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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Abstract

Lo sviluppo del cervello è un processo complesso, che è controllato in maniera temporo-spaziale dai gradienti di morfogeni e diversi programmi trascrizionali. Inoltre, modificazioni epigenetiche della cromatina, come metilazione dell'istone, hanno un ruolo importante per stabilire e mantenere destini cellulari specifici all'interno di questo processo. La stragrande maggioranza di metilazione dell'istone si verifica sulla coda dell'istone flessibile, che è accessibile ai modificatori dell'istone, gomme e proteine istoniche lettore. Al contrario, H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3 ed è implicata in diverse funzioni evolutive. H3K79 metilazione è evolutivamente conservata e può essere trovata in una vasta gamma di specie da Homo sapiens di Saccharomyces cerevisiae. La modifica avviene in popolazioni differenti delle cellule all'interno di organismi, comprese le cellule progenitrici neurali. La posizione di metilazione di H3K79 nel dominio globulare dell'istone 3 lo rende difficile da valutare. Qui, presentiamo metodi per isolare e progenitrici corticale cultura cellule (CPCs) dal tessuto cerebrale corticale embrionale (E11.5-e. 14.5) o progenitori del neurone granulare cerebellare (CGNPs) dal tessuto postnatale (P5-P7) e in modo efficiente immunoprecipitate H3K79me2 per PCR quantitativa (qPCR) e sequenziamento del genoma.

Introduzione

Le funzioni sensoriali, motorie e cognitive del cervello sono estremamente complessi e sensibili ai cambiamenti fisici ed ambientali. Il cervello è costituito da tre parti generali hind-, mid-e del forebrain, che sono profondamente collegati. All'interno del forebrain, telencefalo può essere diviso in un telencefalo dorsale (DT) e un ventrale telencefalo (VT). Il DT dei topi è costituito da sei strati corticali che si formano tra E11.5 ed E18.5 in un modo "inside-out"1. Il VT comprende le eminenze gangliare in sviluppo, che poi formano i gangli basali2,3. Diversi tipi di cellule possono essere classificati nel sistema nervoso centrale dei mammiferi quali neuroni, astrociti e oligodendrociti4, che si sviluppano in un modo temporo-spaziale5. In primo luogo, le cellule progenitrici neurali (NPC) danno origine a diversi tipi di neuroni, interneuroni nel VT e neuroni di proiezione nella DT e successivamente ai cellule gliali (ad es., gli astrociti6). Durante lo sviluppo corticale, lo strato più superficiale (strato I), che contiene le cellule di Cajal-Retzius, si forma dapprima. Quindi, tra 12.5 ed e 14.5, NPC generano più profondi strati neuronali (VI, V) mentre tra 14,5 e 16,5, progenitori danno origine al livello superiore (IV-II) neuroni7,8. Un neurone identità viene specificata da diversi programmi di transcriptional temporo-spaziale indotta da morfogeno e inoltre da epigenetici programmi2.

Il cervelletto, che è implicato nella coordinazione motoria, si trova del hindbrain e si sviluppa tra E10 e approssimativamente P20 in topi9. Esso contiene la corteccia cerebellare ed i nuclei cerebellari10. La corteccia cerebellare adulta è costituito da tre strati, lo strato molecolare più esterno, lo strato delle cellule di Purkinje e lo strato granulare più interno che contiene neuroni granulari10. Le cellule cerebellari del granello sono i neuroni più piccoli e rappresentano circa l'80% di tutti i neuroni nel cervello dei vertebrati11. Sviluppano da precursori che si trova nella zona germinale esterna e migrano attraverso lo strato di cellule di Purkinje al loro destinazione12. Come nel telencefalo, lo sviluppo del cervelletto è regolato da diversi importanti morfogeni, che hanno funzioni specifiche e spazio-temporale e avviare definiti programmi trascrizionali10.

