JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه الدراسة توضح طريقة بسيطة للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 بالغنية لوسين تكرار كيناز 2.

Abstract

الطفرات في الغنية لوسين تكرار كيناز 2 (LRRK2) تبين أن تكون مرتبطة بمرض باركنسون الأسرية (FPD). منذ التنشيط غير طبيعي لنشاط كيناز LRRK2 قد تورط في الآلية المرضية لشعبة المشتريات، من الضروري وضع طريقة تقييم مستويات الفسيولوجية للنشاط كيناز من LRRK2. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن LRRK2 فوسفوريلاتيس أفراد الأسرة Rab جتباسي، بما في ذلك Rab10، في ظل الظروف الفسيولوجية. على الرغم من الفسفرة Rab10 الذاتية التي LRRK2 في الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عنها بواسطة الكتلي، كان من الصعب أن الكشف عن ذلك إيمونوبلوتينج وبسبب حساسية أجسام محددة الفسفرة المتاحة حاليا للفقراء Rab10. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للكشف عن مستويات الفسفرة Rab10 من LRRK2 الذاتية استناداً إلى إيمونوبلوتينج استخدام الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) جنبا إلى جنب مع علامة ربط الفوسفات (P--علامة)، التي ن-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N،ن '،ن'-تريس (بيريدين-2-يل-الميثيل) ديامينوبروبان-1، 3--2-الرتب الأخرى. هذا البروتوكول لا يشكل مثالاً للمنهجية التي تستخدم علامة ف فحسب بل يمكن أيضا تقييم كيف يغير الطفرات، فضلا عن العلاج المانع والإدارة أو أي عوامل أخرى مما يشير إلى المصب من LRRK2 في الخلايا والأنسجة .

Introduction

PD واحدة من الأمراض الأكثر شيوعاً التي الأعصاب، يغلب التي تؤثر على الخلايا العصبية تتميز في midbrain، أسفر عن الخلل في أنظمة المحركات في كبار السن1. بينما يطور معظم المرضى PD بطريقة متقطعة، وهناك أسر وراثة المرض. الطفرات في الجينات عدة وجدت لتكون مرتبطة مع FPD2. من الجينات المسببة ل FPD، LRRK2، التي كانت ثمانية مغلطه الطفرات (N1437H و R1441C/G/H/S، Y1699C، G2019S و I2020T) ترتبط FPD المهيمن موروثة التي تسمى PARK8 حتى الآن عن3،،من45. أيضا حددت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جواس) متفرقة PD المرضى الاختلافات الجينية في محور LRRK2 كعامل خطر لشعبة المشتريات، مما يوحي بأن الشذوذ في وظيفة LRRK2 سبب شائع نيوروديجينيريشن في كل متفرقة و PARK8 FPD6،،من78.

LRRK2 بروتين كبير (الأحماض الأمينية 2,527) تتكون من مجال تكرار الغنية leucine، Ras غتب-ملزم للبروتينات المعقدة (ROC) المجال، ج-محطة ROC (COR) المجال والمجال كيناز البروتين سيرين/ثريونين، و مجال تكرار WD409. قم بتحديد موقع الطفرات FPD الثمانية في هذه المجالات الوظيفية؛ N1437H و R1441C/G/H/S في المجال ROC، Y1699C في المجال COR، G2019S و I2020T في مجال كيناز. منذ الطفرة G2019S، الذي يوجد أغلب الأحيان طفرة في PD المرضى10،،من1112، يزيد من نشاط كيناز LRRK2 من 2-3 إضعاف في المختبر13، هو الافتراض بأنه أن الزيادة غير طبيعية في الفسفرة LRRK2 substrate(s) سامة للخلايا العصبية. ومع ذلك، كان من المستحيل لدراسة ما إذا كان يتم تبديل الفسفرة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة LRRK2 ركائز في الأسرية/متفرقة PD المرضى بسبب عدم وجود أساليب تقييم ذلك في عينات المرضى المشتقة.

عموما الكشف عن الفسفرة البروتين بواسطة immunoblotting أو المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) استخدام الأجسام المضادة على وجه الخصوص الاعتراف بدولة فوسفوريلاتيد للبروتينات أو بواسطة التحليل الشامل والمطيافيه. ومع ذلك، الاستراتيجية السابقة في بعض الأحيان لا يمكن تطبيق بسبب الصعوبات في إيجاد الأجسام المضادة الفسفرة محددة. وسم الأيضية للخلايا مع الفوسفات المشعة خيار آخر فحص مستويات الفيزيولوجية من الفسفرة عندما لا تكون الأجسام المضادة الفسفرة محددة متاحة بسهولة. بيد أنه يتطلب كمية كبيرة من المواد المشعة، وذلك ينطوي على بعض المعدات المتخصصة للإشعاع14. التحليل الشامل والمطيافيه هي أكثر حساسية بالمقارنة مع هذه الأساليب عن وأصبحت شعبية في تحليل البروتين الفسفرة. بيد أن إعداد عينة مضيعة للوقت ومكلفة الصكوك مطلوبة من أجل التحليل.

