 5% CO2 y 100% de humedad relativa.
      Nota: Si no se realiza la siembra, continúe con el paso 3.1.
      1. Después de 6-12 h, el intercambio del medio a CGM-SHH. Tratar el aislado CGNPs 6 h (o al cambiar a CGM-SHH) después de aislamiento con inhibidor de la DOT1L y DMSO control y renovarla cada dos días (Comparar con 2.1.12). Comprobar la eficiencia del tratamiento del inhibidor mediante métodos de immunoblot estándar si es necesario. Para ChIP, continúe con el paso 3.3.
        Nota: Dejando CGM en las placas (y con eso FBS) dará lugar a la diferenciación de las CGNPs en neuronas granulares cerebelosas (CGNs).

3. fijación de las células y la esquila de la cromatina

Nota: Realice los pasos 3.1 y 3.2 Si no se cultivan células, si son continúe con el paso 3.3.

  1. Recoger las células por centrifugación durante 4 min a 1.000 x g y agregar 1,3 mL de PBS. Transferir la muestra a un tubo de 1,5 mL. Centrifugar durante 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lave la muestra dos veces con 1,3 mL de PBS.
  2. Paso crítico: Añadir 350 μL 1% PFA a la muestra e incubar durante 5 minutos a 22 ° C. Para detener la reacción, añadir 18.4 glicina μl y 1 mL PBS. Centrifugue la muestra durante 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
    1. Lave la muestra dos veces con PBS helado. Recoger las células fijas por centrifugación durante 5 minutos a 1.000 x g y 4 ° C. Mantener las muestras en hielo de ahora en adelante.
      Nota: El tiempo de fijación debe ser exactamente 5 min para obtener resultados óptimos. Un número diferente de células puede requerir adaptaciones de tiempo.
  3. Paso crítico: CGNPs cultivadas (o CPC), agregar 1 mL 1% PFA directamente a los pozos de la placa de la célula cultura. Después de una incubación de 5 minutos a 22 ° C, agregar una cantidad apropiada de glicina y PBS y cosechar las células con un raspador celular.
    1. Las células de transferencia en tubos de 1.5 mL y centrifugar la muestra durante 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Lave la muestra dos veces con PBS helado. Recoger las células fijas por centrifugación para 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantener las muestras en hielo de ahora en adelante.
  4. Paso crítico: Añadir 700 μl de tampón de lisis (+ inhibidor de la proteasa) e incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. Vórtice de la muestra cada 5 minutos esquileo la cromatina de las células sometidas a lisis 3 x 10 min en el sonicador (pulso 30 de s, 30 s pausa) a máxima potencia.
    1. Asegúrese de que el volumen no exceda de 350 μl por tubo. Vórtice las muestras cada 10 minutos comprobar el lisado para núcleos restantes con un microscopio de contraste de fase.
      Nota: Es importante obtener resultados de corte óptimos (Comparar con figura 1B) para su posterior análisis. En caso de utilizar otros métodos para el corte de la cromatina, optimiza el corte de fragmentos de cromatina de tamaño entre 200-500 bp.
  5. Pellets de restos celulares para 13.000 x g, 10 min, 4 ° C. Utilice el sobrenadante del paso preclearing 5.2. Congelación de la muestra a-20 ° C para uso posterior, si es necesario.

4. preparación de los granos y Preclearing

  1. Lavar 45 μl proteína A granos/viruta magnética y granos magnéticos 20 μl/la muestra con 1 mL PBS helado que contiene 0,02% Tween tres veces utilizando un soporte magnético. Luego, añadir 1 mL de PBS helado a los granos.
  2. Añadir a 1 mL PBS helado y 45 μl granos/ChIP, 3 μg de anticuerpo/ChIP (H3K79me2 o IgG de conejo). Incubar las muestras durante 2 h a 4 ° C en un agitador para los anticuerpos se unen a los granos. Dependiendo de los anticuerpos, usar ~ 3 μg de anticuerpo y virutas.
  3. Lavar los granos de anticuerpo enlazado tres veces con 1 mL PBS helado que contiene 0,02% Tween. Añadir el volumen de grano apropiado (a partir de volumen de perlas magnéticas utilizadas) de PBS helado a los lavados anticuerpo acoplado en granos.
  4. Añadir 600 μl de tampón de dilución y 20 μl de lavado bolas magnéticas a la muestra para preclearing (μL volumen total 1.320) e incubar por 2 h a 4 ° C en un agitador. Quitar los granos con un soporte magnético. Tomar 5% (33 μL) de los lisados como entradas muestras y congelarlas a-20 ° C.