Lo sviluppo degli strati corticali e cerebellari è controllato dall'espressione trascrizionale di specifici morfogeni e, quindi, dallo stato della cromatina del DNA. In una vista semplificata, gli Stati della cromatina è divisibile in euchromatin come trascrizionalmente attiva e l'eterocromatina come regioni transcriptionally silenziose. Il nucleosoma come unità di base della cromatina contiene due copie di ogni istone core H2A, H2B, H3 e H4, circondato da 147 paia di basi di DNA13. Gli istoni sono altamente traduzionalmente modificati di metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumoilazione, ADP-ribosylation, deaminazione e prolina isomerizzazione14,15. Metilazione dell'istone lisina è considerata il più stabile modifica dell'istone che controlla la trascrizione, replica, ricombinazione16, DNA-danno risposta17e imprinting genomico18. Lisine possono essere mono-, di- o tri-metilato19 e appaiono non solo sulle code degli istoni accessibile, ma anche all'interno del dominio globulare di istoni20. Iperomocisteinemici specifici alle H3K4 e H3K36 sono associate principalmente l'eucromatina, specifici iperomocisteinemici H3K9, H3K27 o H4K20 si trovano principalmente in regioni eterocromatiche, anche se tutti i residui sono situati entro l'istone coda14, 19,21. La metilazione di H3K79 si trova all'interno del dominio globulare istone ed è stata associata con l'attività trascrizionale, ma anche con regioni genomiche trascrizionalmente inerte22. La modifica è evolutivamente conservata poiché è stato osservato in lievito, timo di vitello, pollo e umano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) sono catalizzate dalle istone metiltransferasi DOT1L24,25 e il nucleare SET dominio-contenente della proteina 2 (Nsd2)26. DOT1L è implicato nella proliferazione e riparazione del DNA cellulare riprogrammazione27. Perdita di Dot1l in topi porta ad una morte prenatale intorno la fase inerente allo sviluppo e 10.528,29. Durante lo sviluppo del cuore e nella differenziazione dei myocardiocyte, DOT1L è essenziale per gene espressione regolamento30. Nel sistema nervoso centrale, DOT1L funzione potrebbe essere implicato nel tubo neurale sviluppo31, è coinvolto nella soppressione Tbr1-espressione nel proencefalo sviluppo32e potrebbe funzionare nella regolazione di sforzo di ER geni di risposta33. Il contesto-dipendente attivando o reprimere azione di H3K79me, soprattutto con situazioni in vivo come lo sviluppo del sistema nervoso centrale, è ad oggi solo parzialmente capito32. Poiché H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3, è stericamente meno accessibile rispetto alle modifiche sui code istoniche flessibile23. Per comprendere la funzione di metilazione di H3K79, sono necessari metodi di analisi affidabili e riproducibili per determinare la sua posizione e ambiente genomica. In questa carta di metodi, presentiamo metodi di isolamento di diversi progenitori neurali (CPC per la corteccia) e CGNPs per il cervelletto, efficace trattamento dell'inibitore di DOT1L e un metodo di ChIP per analizzare la metilazione H3K79 via qPCR o sequenziamento in tempi diversi punti durante lo sviluppo corticale e cerebellare. Per una panoramica del protocollo e delle sue possibilità, Vedi Figura 1.

Protocollo

Comitati di benessere degli animali delle autorità locali e Università di Friburgo ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali (G12/13, G16/11) menzionati nel protocollo seguente.