مجموعة فرعية من جتباسي رب الأسرة بما في ذلك Rab10 و Rab8 أفيد مؤخرا كركائز الفسيولوجية المباشرة ل LRRK2 استناداً إلى نتيجة ل تحليل واسع النطاق فوسفوبروتيوميك15. ثم أثبتنا أن الفسفرة Rab10 زيد ب FPD الطفرات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس وفي رئات الفئران16knockin. وفي هذا التقرير، اخترنا أن توظف صوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)-على أساس الأسلوب الذي جزيء فعلامه مبلمرة اشتركت في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية (فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) للكشف عن مستويات الذاتية الفسفرة Rab10، لأنه كان لا يزال يفتقر إلى جسم حساسة للغاية محددة ل Rab10 فوسفوريلاتيد. ونحن قد أخفقت في الكشف عن الفسفرة Rab8 الذاتية بسبب الانتقائية الفقراء من الأجسام المضادة المتاحة حاليا لمجموع Rab8. ولذلك، قررنا أن نركز على الفسفرة Rab10. LRRK2 فوسفوريلاتيس Rab10 في Thr73 مكان في منتصف المنطقة المصانة عاليا "التبديل الثاني". الحفظ عالية من مواقع الفسفرة بين البروتينات Rab قد يكون واحداً من الأسباب التي تجعل الأجسام المضادة فوسفوسبيسيفيك الاعتراف بالبروتينات Rab متميزة صعبة لجعل.

الفسفرة Rab8A حسب LRRK2 يحول دون ربط Rabin8، عامل تبادل النوكليوتيدات جوانين (مرفق البيئة العالمية) الذي ينشط Rab8A عن طريق تبادل منضم الناتج المحلي الإجمالي مع أنشئ15. كما يمنع الفسفرة Rab10 و Rab8A ب LRRK2 ربط مثبطات الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي (جديس)، التي تعتبر أساسية لتفعيل Rab البروتينات عن طريق استخراج البروتينات Rab الناتج المحلي الإجمالي زمنياً من الأغشية15. مجتمعة، هو الافتراض بأن الفسفرة Rab البروتينات التي LRRK2 يمنعهم من التنشيط على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة والآثار الفسيولوجية الفسفرة ما زالت غير واضحة.

فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة اخترعها كينوشيتا et al. في عام 2006: في هذا الأسلوب، اقترن الاكريلاميد تساهمي مع فالعلامه، والهلام جزيء التقاط الفوسفات مع تقارب عالية، الذي كوبوليميريزيد في صحيفة بيانات السلامة-الصفحة17. لأن الجزيئات فالعلامه في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تؤخر بشكل انتقائي التنقل الغرواني الكهربي للبروتينات فوسفوريلاتيد، فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يمكن فصل البروتينات فوسفوريلاتيد من غير فوسفوريلاتيد منها (الشكل 1). إذا كان هو فوسفوريلاتيد البروتين من الفائدة على بقايا متعددة، سيجري الاحتفال بسلم للفرق المقابلة لأشكال خلطات فوسفوريلاتيد. وفي حالة Rab10، نلاحظ الفرقة تحول واحد فقط، مما يشير إلى أن Rab10 هو فوسفوريلاتيد فقط في Thr73. الميزة الرئيسية للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على مدى إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أن Rab10 فوسفوريلاتيد ويمكن الكشف عنها بواسطة إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة غير الفسفرة محددة (أيالاعتراف مجموع Rab10) بعد نقله في الأغشية، وهو عموما أكثر تحديداً، وحساسة، والمتاحة من المصادر التجارية/الأكاديمية. وهناك ميزة أخرى لاستخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أنه يمكنك الحصول على تقدير تقريبي ستويتشيوميتري الفسفرة، التي من المستحيل إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أو بوصفها الأيضية للخلايا مع المشعة الفوسفات.

وبصرف النظر عن الاستخدام غير مكلفة فالعلامه الاكريلاميد وبعض التعديلات الطفيفة المتعلقة به، يتبع الأسلوب الحالي للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 عامة بروتوكول إيمونوبلوتينج.ولذلك، ينبغي واضحة وقابلة للتنفيذ بسهولة في أي المختبرات حيث إيمونوبلوتينج ممارسة معتادة، مع أي من أنواع العينات بما في ذلك البروتينات المنقاة، ليساتيس الخلية والأنسجة هوموجيناتيس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد عينة لمخزونات النشر الاستراتيجي – الصفحة P-العلامة