5. inmunoprecipitación de cromatina

  1. El extracto de precleared se dividen en dos tubos (μL aproximadamente 643.5), agregar el mismo volumen de tampón de dilución y el anticuerpo-limite-perlas (45 μl/muestra; H3K79me2 o IgG de conejo). Incubar las muestras a 4 ° C durante la noche en un agitador.
  2. Lavar los granos con buffer de viruta helada 1, buffer ChIP 2 y ChIP buffer 3 por 10 min a 4 ° C en un agitador. Luego, lave tres veces con tampón TE por 5 min a 4 ° C en un agitador.
  3. Eluir los granos con tampón de elución por 1 h a 1.400 rpm en un agitador a temperatura ambiente.
  4. Añadir 10 μg Rnasa (1 mg/mL) por cada muestra de ChIP y 5 μg a las muestras de entrada e incubar las muestras durante 30 min a 37 ° C (1.400 rpm).
  5. Añadir 100 μg de proteinasa K (20 μg/μl) por muestra y 50 μg por la entrada de la viruta e incubar durante una noche a 65 ° C a 1.400 rpm.

6. purificación de las muestras de ChIP

  1. Purificar el ChIP y la entrada de las muestras con una purificación de DNA kit (véase Tabla de materiales) según el manual. Utilizar más columnas de purificación cuando se espera que más de 5 μg de ADN. Eluir la muestra con 2 x 15 μl del buffer de elución de ADN proporcionado en el kit.
  2. Realizar la cuantificación de las muestras (use 1 μl) mediante un visualización fluoróforo y un fluorospectrometer (véase Tabla de materiales).

7. Análisis de muestras de la viruta mediante qPCR

  1. Diseño de cartilla para el análisis de qPCR, recuperar secuencias genómicas de interés desde el navegador de visor de genómica Integrativa (IGV)34. Diseño de primers alrededor del sitio de inicio transcripcional (TSS) de un gen, ya que H3K79me2 es probable que se encuentra allí. Como control, considere no codificante genomic regiones o regiones aproximadamente 10 Kb de subida de la TSS o 10 Kb de bajada del final transcripcional sitio (TES).
    1. Generar los cebadores con https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ usando un tamaño de producto entre 70 y 200 bp y una óptima temperatura de la precolocación de 60 ° C. Para fines de prueba, utilizar Imprimaciones para las regiones genomic Aft4 Ddit3, Scd1, Aft3 y Npm1 enumerados en la tabla 1.
  2. Prueba nuevo diseñadas cartillas con el siguiente programa de qPCR, mezcla principal y un gradiente de temperatura de recocido entre 58 ° y 63 ° C y seleccionar la temperatura de recocido con la mayor cantidad de producto y calidad.
    1. Aplicar electroforesis del gel de DNA para controlar el tamaño del producto esperado. Para el análisis de qPCR, utilizar un sistema de detección de PCR en tiempo real (véase Tabla de materiales).
    2. Preparar la mezcla principal con 10 μl ADN polimerasa principal mezclar 0,5 μl la cartilla hacia adelante (10 μm), 0,5 inversa la cartilla μl (10 μm), 4 μL de agua libre de nucleasas y 5 μl ADN (1 ng/μL).
    3. Utilizar un programa de qPCR paso 2 como sigue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s a 58 ° C a 63 ° C) y el gradiente de desnaturalización constantemente a 4 ° C.
  3. Crear una serie de diluciones de las muestras de ADN genómicas, esquiladas, purificadas (2 ng/μl, 1 ng/μl, 0.5 ng/μl, 0.25 ng/μl y 0,125 ng/μL) y 5 μL para una prueba de eficiencia utilizando qPCR. Determinar la pendiente de la curva estándar y calcular la eficiencia de la cartilla por la siguiente fórmula:
    Eficiencia (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Utilizar cebadores con eficiencias entre 90% y 105% en un caso ideal, o al menos con eficiencias entre 85 y 115%.
  4. Para analizar el ChIP y la entrada muestras, aplicar 0.1-1 ng de DNA ChIP mezclado con respectivo adelante y cartilla reversa, agua libre de nucleasas y polimerasa de la DNA master mix en un volumen final de 20 μl de cada reacción de qPCR.
  5. Determinar los valores de umbral de ciclo (Ct) de la viruta y las muestras de entrada y normalizar la muestra Ct a Ct valores de entrada para el cálculo de enriquecimiento (entrada %) con la siguiente fórmula. Valores de uso Ct obtenidos control de IgG para determinar el nivel de fondo.
    % entrada = 100-2^(norma − entrada normal. Viruta)
    norma. entrada = Ct (entrada) − log2(factor de dilución)
    norma. ChIP = Ct (ChIP) − log2(factor de dilución)
    Nota: norma. = normalizado