1. preparati

  1. Preparazioni per l'isolamento del CPCs
    1. Impostare tempo accoppiamento per ottenere embrioni a diversi stadi di sviluppo della corteccia (tra E11.5 ed e 14.5). Utilizzare i topi del ceppo NMRI (Naval Medical Research Institute), che sono almeno 8 settimane di vita. Dopo l'accoppiamento, considera un plug vaginale positivo a 0.5.
    2. Per avere materiale sufficiente, è possibile utilizzare una cucciolata di topi NMRI per uno H3K79me2 ChIP da cortecce di 12.5 o e 14.5. Per versioni successive fasi embrionali, utilizzare una cucciolata per ulteriori analisi di ChIP (media dimensione della lettiera NMRI: 10 embrioni).
    3. Preraffreddare Hank´s equilibrato sale soluzione (HBSS) e tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C (stoccaggio a lungo termine a RT).
    4. Equilibrare i 4 ° C memorizzati tripsina-EDTA (0,05% w/v) a 37 ° C.
    5. Mezzo di Prepare corticale-cellulare (CCM): Integrare il supporto per i neuroni (Vedi Tabella materiali) con concentrazioni finali di supplemento di B-27 del 2% (v/v), 5 µ g/mL Apo-transferrina, 1 µ g/mL del glutatione, 0,5 mM L-Glutammina, superossidodismutasi 0,8 µ g/mL e 1% (v/v) Miscela di antibiotici penicillina-streptomicina-neomicina. Conservare a 4 ° C. Per l'esperimento, equilibrare il medium a 37 ° C.
    6. Scongelare il siero fetale di vitello (FCS), aliquota e (50 mL CAD.) ed equilibrare un'aliquota a 37 ° C (stoccaggio a lungo termine a-20 ° C).
    7. Preparare scorte di dnasi 1 (10 mg/mL) in H2O per la coltura cellulare. Conservare le aliquote a-20 ° C.
    8. Se necessario, sciogliere gli inibitori specifici di DOT1L EPZ-5676 o SGC0946 in DMSO ad una concentrazione stock di 100 mM. Applicare una concentrazione finale di 1-5 µM alle celle al giorno 0 e riapplicare l'inibitore ogni due giorni.
    9. Per la coltivazione di CPC, cappotto piastre per colture cellulari (ben 6 o 12 bene) con poli-L-ornitina hydrobromide (1 mg/mL a 150 mM a pH acido borico 8,4) per almeno 1 h a RT e in seguito con laminina (1 mg/mL) nel mezzo CCM a 37 ° C durante la notte.
  2. Preparazioni per l'isolamento CGNP
    1. Organizzare un appropriato accoppiamento dei topi per generare animali P5-P7 per isolamento del cervelletto (3-5 animali per ChIP e condizione).
    2. Preparare HBSS/glucosio con l'aggiunta di 6 mg/mL glucosio al buffer HBSS.
    3. Preparare il terreno di coltura cellulare CGNP (CGM) con l'aggiunta di supplemento N2 di 1% (v/v), 1% (v/v) penicillina-streptomicina-neomicina, 25 mM KCl e 10% FCS a DMEM-F12. Per la coltivazione di CGNP preparare CGM supporto senza FCS ma con riccio sonic a 0,6 µ g/mL (SHH) (CGM-SHH) ed equilibrare e a 37 ° C quando necessario.
    4. Cappotto piastre per colture cellulari a 6 pozzetti con 100 µ g/mL poli-D-lisina per 1-2 h a RT per la rimozione di cellule gliali. In seguito lavare due volte con ddH sterile2O e asciugare i piatti. Conservare le piastre per massimo una settimana a 4 ° C.
    5. Per la coltivazione di CGNPs cappotto piastre per colture cellulari di 6 pozzetti con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 ° C durante la notte. In seguito lavare due volte con H2O per la coltura cellulare e asciugare i piatti.
      Nota: Le piastre possono essere memorizzate per massimo una settimana a 4 ° C.
    6. Preparare 0.025% tripsina (w/v) in HBSS/glucosio ed equilibrare e a 37 ° C quando necessario.
  3. Preparazioni per il ChIP di H3K79me2
    1. Preparare PFA (1% in PBS, pH 8) appena prima di reticolazione della cromatina. Per preparare il PFA calore 50 mL di PBS nel microonde al massimo 65 ° C. Durante l'agitazione costante aggiungere 0,5 mg PFA per il PBS. Quindi aggiungere 50 µ l 10 M NaOH e attendere fino al PFA è dissolto. In seguito, µ l 42,5 HCl (37% v/v) per ottenere un pH di 8. Verificare il pH nuovamente e poi lasciare che la soluzione di 1% PFA per raggiungere RT
    2. Preparare scorte di RNAsi (1 mg/mL) e proteinasi K (20 µ g / µ l) separatamente in sterile ddH2O. conservare le aliquote a-20 ° C.
    3. Preparare i seguenti reagenti e buffer: PBS contenente 0,02% Tween, buffer di Lisi, glicina, tampone di diluizione, ChIP buffer 1, tampone di ChIP 2, ChIP buffer 3 e buffer di TE e conservarli a 4 ° C. Preparare il tampone di eluizione fresco ogni volta.
      1. Preparare PBS contenente 0,02% Tween. Archivio al maggior parte una settimana a 4 ° C.
      2. Preparare il tampone di lisi utilizzando 50mm Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (p/v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 1x inibitore della proteasi.
      3. Preparare 2,5 M glicina.
      4. Preparare il tampone di diluizione utilizzando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 0,25% (p/v) SDS e 1x inibitore della proteasi.
      5. Preparare il tampone di ChIP 1 utilizzando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) X-100 Triton e 0,2% (w/v) SDS.
      6. Preparare il tampone di ChIP 2 utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) X-100 Triton e lo 0,2% (w/v) SDS.
      7. Preparare il tampone di ChIP 3 utilizzando 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250mm LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 e 1% (p/v) SDS.
      8. Preparare il buffer di TE usando 20 mM Tris pH 8.0 e 2 mM EDTA.
      9. Preparare il tampone di eluizione fresco contenente l'1% (p/v) SDS, 100mm NaHCO3.