  1. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من 10 سم الأطباق التي تزرع الخلايا باستخدام شفط غسل الخلايا مع 5 مل دولبيكو مخزنة الفوسفات المالحة (دببس) بأول دببس إضافة إلى جانب الأطباق لتجنب الإخلال بطبقة الخلايا وصخرة الأطباق مرة أخرى يدوياً وعليها عدة مرات.
  2. إزالة وتجاهل دببس استخدام شفط إضافة 2 مل التربسين 0.25% (w/v) المخفف في دببس وروك بلطف الأطباق لتغطية طبقة الخلية. وضعت الأطباق شركة حاضنة2 (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2) لمدة 5 دقائق.
  3. وبعد بيبيتينج صعودا وهبوطاً باستخدام ماصة المتاح لتفريق الخلايا المنفصلة، جمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل وقياس كثافة الخلية باستخدام هيماتوسيتوميتير تحت مجهر18.
  4. تمييع الخلايا إلى5 2.5 × 10 خلايا/مل مع تعديل النسر المتوسطة دولبيكو (دميم) تستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين. إضافة 2 مل (5 × 105 خلايا) من تعليق خلية المخفف لكل بئر من لوحات 6-جيدا.
  5. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2).
  6. تعداء إلى خلايا HEK293
    ملاحظة: إذا كان الفسفرة Rab10 الذاتية لفحصها، انتقل إلى الخطوة 1، 7. يمكن الحصول على البلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول من المؤلفين عند الطلب. انظر تسلسل الجدول للمواد للحصول على معلومات موجزة و الشكل S1 لعينات من الحمض النووي.
    1. اليكووت 200 ميليلتر من دميم في أنابيب 1.5 مل.
    2. لكل أنبوبة، إضافة كلا ميكروغرام 0.266 (تركيز النهائي 1.33 ميكروغرام/مل) من بلازميد ترميز Rab10 هكتار و 1.066 ميكروغرام (تركيز النهائي 5.33 ميكروغرام/مل) بلازميد الترميز 3 × LRRK2 العلم من 500 ميكروغرام/مل بلازميد الأرصدة. ثم قم بإضافة 4 ميليلتر من الحل 1 ملغ/مل من بولييثيلينيميني (حله في 20 مم هيبيس-هيدروكسيد الصوديوم، درجة الحموضة 7.0) ومزيج الحل فورا قبل فورتيكسينج ل 5 ق.
    3. واسمحوا أنابيب الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وإضافة محتوى أنبوب واحد دروبويسي لواحد أيضا استخدام ميكروبيبيتي. روك بلطف ويدويًا لوحات الثقافة ذهابا وإيابا عدة مرات للسماح الخليط تعداء منتشر بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
  7. السماح للخلايا تنمو لآخر 24-36 ساعة في حاضنة2 CO (37 درجة مئوية، والجو هوميديفيد، 5% CO2).
  8. إذا كان الفسفرة Rab10 الذاتية لفحصها، يعامل الخلايا مع أو بدون LRRK2 مثبطات ح 1 قبل ليسينج الخلايا.
    1. إعداد حلول الأسهم من مثبطات LRRK2 بتذويب مثبطات في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في 10 ملم. ونحن نوصي باستخدام 2 معهد الطب العدلي و GSK2578215A، وهما مثبطات LRRK2 محددة للغاية وقوية. حلول تخزين المخزون في-80 درجة مئوية.
    2. إعداد مخزون العامل مثبطات بتمييع حلول الأسهم مع [دمس]: لمعهد الطب العدلي-2، إعداد 10 ميكرون و 30 ميكرومتر على LRRK2 الذاتية وأوفيريكسبريسيد، على التوالي. ل GSK2578215A، إعداد 1 و 3 ملم على LRRK2 الذاتية وأوفيريكسبريسيد، على التوالي.
    3. إضافة 2 ميليلتر على أرصدة العامل في معهد الطب العدلي-2 أو GSK2578215A إلى منتصف أحد جيدا باستخدام ميكروبيبيتي ولطف الصخور اللوحة يدوياً ذهابا وإيابا عدة مرات للسماح لمثبطات منتشر بالتساوي في جميع أنحاء البئر.
    4. إضافة 2 ميليلتر من [دمس] إلى بئر مختلفة كعنصر سلبي بطريقة مشابهة لمثبطات في خطوة 1.8.3.
    5. وضع اللوحات العودة إلى الحاضنة والثقافة الخلايا ح 1.
  9. الخلايا.
    1. وضع لوحات الثقافة على الجليد. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام. غسل الخلايا بأول مل 2 إضافة دببس إلى جانب الأطباق لتجنب الإخلال الخلية طبقة والصخور يدوياً الأطباق ذهابا وإيابا عدة مرات.