8. Análisis de muestras de la viruta a través de la secuencia

  1. Transferir las muestras de ChIP (entrada y immunoprecipitated muestra de ADN) a un centro de secuenciación.
  2. Para preparar un uso previamente, biblioteca una preparación de biblioteca apropiado kit (véase Tabla de materiales) y convertir 2 ng de la entrada del ADN y todo lo de la DNA immunoprecipitated en librerías indexadas para próxima generación multiplexan la secuencia en la indica la plataforma (véase Tabla de materiales).
  3. Paso crítico: Siguiendo las instrucciones del kit, ligan adaptadores de secuencia (con una concentración de trabajo de 15 μm) para poner fin a repararse y cola dA fragmentos de ADN. Para adaptadores de secuenciación y la PCR primers utilizan oligos apropiado (véase Tabla de materiales). Para esta cantidad de DNA de entrada, use 6-9 ciclos PCR para enriquecer adaptador unen fragmentos de ADN.
    Nota: Normalmente, no es necesario realizar una selección del tamaño de ADN adaptador ligada. Es mejor usar ciclos PCR como pocos como sea posible, desde muchos PCR resultado de ciclos de amplificación en PCR duplicados y un alto sesgo de GC.
  4. Para una comprobación final de la biblioteca, tomar 0,5 μl de la reacción total de análisis para visualizar la distribución del tamaño de un dispositivo apropiado (véase Tabla de materiales). Para la cuantificación, utilizar un medio de contraste visualizado en combinación con un fluorospectrometer u otros métodos (véase Tabla de materiales).
  5. Ya que H3K79me2 parece ser una modificación de las histonas, que se extiende ampliamente por regiones genómicas más grandes, la secuencia de muestras emparejadas-final con una longitud de lectura de 50 bp y con una profundidad de secuenciación de 75 Mio Lee.
  6. Analizar los datos del ChIP-seq con el servidor Galaxy/Uni de Freiburg (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Realizar control de calidad con ChIPseq obtenido con FastQC y, si procede, los mapas directamente con Bowtie2 versión 2.2.035 con o sin corte. Asamblea del genoma de referencia usa mm9 o la más reciente versión mm10; y como anotación de referencia Ensembl FTP 79.
  8. Opcional: Quitar Lee duplicados utilizando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) antes de llamar al pico.
  9. Llamar a picos con MACS2 versión 2.1.036 usando la opción 'amplia' para H3K79me2.
  10. Para obtener una Registro2 relación entre ChIP y muestra de entrada, Registro2 del número de lecturas de la Lee cociente de ambas muestras utilice BamCoverage y BamCompare.
  11. Para todos otros ChIP-seq específico análisis en profundidad, aplicar deepTools2 versión 2.3.5 o 2.4.137, es decir, para generar archivos de pista de cobertura (bamCoverage para el ChIP sólo, bamCompare para la comparación de la viruta a la entrada), para estimar el ChIP rendimiento utilice plotFingerprint y para generar una visión general computeMatrix, plotHeatmap. Seleccione K-significa agrupamiento durante el proceso de computeMatrix a regiones genómicas según la distribución de H3K79me2.
  12. Uso datos de ChIP-seq publicados como H3K79me2 de E14.5 DT depositado en NCBI para propósitos de prueba (número de accesión: SRP057733).

Resultados

Régimen general de progenitoras neurales aislamiento, cultivo, métodos de análisis de H3K79me2 ChIP y ChIP: La figura 1 muestra un diagrama de flujo para realizar H3K79me2 ChIP de células progenitoras cortical en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario del cerebro o de progenitores de neuronas granulares cerebelosas en etapas postnatales. Como primer paso, el cerebro tiene que ser aislado y el telencéfalo (entre E11.5 y E14...

Discusión

Hay dos maneras principales de inmunoprecipitación de cromatina para detectar la ocupación genómica de modificaciones de las histonas, factores de transcripción, lectores de código de las histonas, escritores o gomas de borrar. Uno es el método de ChIP nativo con nucleasa digerida, la cromatina nativa para la inmunoprecipitación, y el otro es el método presentado con cromatina PFA-fijo, esquilada, en el que los nucleosomas y otras proteínas ADN Unido están covalentemente al ADN 39. ChIP ...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten

Agradecimientos

Agradecemos a Henriette Bertemes para ayudar a establecer el protocolo de cultivo de CGN dentro del laboratorio. Este papel de método fue apoyada por la DFG financió CRC992 médico epigenética por financiación a TV. Los autores reconocen el apoyo del equipo galaxia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning y Prof. Rolf Backofen, bioinformática, Universidad de Freiburg, Alemania financiado por colaboración investigación 992 centro médico epigenética (grant DFG SFB 992/1 de 2012) Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

Referencias

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