2. neural Progenitor isolamento del tessuto cerebrale

  1. Isolamento e coltura opzionale di CPC
    1. Eutanasia animali gravidi di dislocazione cervicale e trasferire gli embrioni in HBSS ghiacciata.
    2. Rimuovere il cranio con le forbici e isolare il cervello, quindi rimuovere le meningi, se applicabile, con piccole pinze e cortecce isolate (interi, DT, o VT) di entrambi gli emisferi rimuovendo tutte le altre parti di cervello nell'ambito binoculare utilizzando pinze piccole e, se necessarie, piccole forbici. Memorizzare le cortecce isolate in 5 mL di tampone HBSS a 4 ° C in una provetta da 15 mL.
    3. Centrifugare il materiale cerebrale isolato per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C.
    4. Lavare le cortecce con 5 mL HBSS ghiacciata e omogeneizzarle con una punta di Pipetta 1ml pipettando su e giù. Se necessario, tagliare la punta della punta della pipetta.
    5. Centrifugare il campione omogeneizzato per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C. Rimuovere l'HBSS.
    6. Aggiungere 3 mL di tripsina e incubare il campione per 5 min a 37 ° C.
    7. Aggiungere 1 mL di FCS, 5ml CCM e 30 µ l di dnasi 1 al campione e omogeneizzare il campione con una pipetta di vetro 5ml pipettando attentamente su e giù.
    8. Centrifugare le cellule isolate per 5 min a 1000 x g e a 4 ° C. Eliminare il surnatante, aggiungere 5 mL CCM e omogeneizzare il campione nuovamente.
    9. Diluire una parte aliquota del campione e contarli con una conteggio camera di Neubauer. È previsto un importo medio di 4.5 x 106 cellule per embrione. Per la coltivazione del CPCs isolato procedere con passo 2.1.10. Per il ChIP, immediatamente procedere con il passaggio 3.
    10. Per coltivazione, piastra del CPCs su poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) e laminina (1 mg/mL) ha ricoperto i piatti con una densità tra 8 x 104 e 2,5 x 105 cellule/cm2 nel mezzo di CCM e li Incubare a 37 ° C, 5% CO2e 100% di umidità relativa.
    11. Poiché il CPCs inizia a differenziarsi in neuroni in coltura cellulare (dopo circa 4 giorni), è necessario considerare la data di dissezione come giorno in vitro 0 (giorno 0). Per più termini di coltivazione, modificare la metà del mezzo ogni quarto giorno con mezzo fresco di CCM.
    12. Applicare 1-5 µM SGC0946 o EPZ5676 dissolto in DMSO al giorno 0 (4-5 h dopo l'isolamento delle cellule) e aggiornarlo ogni secondo giorno. Utilizzare DMSO come un trattamento di controllo. Testare l'efficienza del trattamento inibitore tramite metodi standard immunoblot, se necessario.
  2. Isolamento e coltura facoltativo di CGNPs
    1. Eutanasia: P5-7 animali per decapitazione usando le forbici. Togliere la pelle del cuoio capelluto, apre il cranio e rimuovere il cervello usando le pinze e le forbici piccole. Isolare il cervelletto e trasferirlo in HBSS/glucosio ghiacciato. Rimuovere tutte le meningi e vasi sanguigni e trasferire i cervelletti nelle provette da 15 mL riempite con HBSS/glucosio a freddo.
    2. Lavare i cervelletti tre volte con 10ml ghiacciato HBSS/glucosio (raccoglierli mediante centrifugazione a 650 x g per 5 min a 4 ° C) e omogeneizzare cervelletti successivamente pipettando delicatamente su e giù con una pipetta da 1 mL (massimo 2 - 3 volte) per ottenere 0,5-1 mm3 frammenti.
    3. Aggiungere 5 mL di tripsina 0.025% in HBSS/glucosio e incubare il tessuto sotto costante agitazione in bagnomaria a 37 ° C per 15 min Stop la digestione aggiungendo 5 mL di CGM e raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 650 x g per 5 min a 4 ° C.
    4. Rimuovere il supernatante e triturare il tessuto con una punta di pipetta da 1 mL in 1 mL CGM e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL.
      Nota: È importante evitare bolle d'aria.
      1. Aggiungere 5 mL CGM e incubare la miscela per 2 min sul ghiaccio per depositarsi residui di tessuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 mL. Aggiungere mL 2 CGM il tessuto residuo e ripetere la procedura di triturazione.
    5. Raccogliere i supernatanti (senza residui di tessuto, circa 10 mL in totale) e centrifugare a 650 x g per 5 min a 4 ° C per raccogliere le cellule cerebellari. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM.
    6. Dal momento che gli astrociti aderiscono più veloce e più forte di poli-D-lisina rispetto CGNPs, piastra le cellule su 100 µ g/mL poli-D-lisina 6-Pozzo-piastre (fino a 4 mL per pozzetto) e incubare per 20 min a 37 ° C per rimuovere gli astrociti.
    7. Agitare la piastra e raccogliere il surnatante. Poi Centrifugare a 650 x g per 5 min a 4 ° C in una provetta da 15 mL. Risospendere il pellet in 10 mL CGM e contare le celle con un Neubauer camera di conteggio.
      Nota: CGNPs sono rotondo, piccolo e mostrano un alone quando Imaging utilizzando la microscopia di contrasto di fase.
    8. Se richiesto, seme le cellule a 37 ° C pre-riscaldati CGM sulle piastre di poli-L-ornitina-coated (3 x 106 cellule per 6 pozzetti) e li Incubare a 37 ° C, 5% CO2 e 100% di umidità relativa.
      Nota: Se non viene eseguita la semina, continuare on to passaggio 3.1.
      1. Dopo 6-12 h, scambio medio-CGM-SHH. Trattare l'isolato CGNPs 6 h (o quando si cambia a CGM-SHH) dopo l'isolamento con DOT1L-inibitore e DMSO controllare e rinnovarlo ogni secondo giorno (confronta con 2.1.12). Testare l'efficienza del trattamento inibitore tramite metodi standard immunoblot se necessario. Per il ChIP, procedere con la fase 3.3.
        Nota: Lasciando CGM sulle piastre (e con quello FBS) si tradurrà nella differenziazione del CGNPs in neuroni granulari cerebellari (CGNs).