    2. إزالة وتجاهل في دببس، وإضافة إلى ميليلتر خلايا 100 من المخزن المؤقت تحلل (50 مم تريس-HCl pH 7-5، 1% (v/v) polyoxyethylene(10) أوكتيلفينيل الاثير، 1 مم عطا (جليكول-bis(2-aminoethylether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic)، أورثوفاناداتي الصوديوم 1 ملم، 50 ملم فلوريد الصوديوم، 10 مم β-جليسيروفوسفاتي، بيروفوسفات صوديوم 5 مم، 0.1 ميكروغرام/مل ميكروسيتين LR، السكروز 270 مم، ومثبطات البروتياز كوكتيل).
    3. إمالة، لوحات على الجليد وتتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة خلية جمع قدر خلية قدر الإمكان. جمع ليساتيس استخدام ميكروبيبيتي في أنابيب 1.5 مل (مبردة مسبقاً على الجليد).
      تنبيه: LR ميكروسيتين يمكن أن تكون قاتلة إذا ابتلع أو على اتصال بالجلد.
  10. تسمح هذه الأنابيب الوقوف على الجليد لمدة 10 دقائق لتحلل كامل. توضيح ليساتيس خلية بالطرد المركزي (20,000 ز ×، 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية) ونقل supernatants الجديدة 1.5 مل أنابيب مبردة مسبقاً على الجليد.
  11. قياس تركيز البروتين ليساتيس المطهرة (ميكروغرام/ميليلتر) بفحص برادفورد.
    1. ألبومين المصل البقري بإعداد معايير (BSA) (0.2 و 0.4، 0.6، 0.8 و 1 ملغ/مل) بتمييع الحل الأسهم مع الماء المقطر. تمييع ليساتيس الخلية الممسوحة بفحص مع الماء المقطر.
    2. وضع 5 ميليلتر/جيدا للمعايير جيش صرب البوسنة، فارغة (الماء المقطر)، وكل خلية المخفف ليساتي في لوحة 96-جيدا في ثلاث نسخ.
    3. إضافة من الكاشف المقايسة برادفورد باستخدام 12-قناة ميكروبيبيتي 150 ميليلتر/جيدا والسماح للوحة تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. قياس امتصاص في 595 نانومتر على قارئ لوحة ومقارنة بالمعايير جيش صرب البوسنة.
  12. إعداد 100 ميليلتر من عينات للحزب الديمقراطي الصربي صفحة. هو تركيز البروتين العينات 1 ميكروغرام/ميليلتر أوفيريكسبريسيد ها-Rab10 و 2 ميكروغرام/ميليلتر ل Rab10 الذاتية.
    1. استخدام تركيزات محددة كمياً من الخطوة 1.11.4، حساب الحجم (ميليلتر) ليساتيس الخلية يساوي 100 ميكروغرام (أوفيريكسبريسيد ها-Rab10) أو 200 ميكروغرام (Rab10 الذاتية) بتقسيم كمية البروتين (ميكروغرام 100 أو 200 ميكروغرام) بتركيز البروتين ليساتيس (μ ز/ميليلتر).
    2. إضافة 25 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت 4 × لايمملي (مم 62.5 تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8، 8% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، والغليسيرول 40% (v/v)، والأزرق bromophenol 0.02% (w/v)، 4% (v/v) β-ميركابتوثانول) إلى أنابيب 1.5 مل جديدة تحفظ في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة حجم المحسوبة الخلية ليساتيس لكل أنبوب ومزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    4. إحضار الحجم الإجمالي إلى 100 ميليلتر مع المخزن المؤقت لتحلل ومزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  13. الملحق مع 10 مم2 من الحركة إخماد عامل شيلاتينغ. أضف 1 ميليلتر من الحركة 500 ملم2. مزيج من فورتيكسينج ل 5 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد لا تكون العينات التي تحتوي على الحركة2 مناسبة للحزب الديمقراطي الصربي-صفحة عادية.
هذه الخطوة غير مطلوبة بسبب وجود عامل شيلاتينغ (مثل حمض الإيثيلين (يدتا)، عطا، إلخ) في المخزن المؤقت لتحلل. خلاف ذلك، سوف يمكن فصلها Mn2 + الأيونات بالإضافة إلى الاكريلاميد فالعلامه عملاء شيلاتينغ، والعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة لن تعمل بشكل صحيح.
  • تغلي جميع العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخزين العينات أدناه-20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ويمكن تخزين العينات مغلي ما يصل إلى 6 أشهر على الأقل.

    • 2-صب المواد الهلامية لمخزونات النشر الاستراتيجي – صفحة فعلامه

    ملاحظة: ينبغي الجل في اليوم نفسه كتشغيل المواد الهلامية. ويمكن إجراء الجل تحت ظروف الإضاءة المحيطة.

    1. إعداد 5 مم فالعلامه الاكريلاميد الأسهم الحل بأول حل 10 ملغ من مسحوق/خالص فالعلامه الاكريلاميد تماما مع 100 ميليلتر من الميثانول وثم يصل إلى 3.3 مل بإضافة الماء المقطر مزدوجة.
      ملاحظة: اكريلاميد فالعلامه حساسة للضوء. يجب تخزين الحل المعدة في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    2. لوحات نظيفة عادي وحقق برش الإيثانول 70% والمسح بمنشفة ورقية. تجميع لوحات هلام. أبعاد لوحات جل المستخدمة في هذا البروتوكول خاصة هي 80 أو 100 ملم طويلة من 100 مم. يتم وضع السليكون تنظيف الفواصل بين عادي وهي فرضت مسنن لوحات ولوحات تجميعها مع مقاطع الموثق.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي نوع من لوحات جل هذا العمل للحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية.
    3. وضع مشط لاستخدامها (المشط البلاستيك 17-جيدا) في لوحات جل تجميعها وعلامة على لوحة جل موضع الجزء السفلي من الآبار مع علامة دائمة.
    4. إعداد 10 مل مخلوط هلام الاكريلاميد 10% (الاكريلاميد 10% (w/v) (acrylamide:bis-اكريلاميد = فيها)، 375 مم تريس-HCl (pH 8.8)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: قد تختلف عن تركيز الاكريلاميد الأمثل والكواشف المستخدمة. فوق كبريتات الأمونيوم وتيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد) (الجزائرية) لا ينبغي أن يضاف في هذه المرحلة.
    5. إضافة 100 ميليلتر من الاكريلاميد علامة الرتبة ف-5 مم و 10 ميليلتر م 1 الحركة2 الحلول النهائية تركيزات 50 ميكرون و 100 ميكرومتر، على التوالي.
      ملاحظة: قد أيضا تختلف التركيزات المثلى من الاكريلاميد فالعلامه والحركة2 حسب والكواشف المستخدمة.
    6. إضافة 15 ميليلتر من تيميد إلى خليط جل بتركيز 0.15% (v/v) نهائياً وثم 50 ميليلتر من 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية بتركيز 0.05% (w/v) نهائي. مزيج جيد من قبل بلطف يحوم الأنبوب 5 s وصب في لوحات تجميعها فورا حتى ارتفاع أدناه 2 مم هو الموقف ملحوظ في الخطوة 2، 3.
    7. الطبقة 2-بروبانول على حل جل لشد الجزء العلوي من فصل المواد الهلامية بلطف.
    8. واسمحوا المواد الهلامية الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فإنه ليس من الضروري لحماية المواد الهلامية من الضوء.
      ملاحظة: قد يستغرق وقتاً أطول للمواد الهلامية لتعيين تحت درجة حرارة الغرفة الباردة. ولﻵﻻت هلام الخليط قبل إضافة تيميد ووكالة الأنباء الجزائرية يساعد على الإسراع بهذه الخطوة. ولهذا الغرض، يمكن إعداد خليط جل في قارورة Erlenmeyer 100-200 مل متصلاً شفط. ديغا الحل لمدة 10 دقائق.
    9. إزالة الطبقات 2-بروبانول بامتصاص مع منشفة ورقية.
    10. أغسل المساحة أعلى من المواد الهلامية بملء المساحة بماء مقطر من زجاجة غسيل وتجاهل المياه التي تتدفق خارج حوض. تكرار الغسيل 3 مرات.
    11. إزالة بقايا المياه المتبقية في مساحة أكبر من المواد الهلامية بامتصاص مع منشفة ورقية.
    12. إعداد 3 مل مزيج هلام الاكريلاميد 4% (الاكريلاميد 4% (w/v) (ج: crylamide:bis-اكريلاميد = فيها)، 125 ملم تريس-HCl (6.8 درجة الحموضة)، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في أنبوب 15 مل.
      ملاحظة: لا إضافة الاكريلاميد فالعلامه أو الحركة2 الحل إلى خليط جل التراص.
    13. إضافة 7.5 ميليلتر من تيميد وميليلتر 24 10% (w/v) وكالة الأنباء الجزائرية بتركيزات نهائية من 0.25% (v/v) و 0.08 في المائة (w/v)، على التوالي. مزيج جيد من قبل بلطف يحوم الأنبوبة s وصب الخليط على رأس جل فصل 5. فورا كومز المناسبة (17-جيدا امشاط من البلاستيك التي تستوعب ما يصل إلى 25 ميليلتر من العينات، على سبيل المثال).
    14. واسمحوا المواد الهلامية الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فإنه ليس من الضروري لحماية المواد الهلامية من الضوء. بعد تعيين المواد الهلامية التراص، تشغيلها دون مزيد من التخزين.