3. fissazione delle cellule e la tosatura della cromatina

Nota: Se le cellule sono coltivate non eseguire procedura 3.1 e 3.2, se essi sono procedere al punto 3.3.

  1. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 4 min a 1.000 x g e aggiungere 1,3 mL di PBS. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL. Centrifuga per 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lavare il campione due volte con 1,3 mL di PBS.
  2. Passaggio critico: Aggiungere 350 µ l 1% PFA al campione e incubare per 5 min a 22 ° C. Per interrompere la reazione, aggiungere 18,4 µ l glicina e 1 mL di PBS. Centrifugare il campione per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
    1. Lavare il campione due volte con PBS ghiacciata. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione per 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Mantenere i campioni su ghiaccio da ora in poi.
      Nota: Il tempo di fissaggio deve essere precisamente 5 min per ottenere risultati ottimali. Numeri di cellulari diversi possono richiedere adattamenti del tempo.
  3. Passaggio critico: A CGNPs coltivato (o CPC), aggiungere fino a 1 mL 1% PFA direttamente per i pozzetti della piastra cultura cellulare. Dopo 5 min di incubazione a 22 ° C, aggiungere una quantità appropriata di glicina e PBS e raccogliere le cellule con un raschietto di cella.
    1. Trasferire le cellule in provette da 1,5 mL e centrifugare il campione per 5 min a 1.000 x g e a 4 ° C. Lavare il campione due volte con PBS ghiacciata. Raccogliere le cellule fissate mediante centrifugazione per 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantenere i campioni su ghiaccio da ora in poi.
  4. Passaggio critico: Aggiungere 700 µ l di tampone di lisi (+ inibitore della proteasi) ed incubare il campione per 15 min a 4 ° C. Vortexare il campione ogni 5 min di taglio la cromatina delle cellule lisate 3 x 10 min in sonicatore (30 s pulse, 30 s pausa) alla massima potenza.
    1. Assicurarsi che il volume non superi 350 µ l per provetta. Vortice i campioni ogni 10 minuti controllare il lisato per i restanti nuclei con un microscopio a contrasto di fase.
      Nota: È importante ottenere risultati ottimali di taglio (confronta con Figura 1B) per un'analisi successiva. In caso di utilizzo di altri metodi per la tosatura della cromatina, ottimizzare la tosatura di cromatina frammenti di dimensioni tra 200-500 bp.
  5. A pellet resti di cella per 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Utilizzare il surnatante per il passaggio di preclearing 5.2. Congelare il campione a-20 ° C per un uso successivo, se necessario.