    3-الحزب الديمقراطي الصربي – صفحة و Immunoblotting

    1. إزالة الامشاط من المواد الهلامية. قم بإزالة الفواصل السيليكون ومن ثم مقاطع من المواد الهلامية.
    2. وضع المواد الهلامية مسبوك في جل الدبابات وإصلاحها الهلام للدبابة لقط مع مقاطع الموثق.
    3. من أجل تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس، 192 مم جليكاين، 0.1% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي) في السفلي والعلوي من المواد الهلامية. تنظيف الآبار بمسح المخزن المؤقت قيد التشغيل باستخدام 5 مل حقنه وابرة ز 21 لإزالة قطعة هلام.
    4. إزالة فقاعات الهواء من المساحة أسفل من الجل استخدام إبرة بنت تعلق على حقنه. جعل إبرة بنت، يدوياً ثني إبرة ز 21 في منتصف الإبرة حتى تصبح الزاوية بين الطرف وقاعدة الإبرة 30-45 درجة مئوية.
    5. تدور أسفل رواسب تسبب بإضافة الحركة2 في 20,000 × ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحصول على عينات واضحة.
    6. تحميل 10 ميكروغرام البروتينات للكشف عن الفسفرة Rab10 أوفيريكسبريسيد و 30 ميكروغرام البروتينات ل Rab10 الذاتية.
      ملاحظة: من المهم لتحميل تساوي حجم العينات في جميع الآبار. يجب أن يتم تحميل حارات فارغة مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة نموذج المخزن المؤقت لايمملي × 1 ل. إذا كانت العينات تحتوي على الحركة2، إضافة نفس تركيز الحركة2 لعينات وهمية.
    7. تحميل جيدا مع علامة وزن الجزيئي (MWM) ينبغي أيضا استكمال مع المخزن المؤقت لنموذج صحيفة بيانات السلامة-الصفحة 1 × لايمملي حتى حجم العينات تحميل هو نفسه في جميع الآبار.
      ملاحظة: مرة أخرى، إذا كانت العينات تحتوي على الحركة2، إضافة نفس تركيز الحركة2 إلى MWM. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم MWM يدتا خالية.
    8. تشغيل المواد الهلامية في 50 الخامس التراص (حوالي 30 دقيقة) حتى الجبهة صبغ يعبر في جل الانفصال.
    9. بعد كومة العينات، تغيير الجهد إلى 120 الخامس للانفصال حتى تصل إلى الجبهة صبغ الجزء السفلي من المواد الهلامية (حوالي 50 و 80 دقيقة على 80 و 100 ملم طويلة الجل، على التوالي).
      ملاحظة: نمط الهجرة MWM يتوقع أن يكون مختلفاً عن ذلك في المواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية. لا ينبغي أن تستخدم لتقدير الوزن الجزيئي للبروتينات في الهلام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ولكن يمكن استخدامها للتحقق من إمكانية تكرار نتائج الجل فالعلامه. الرجوع إلى مناقشة للتفاصيل.
    10. غسل المواد الهلامية لإزالة الحركة2 من المواد الهلامية.
      1. من أجل النقل المخزن المؤقت (48 مم تريس، 39 مم جليكاين، الميثانول 20% (v/v)) التي تحتوي على 10 مم يدتا و 0.05% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي في حاوية (مثلاً، كبيرة تزن قوارب).
    حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية جل.
  • إزالة المواد الهلامية الانفصال من لوحات جل ووضع جل واحد في حاوية واحدة. تجاهل هلام التراص.
  • اترك المواد الهلامية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  • كرر الخطوات الغسيل في المجموع 3 مرات.
    ملاحظة: استخدام المخزن المؤقت الطازجة لكل غسل.
  • غسل الهلام مرة واحدة لمدة 10 دقيقة مع نقل المخزن المؤقت التي تحتوي على 0.05% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي لإزالة يدتا. حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية جل.
  • الكهربائية والنقل للأغشية ثنائي الفلوريد (PVDF) النيتروسليلوز أو الفينيليدن باستخدام الدبابات الرطب.
    1. ضع ورقة تصفية (10 × 7 سم) على وسادة الأسفنج لنقل. وضع الجل على ورق الترشيح. تأكد من أن هناك لا فقاعات الهواء بين ورق الترشيح والهلام.
    2. وضع غشاء (10 × 7 سم) على الجل والتأكد من عدم وجود لا فقاعات الهواء بين الجل والغشاء.
    3. وضع ورقة تصفية أخرى (10 × 7 سم) على الغشاء، ومرة أخرى، تأكد من هناك لا فقاعات الهواء بين الغشاء وورق الترشيح.
    4. وضع آخر الأسفنج لوحة على ورق الترشيح. وضع كومة أوراق غشاء/عامل تصفية في كاسيت لنقل.
    5. وضع الكاسيت في خزان نقل، والتأكد من أن الغشاء يقع بين الجل والانود مشحونة بشكل إيجابي.
    6. الاتصال الدبابات لإمدادات طاقة ووضع الخزان في مربع رغوة ستيرين مليء بالماء المثلج. بدء نقل 100 الخامس لمدة 180 دقيقة.
      ملاحظة: النقل المطول من الضروري نقل البروتينات من الجل فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ليست فعالة مثل ذلك من المواد الهلامية الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عادية. كفاءة التبريد ضروري لتجنب ذوبان المواد الهلامية أثناء النقل.
  • التحقق من نقل