4. preparazione delle perline e Preclearing

  1. Lavare 45 µ l proteina A magnetico perline/ChIP e magnetico perline/campione di 20 µ l con 1 mL PBS ghiacciata contenente 0,02% Tween tre volte utilizzando un supporto magnetico. Quindi, aggiungere 1 mL di PBS ghiacciata ai talloni.
  2. 1 mL di PBS ghiacciata e 45 µ l perline/ChIP, aggiungere 3 µ g di anticorpo/ChIP (H3K79me2 o coniglio IgG). Incubare i campioni per 2 h a 4 ° C in un rotatore per associare gli anticorpi ai talloni. A seconda dell'anticorpo, utilizzare ~ 3 µ g anticorpo/ChIP.
  3. Lavare l'anticorpo-limite-perline tre volte con 1 mL PBS ghiacciata contenente 0,02% Tween. Aggiungere il volume appropriato perlina (volume di biglie magnetiche utilizzato iniziale) di PBS ghiacciata lavate anticorpo-accoppiato-perline.
  4. Aggiungere 600 µ l di tampone di diluizione e 20 µ l di biglie magnetiche lavati nell'esempio per preclearing (volume totale 1.320 µ l) e incubare per 2 ore a 4 ° C in un rotatore. Rimuovere le perle utilizzando un supporto magnetico. Prendono il 5% (33 µ l) dei lisati come campioni di ingresso e congelarli a-20 ° C.

5. immunoprecipitazione della cromatina

  1. Dividere l'Estratto precleared in due tubi (circa 643,5 µ l), aggiungere lo stesso volume di tampone di diluizione e l'anticorpo-limite-Perline (45 µ l/campione; H3K79me2 o coniglio IgG). Incubare i campioni a 4 ° C durante la notte in un rotatore.
  2. Lavare le perle con gelida ChIP buffer 1, ChIP buffer 2 e buffer di ChIP 3 per 10 minuti ciascuno, a 4 ° C in un rotatore. In seguito, lavare tre volte con buffer di TE per 5 min a 4 ° C in un rotatore.
  3. Eluire le perline con tampone di eluizione per 1 h a 1.400 giri/min in uno shaker a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere 10 µ g RNasi (1 mg/mL) per tipo di ChIP e 5 µ g per gli esempi di input e incubare i campioni per 30 min a 37 ° C (1.400 giri/min).
  5. Aggiungere 100 µ g proteinasi K (20 µ g / µ l) per ChIP campione e 50 µ g per ogni ingresso e incubare per una notte a 65 ° C a 1.400 giri/min.

6. purificazione di campioni di ChIP

  1. Purificare il ChIP e campioni di ingresso con una purificazione di DNA kit (Vedi Tabella materiali) secondo il manuale. Utilizzare più colonne di purificazione quando si prevede che più di 5 µ g di DNA. Eluire il campione con 2 x 15 µ l di tampone di eluizione di DNA forniti nel kit.
  2. Eseguire la quantificazione dei campioni (utilizzare 1 µ l) utilizzando un fluoroforo visualizzazione e un fluorospectrometer (Vedi Tabella materiali).

7. analisi dei campioni di ChIP via qPCR

  1. Per il disegno dell'iniettore per analisi qPCR, recuperare sequenze genomiche di interesse dal browser Integrative Genomics Viewer (IGV)34. Disegnare primers intorno al sito di inizio trascrizionale (TSS) di un gene, poiché H3K79me2 rischia di trovarsi lì. Come controllo, considera non codificanti genomico regioni o regioni circa 10 Kb a Monte del TSS o 10 Kb a valle dell'estremità trascrizionale del sito (TES).
    1. Generare gli iniettori con https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ utilizzando una dimensione di prodotto tra 70 e 200 bp e un'ottima temperatura preimpostata di 60 ° C. Ai fini della prova, è necessario utilizzare primer per le regioni genomiche Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 elencati nella tabella 1.
  2. Test recentemente progettato gli iniettori con il seguente programma di qPCR, mix master e un gradiente di temperatura di ricottura tra 58 ° e 63 ° C e selezionare la temperatura di ricottura con la più alta quantità di prodotto e di qualità.
    1. Applicare l'elettroforesi del gel del DNA per controllare le dimensioni del prodotto previsto. Per analisi qPCR, utilizzare un sistema di rilevazione di Real-Time PCR (Vedi Tabella materiali).
    2. Preparare il mix master utilizzando mix master della polimerasi del DNA di 10 µ l, 0,5 primer µ l in avanti (10 µM), 0,5 µ l primer inverso (10 µM), acqua priva di nucleasi di 4 µ l e 5 µ l DNA (1 ng / µ l).
    3. Utilizzare un programma di 2-step qPCR come segue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s a 58 ° C - 63 ° C) e il gradiente di denaturazione costantemente a 4 ° C.
  3. Creare una serie di diluizione di campioni di DNA genomici, tranciate, purificati (2 ng / µ l, 1 ng / µ l, 0,5 ng / µ l, 0.25 ng / µ l e 0,125 ng / µ l) e utilizzare 5 µ l per un test di efficienza utilizzando qPCR. Determinare la pendenza della curva standard e calcolare l'efficienza di primer dalla seguente formula:
    Efficienza (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Utilizzare primer con efficienze tra 90 e 105% in un caso ideale, o almeno con efficienze tra 85 e 115%.
  4. Per analizzare il ChIP e campioni di ingresso, applicare 0,1-1 ng di DNA ChIP mescolato con rispettivi forward e reverse primer, acqua priva di nucleasi e DNA polimerasi master mix in un volume finale di 20 µ l per ogni reazione di qPCR.
  5. Determinare i valori di ciclo (Ct) soglia di ChIP e campioni di ingresso e normalizzare il campione Ct a Ct i valori di input per calcolare arricchimento (% ingresso) con la seguente formula. Valori dit uso C ottenuti da IgG controllo per determinare il livello di sfondo.
    ingresso % = 100-2^(norma Norm. − input. ChIP)
    norma. input = Ct (ingresso) − registro2(fattore di diluizione)
    norma. ChIP = Ct (ChIP) − registro2(fattore di diluizione)
    Nota: norma. = normalizzato

8. analisi dei campioni di ChIP tramite sequenziamento

  1. Trasferire i campioni di ChIP (input e immunoprecipitati campione di DNA) ad un impianto di sequenziamento.
  2. Per preparare una biblioteca in anticipo, uso una preparazione libreria appropriata kit (Vedi Tabella materiali) e convertire 2 ng dell'input del DNA e tutto il resto del DNA immunoprecipitato in librerie indicizzate per la prossima generazione multiplex sequenziamento sul indicato piattaforma (Vedi Tabella materiali).
  3. Passaggio critico: Seguendo le istruzioni del kit, lega i adattatori di sequenziamento (con una concentrazione di lavoro di 15 µM) per terminare riparati e dalla coda dA frammenti di DNA. Per adattatori di sequenziamento e PCR primer utilizzare i oligos appropriati (Vedi Tabella materiali). Per questa quantità di DNA in entrata, utilizzare cicli di PCR 6-9 per arricchire i frammenti di DNA adattatore legato.
    Nota: Normalmente, non è necessario effettuare una selezione di dimensioni del DNA adattatore legato. È meglio utilizzare come pochi cicli di PCR come possibile, dal momento che molti risultato di cicli di amplificazione di PCR in PCR duplicati e un'alta polarizzazione di GC.
  4. Per una verifica finale biblioteca, prendere 0,5 µ l della reazione totale per analisi visualizzare la distribuzione delle dimensioni su un dispositivo appropriato (Vedi Tabella materiali). Per la quantificazione, è necessario utilizzare un colorante visualizzante in combinazione con un fluorospectrometer o altri metodi (Vedi Tabella materiali).
  5. Poiché H3K79me2 sembra essere una modifica dell'istone, che ampiamente si sviluppa su più grandi regioni genomiche, sequenza campioni accoppiato-fine con una lettura lunghezza di 50 bp e con una profondità di sequenziamento di 75 Mio letture.
  6. Analizzare i dati di ChIP-seq con il Server di Friburgo Galaxy/Uni (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Eseguire il controllo di qualità con ChIPseq ottenuti con FastQC e, se del caso, li mappa direttamente con Bowtie2 versione 2.2.035 con o senza taglio. Come assembly di genoma di riferimento utilizzare mm9 o la più recente versione mm10; e come annotazione di riferimento Ensembl FTP rilasciare 79.
  8. Opzionale: Rimuovi leggere duplicati utilizzando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) prima di chiamare di picco.
  9. Chiamare picchi con MACS2 versione 2.1.036 utilizzando l'opzione "di massima" per H3K79me2.
  10. Per ottenere un rapporto di2 log tra ChIP ed esempio di input, il registro2 del numero di letture del legge rapporto di entrambi i campioni utilizzare BamCoverage e BamCompare.
  11. Per tutti gli altri ChIP-seq specifici approfondimenti, applicare deepTools2 versione 2.3.5 o 2.4.137, cioè per generare i file di traccia di copertura (bamCoverage per il ChIP solo, bamCompare per il confronto di ChIP per l'input), per stimare il ChIP prestazioni utilizzare plotFingerprint e per generare una panoramica generale computeMatrix, plotHeatmap. Selezionare K-significa clustering durante il processo di computeMatrix di regioni genomiche secondo la distribuzione di H3K79me2 del cluster.
  12. Utilizzo ChIP-seq dati pubblicati come H3K79me2 di distacco e 14.5 depositati presso NCBI fini di valutazione (numero di accessione: SRP057733).

Risultati

Schema generale di isolamento progenitrici neurali, coltivazione, metodi di analisi H3K79me2 ChIP e ChIP: La figura 1 Mostra un diagramma di flusso per eseguire H3K79me2 ChIP di cellule progenitrici corticale in diversi momenti durante lo sviluppo embrionale del cervello o dei progenitori del neurone granulare cerebellare nelle fasi post-natale. Come primo passo, il cervello deve essere isolato e il telencefalo (tra E11.5 ed e 14.5) o del cer...

Discussione

Ci sono due modi principali per eseguire immunoprecipitazione della cromatina per rilevare l'occupazione genomica di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione, i lettori di codice dell'istone, scrittori o gomme. Uno è il metodo di ChIP nativo usando nucleasi digerita, nativo della cromatina per immunoprecipitazione, e l'altro è il metodo presentato utilizzando la cromatina PFA-fisso, tranciata, in cui i nucleosomes e altre proteine DNA-collegato sono covalentemente al DNA 39. ChIP nativo ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari

Riconoscimenti

Ringraziamo Henriette Bertemes per aver contribuito a stabilire il protocollo di coltivazione CGN all'interno del laboratorio. Questa carta di metodo era sostenuta dall'epigenetica medica CRC992 DFG-finanziato dai finanziamenti alla TV. Gli autori riconoscono il supporto del Team Galassia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof. ssa Rolf Backofen, bioinformatica, Università di Friburgo, in Germania, finanziato dal centro ricerca collaborativo 992 epigenetica medica (grant DFG SFB 992/1 2012) e Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP antibody
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
B27 Supplement (50x)Life Technologies17504044Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Ultrasonicator
Boric acid pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Ethylenediamine tetraacetic acidSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Comment: EDTA
Fetal Bovine Serum 10% (v/v)Gibco10082147Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM
GlucoseSigma-AldrichG5767Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Glutathione (1.25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For cell fixation
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR
Hank’s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: HBSS
L-glutamine (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Lithium chlorideSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Comment: LiCl
N2 supplementLife Technologies17502048Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification
NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation
Neurobasal mediumGibco21103049Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
ParaformaldehydeCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation
Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM
Phosphate buffered salineLife Technologies10010023Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma AldrichP3655Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC culturing
Potassium chlorideThermo FisherAM9640GCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: KCl, for CGM
Protease inhibitorRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: DOT1L inhibition
Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture
Sodium bicarbonateCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviation/Comment: for Elution buffer
Sodium chlorideCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP
Sodium dodecylsulfateCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CGNP isolation
Superoxide dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For ChIP buffer
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Comment: For CPC isolation
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Comment: For bead preparation
Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath
CCM: Cortical cell medium
CGM: CGNP cell culture medium

Riferimenti

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