    1. إزالة الأغشية من المواد الهلامية استخدام الملقط ونقع في الأغشية في حل ق بونسو (0.1% (w/v) S بونسو، حامض الخليك 5% (v/v)) لوصمة عار البروتينات المنقولة على الأغشية في وعاء من بلاستيك. حجم الحل ينبغي أن يكون كافياً لتغطية غشاء.
    2. احتضان الأغشية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بالهز يدوياً.
      ملاحظة: ينبغي أن تصبح مرئية في كل حارة سلما عصابات.
    3. التقاط الغشاء خارج الحل المصبوغة بملاقط وانظر إذا كان قد سلم العصابات نمط موحد وكثافة في كل حارة فيها العينات التي تم تحميلها.
    4. بعد التحقق من تلطيخ، إزالة الحل المصبوغة وإضافة تبسة المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، مونولوراتي بوليوكسيثيلينيسوربيتان 0.1% (v/v)). حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية غشاء.
      ملاحظة: الحل ق بونسو يمكن جمعها وإعادة استخدامه عدة مرات.
    5. صخرة في الأغشية في تبسة على شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة حتى تبقى لا أشرطة مرئية في الأغشية.
    6. كرر الخطوة الغسيل مع تبسة الطازجة لمدة 5 دقائق.
  • إزالة وتجاهل في تبسة. كتلة بإضافة اللبن المقشود 5% (w/v) المذابة في تبسة والتأرجح في شاكر (~ 60 لفة في الدقيقة) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. حجم الحل الحظر ينبغي أن تكون كافية لتغطية غشاء.
  • إعداد حلول جسم الأولية بتمييع الابتدائي الأجسام المضادة (الأجسام المضادة Rab10 المضادة ل Rab10 الذاتية) وجسم ها المضادة أوفيريكسبريسيد ها-Rab10 في 10 مل في الغشاء الحل حظر (انظر الجدول للمواد لتركيزات).
  • إزالة وتجاهل حل حظر وإضافة جسم الأولية. احتضان الأغشية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  • إزالة الحل جسم الابتدائي وإضافة تبسة لغسل الأغشية. حجم المخزن المؤقت يجب أن تكون كافية لتغطية غشاء.
  • احتضان الأغشية لمدة 5 دقائق على شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة. تكرار الغسيل (الخطوة 3.16) في المجموع 3 مرات استخدام تبست جديدة في كل مرة.
  • إعداد حلول جسم الثانوية بتمييع جسم الثانوي المسمى مع الفجل البيروكسيديز (HRP) في 10 مل في غشاء من عرقلة الحل. استخدم الأرنب المضادة مفتش الأضداد المسمى ببرنامج الصحة الإنجابية للأغشية سبر مع الأجسام المضادة Rab10، والماوس المضادة مفتش الأضداد المسمى ببرنامج الصحة الإنجابية لسبر مع مكافحة-ها جسم (انظر الجدول للمواد لتركيز).
  • إزالة وتجاهل تبست بعد الغسيل الثالث وإضافة حل جسم الثانوية. احتضان الأغشية في شاكر هزاز (~ 60 لفة في الدقيقة) ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  • غسل الأغشية في تبست لمدة 10 دقيقة تكرار الغسيل خطوة في المجموع 3 مرات، مماثلة للخطوة 3.17.
  • تطوير الأغشية استخدام تشيميلومينيسسينسي المحسنة (القامة).
    ملاحظة: قد تختلف وقت التعرض في الحل القامة والنظام المستخدم للكشف عن تشيميلومينيسسينسي.
    1. قم بتشغيل تصوير مزودة بكاميرا جهاز اقتران (CCD) وكمبيوتر متصل جهاز التصوير. بدء تشغيل برنامج السيطرة للتصوير. انتظر حتى وصلت درجة حرارة الكاميرا CCD-25 درجة مئوية.
    2. وضع 1 مل الحل مسافنة لغشاء واحد على التفاف بلاستيك تنتشر على مقاعد البدلاء.
    3. وضع غشاء هلام-جانب-متابعة لحل القامة وثم بسرعة اقلب أنه حيث أن كلا الجانبين في الأغشية المغلفة مع الحل.
    4. التقاط الغشاء واستنزاف بالسماح لجانب واحد من لمس الغشاء منشفة ورقية ل 5 s.
    5. وضع الغشاء بين الأفلام واضحة (مثلاً، جيوب ورقة واضحة).
      ملاحظة: لا ينصح غلاف بلاستيكي للالتفاف على الأغشية. الأفلام واضحة تستخدم لتغليف الغشاء يجب أن تكون مسطحة قدر الإمكان دون تجاعيد مرئية لتجنب تفاوت الخلفية.
    6. وضع الغشاء في علبة سوداء. وضع العلبة التصوير وإغلاق الباب.
    7. انقر فوق الزر "التركيز" في إطار البرنامج عنصر التحكم. تحقق من أن يتم وضع الغشاء بشكل صحيح. انقر فوق الزر "إرجاع".
    8. حدد "الدقة" من أجل "نوع التعرض". حدد "دليل" ل "وقت التعرض" وتعيين وقت التعرض إلى 1 ثانية.
    9. حدد "عالية" من أجل "حساسية/القرار". ترك "إضافة صورة الرقمنة" غير محدد. انقر فوق الزر "ابدأ" لالتقاط صورة.
    10. حفظ الصورة التي ظهرت على الشاشة في الكمبيوتر كملف TIFF.
    11. تكرار التقاط الصور مع وقت التعرض من 1، 3، 10، 30، 60، 90، 120، 150 ق وتصل إلى 180 s. عند التقاط الصورة الأخيرة، راجع "إضافة الصورة رقمنة" حتى يمكن أن تؤخذ الصورة الرقمية، ولا تشيميلومينيسسينسي، للغشاء في نفس الوقت.
    12. حدد أفضل صورة مع مجموعة ديناميكية أكبر ودون أي كسل تشبع (يظهر باللون الأحمر) في النطاقات الفائدة.
      ملاحظة: يمكن أن تستخدم أفلام الأشعة السينية التقليدية أيضا للكشف عن19.

    • Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    النتائج

    نظام أوفيريكسبريشن: الفسفرة من ها Rab10 3 × العلم-LRRK2 في HEK293 الخلايا:

    تم transfected الخلايا HEK293 مع 0.266 ميكروغرام من Rab10 هكتار البرية من نوع و 1.066 ميكروغرام من 3 × العلم-LRRK2 (المسخ كيناز نشط، والبرية من نوع (K1906M)، أو طفرات FPD). بحثت الفسفرة Rab10 فالوسم الحزب ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    وهنا يصف لنا طريقة سهلة وقوية للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 على المستويات المحلية استناداً إلى منهجية العلامة ف. لأن جسم المتوفرة حاليا ضد Rab10 فوسفوريلاتيد يعمل فقط مع البروتينات overexpressed15، هذا الأسلوب استخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هو السبيل الوحيد لتقييم مستويا...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    ونحن نشكر الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو، اليابان) يرجى تقديم والبلازميدات ترميز WT 3xFLAG-LRRK2، وطفرات. كما نشكر الدكتور داريو اليسي (جامعة داندي، المملكة المتحدة) لتوفير يرجى MLi-2 وبلازميد ترميز Rab10 هكتار. وأيد هذا العمل "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم JP17K08265 (غي).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagents
    Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)homemade150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving
    Sodium chlorideNacalai Tesque31320-34
    Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-WaterWako196-02835
    Potassium chlorideWako163-03545
    Potassium Dihydrogen PhosphateWako169-04245
    2.5% Trypsin (10X)Sigma-AldrichT4549Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution
    Dulbecco's modified Eagle medium
    (DMEM)    		Wako044-29765
    Fetal bovine serumBioWestS1560Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
    Penicillin-Streptomycin (100X)Wako168-23191
    HEPESWako342-01375
    Sodium hydroxideWako198-13765
    Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)PolySciences, Inc.24765-1Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH
    Dimethyl sulfoxideWako045-28335
    TrisSTARRSP-THA500G
    Hydrochloric acidWako080-01066
    Polyoxyethylene(10) Octylphenyl EtherWako160-24751Equivalent to Triton X-100
    Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)Wako346-01312
    Sodium orthovanadate(V)Wako198-09752
    Sodium fluorideKanto Chemical37174-20
    β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt PentahydrateNacalai Tesque17103-82
    Sodium pyrophosphate decahydrateKokusan Chemical2113899
    Microcystin-LRWako136-12241
    SucroseWako196-00015
    Complete EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11873580001Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis
    Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23200
    Sodium dodecyl sulfateNacalai Tesque31607-65
    GlycerolWako075-00616
    Bromophenol blueWako021-02911
    β-mercaptoethanolKanto Chemical25099-00
    EthanolWako056-06967
    MethanolWako136-01837
    Phosphate-binding tag acrylamideWakoAAL-107P-tag acrylamide
    40% (w/v) acrylamide solutionNacalai Tesque06119-45Acrylamide:Bis = 29:1
    Tetramethylethylenediamine (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    Ammonium persulfate (APS)Wako016-0802110% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water
    2-propanolWako166-04831
    Manganese chloride tetrahydrateSigma-AldrichM3634
    Precision Plus Protein Prestained StandardBio-Rad1610374, 1610373, 1610377Molecular weight marker used in the protocol
    WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker IIIWako230-02461
    GlycineNacalai Tesque17109-64
    Amersham Protran NC 0.45GE Healthcare10600007Nitrocellulose membrane
    Durapore Membrane FilterEMD MilliporeGVHP00010PVDF membrane
    Filter Papers No.1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    Acetic acidWako017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379polyoxyethylenesorbitan monolaurate
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Wako345-01865
    Skim milk powderDifco Laboratories232100
    ImmunostarWako291-55203ECL solution (Normal sensitivity)
    Immunostar LDWako290-69904ECL solution (High sensitivity)
    CBB staining solutionhomemade1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water
    CBB R-250Wako031-17922
    CBB destaining solutionhomemade12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Antibodies
    anti-HA antibodySigma-Aldrich11583816001Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting.
    anti-Rab10 antibodyCell Signaling Technology#8127Used at 1:1000 for immunoblotting.
    Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
    anti-pSer935 antibodyAbcamab133450Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-LRRK2 antibodyAbcamab133518Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-α-tubulin antibodySigma-AldrichT9026Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
    anti-GAPDH antibodySanta-Cruzsc-32233Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch515-035-003Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
    Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-035-003Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Inhibitors
    GSK2578215AMedChem ExpressHY-13237Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
    MLi-2Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Plasmids
    Rab10/pcDNA5 FRT TO HAProvided by Dr Dario Alessi
    (University of Dundee)    		This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.
    LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.
    LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.
    LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Equipments
    CO2 incubatorThermo Fisher ScientificForma Series II 3110 Water-Jacketed
    Auto PipetteDrummondPipet-Aid PA-400
    Micropipette P10Nichiryo00-NPX2-100.5–10 μL
    Micropipette P200Nichiryo00-NPX2-20020–200 μL
    Micropipette P1000Nichiryo00-NPX2-1000100–1000 μL
    Tips for micropipette P10STARRST-481LCRSTSterile
    Tips for micropipette P200FUKAEKASEI1201-705YSSterile
    Tips for micropipette P1000STARRST-4810BRSTSterile
    5 mL disporsable pipetteGreiner606180Sterile
    10 mL disporsable pipetteGreiner607180Sterile
    25 mL disporsable pipetteFalcon357535Sterile
    HematocytometerSunlead GlassA126Improved Neubeuer
    MicroscopeOlympusCKX53
    10 cm dishesFalcon353003For tissue culture
    6-well platesAGC Techno Glass3810-006For tissue culture
    Vortex mixerScientific IndustriesVortex-Genie 2
    Cell scrapersSumitomo BakeliteMS-93100
    1.5 mL tubesSTARRSV-MTT1.5
    15 mL tubesAGC Techno Glass2323-015
    50 mL tubesAGC Techno Glass2343-050
    CentrifugesTOMYMX-307
    96-well platesGreiner655061Not for tissue culture
    Plate readerMolecular DevicesSpectraMax M2e
    SDS–PAGE tanksNihon EidoNA-1010
    Transfer tanksNihon EidoNA-1510B
    Gel plates (notched)Nihon EidoNA-1000-1
    Gel plates (plain)Nihon EidoNA-1000-2
    Silicon spacersNihon EidoNA-1000-16
    17-well combsNihon EidoCustom made
    Binder clipsNihon EidoNA-1000-15
    5 mL syringeTerumoSS-05SZ
    21GTerumoNN-2138R
    Power Station 1000 VCATTOAE-8450Power supply for SDS–PAGE and transfer
    Large weighing boatsIna OptikaAS-DL
    Plastic containersAS ONEPS CASE No.410 x 80 x 50 mm
    Rocking shakerTitechNR-10
    Styrene foam boxgenericThe internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).
    ImageQuant LAS-4000GE HealthcareAn imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL

    References

    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130 2 Rab10

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved