Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Özet

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Özet

Lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) mutasyonların ailesel Parkinson hastalığı ile (FPD) bağlanacak şekilde gösterilmiştir. LRRK2 kinaz aktivitesinin anormal harekete geçirmek PD patogenezinde karıştığı olmuştur, bu LRRK2 kinaz aktivitesinin fizyolojik düzeylerini değerlendirmek için bir yöntem kurmak için gereklidir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda LRRK2 fizyolojik koşullar altında Rab10, Rab GTPazlar ailesinin üyeleri phosphorylates ortaya koydu. Her ne kadar tarafından LRRK2 kültürlü hücrelerde endojen Rab10 fosforilasyon tarafından kütle spektrometresi tespit edilemedi, immunoblotting için şu anda mevcut fosforilasyon özgü antikorların zavallı duyarlılık nedeniyle tarafından tespit etmek zor oldu Rab10. İşte, biz basit bir tarif Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 endojen düzeylerini tespit yöntemi bir fosfat bağlayıcı etiketi (P-etiket), ile birlikte Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) kullanan immunoblotting dayalı olan N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- tris (pyridin-2-yl-metil) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. Mevcut Protokolü sadece P etiketi kullanan metodoloji örneği sağlar ama aynı zamanda hücre ve dokulara LRRK2 aşağı akım sinyal mutasyonlar yanı sıra inhibitörü tedavisi/yönetim veya herhangi bir diğer etken nasıl değiştirmek değerlendirmek sağlar .

Giriş

PD en sık görülen nörodejeneratif hastalıklar, ağırlıklı olarak orta dopaminerjik nöronlarda disfonksiyon yaşlı insanlar¹motor sistemleri sonuçlanan etkileyen biridir. Hastaların çoğunda PD sporadik bir şekilde geliştirmek iken hastalığı devralan aileler. Bazı genlerdeki mutasyonlar FPD²ile bağlantılı olarak tespit edilmiştir. FPD için sorumlu gen biridir LRRK2, sekiz missense PARK8 denilen bir baskın devralınan FPD bağlı mutasyonlar (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ve I2020T) şimdiye bildirilen^3,4,5olmuştur. Çeşitli genom çapında dernek çalışmaları (GWAS) sporadik PD hastaların da LRRK2 odağı genomik varyasyonları bir risk faktörü PD, anormallik LRRK2 işlevindeki ateş sporadik hem de yaygın bir nedeni olduğunu düşündüren için belirledik ve PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 lösin yönünden zengin tekrar alanının bir etki alanı, GTP bağlayıcı Ras karmaşık proteinleri (ROC) etki alanı, C-terminal ROC (COR) etki alanı, bir serin/treonin protein kinaz etki ve WD40 tekrar etki alanı⁹oluşan büyük bir protein (2527 amino asitler) olduğunu. Sekiz FPD mutasyonlar bu işlevsel etki alanlarında bulun; N1437H ve R1441C/G/H/S Y1699C COR etki alanında, G2019S ve I2020T kinaz etki alanındaki ROC etki alanında. Bu yana en sık mutasyon PD hastalar^10,11,12' bulundu, G2019S mutasyon LRRK2 kinaz aktivitesinin 2-3 kat vitro¹³tarafından artırır, onaylanmadığına karar LRRK2 substrate(s) fosforilasyon anormal artış nöronlar için toksik. Ancak, fizyolojik ilgili LRRK2 yüzeylerde fosforilasyon hasta türetilmiş örneklerinde değerlendiren yöntemler eksikliği nedeniyle ailesel/sporadik PD hastalarında değişmiş olup olmadığını incelemek mümkün olmuştur.

Protein fosforilasyon genellikle immunoblotting ya da özellikle devletin fosforile proteinlerin veya kitle spektrometrik analizi tarafından tanıma antikorları kullanarak enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tarafından algılanır. Ancak, eski strateji fosforilasyon özgü antikor oluşturma zorlukları nedeniyle bazen uygulanamaz. Radyoaktif fosfat içeren hücrelerin metabolik etiketleme fosforilasyon özel antikorlar kolayca kullanılabilir olduğunda fosforilasyon fizyolojik düzeyleri incelemek için başka bir seçenektir. Ancak, radyoaktif malzeme büyük miktarda gerektirir ve bu nedenle bazı özel ekipman radioprotection¹⁴için içerir. Kitle spektrometrik analizi daha duyarlı bu immunochemical yöntemlerine göre ve protein fosforilasyon analiz popüler oldu. Ancak, örnek hazırlıktır zaman alıcı ve pahalı aletler analiz için gereklidir.

LRRK2 için doğrudan fizyolojik yüzeylerde bir büyük ölçekli phosphoproteomic analiz¹⁵sonucuna dayalı olarak bir alt Rab10 ve Rab8 de dahil olmak üzere Rab GTPazlar ailesinin son zamanlarda bildirildi. O zaman Rab10 fosforilasyon FPD mutasyonlar fare embriyonik fibroblastlar ve fareler¹⁶knockin akciğerler yükseltilmiştir gösterdi. Bu raporda, biz bir Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) istihdam için seçti-P-etiket molekül Rab10 fosforilasyon, endojen düzeylerini saptamak için SDS-sayfa jelleri (P-tan SDS-sayfası) içine co polimerli yöntemi dayalı Çünkü son derece hassas antikor için fosforile Rab10 belirli hala eksik. Şu anda kullanılabilir antikorlar kötü selectivity nedeniyle endojen Rab8 fosforilasyon için toplam Rab8 algılamak başarısız oldu. Bu nedenle, Rab10 fosforilasyon üzerinde odaklanmaya karar verdi. LRRK2 Rab10 Thr73 son derece korunmuş geçiş"II" bölgesinin ortasında bulma phosphorylates. Yüksek koruma Rab proteinler arasında fosforilasyon sitelerin neden farklı Rab proteinler tanıma phosphospecific antikorlar yapmak zor nedenlerinden biri olabilir.

Rab8A LRRK2 tarafından fosforilasyon Rabin8, GTP¹⁵ile ilişkili GSYİH değiş tokuş ederek Rab8A etkinleştiren bir guanin nükleotid Satım faktörü (GEF) bağlama engeller. Fosforilasyon, Rab10 ve LRRK2 tarafından Rab8A de GSYİH bağlı Rab proteinler membran¹⁵ayıklayarak Rab proteinleri harekete geçirmek için gerekli olan GSYİH-ayrılma inhibitörleri (GDIs), bağlama engeller. Topluca, hassas moleküler mekanizması ve fosforilasyon fizyolojik sonuçları belirsiz kalır, ancak fosforilasyon tarafından LRRK2 Rab proteinlerin onları aktivasyon engellediğini onaylanmadığına karar.

P-etiket SDS-sayfa 2006 yılında Kinoshita vd tarafından icat edilmiştir: Bu yöntemde, Akrilamid kovalent P etiketi ile birleştiğinde, bir molekül fosfat SDS-sayfa copolymerized yüksek benzeşimli yakalama¹⁷jelleri. SDS-sayfa jel P etiketi molekülleri seçerek fosforile proteinlerin elektroforetik hareketlilik geri zekalı çünkü P etiketi SDS-sayfa fosforile proteinlerin sigara fosforile olanlardan ayırabilirsiniz (şekil 1). Faiz protein üzerinde birden fazla artıkları fosforile Eğer bir merdiven differentially fosforile biçimlerine karşılık gelen gruplarından gözlenir. Rab10 söz konusu olduğunda, biz Rab10 sadece Thr73 fosforile gösteren tek bir grup değiştirdi, gözlemlemek. İmmunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile büyük avantaj P etiketi SDS-sayfanın fosforile Rab10 fosforilasyon spesifik antikorlar (Yani, tanıma toplam Rab10) ile immunoblotting tarafından tespit edilebilir olduğunu membranlar transfer sonra genellikle ticari/akademik kaynaklardan daha belirli, hassas ve kullanılabilir olduğu. Bir immunoblotting fosforilasyon özel antikorlar ile veya radyoaktif hücrelerle metabolik etiketlerine göre hangi imkansız fosforilasyon, stoichiometry yaklaşık tahmini elde edebilirsiniz P etiketi SDS-sayfa kullanmanın bir diğer avantajı olduğunu fosfatlar.

Ucuz P etiketi Akrilamid ve bazı küçük değişiklikler ile ilgili kullanımı dışında Rab10 fosforilasyon LRRK2 tarafından algılanması için mevcut yöntemi immunoblotting genel bir protokol izler.Bu nedenle, immunoblotting örnek saf proteinler, hücre lysates ve doku homogenates dahil herhangi bir türde her zamanki bir uygulama nerede herhangi bir laboratuarlarında basit ve kolayca çalıştırılabilir olması gerektiği.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. numune hazırlama için P-tan SDS-sayfası

1. Kaldırmak ve hücreleri bir emme kullanarak yetiştirilmektedir 10 cm yemekleri medyadan atmak ve 5 mL Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) tarafından ilk ekleyerek DPBS bulaşıkları tarafına hücre katmanı rahatsız edici önlemek için hücrelerle yıkama ve el ile geri yemekleri rock ve birkaç defa ileri.
2. Kaldırmak ve bir emme kullanarak DPBS atmak ve DPBS içinde seyreltilmiş %0.25 (w/v) tripsin 2 mL ekleyin ve hafifçe hücre katmanı kapsayacak şekilde yemekleri rock. Bulaşıkları bir CO₂ kuluçka (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO₂) 5 min için içine koymak.
3. Müstakil hücreleri kırmak için tek kullanımlık bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetting sonra hücre süspansiyon 15 mL tüp içine toplamak ve bir hematocytometer bir mikroskop¹⁸altında kullanarak hücre yoğunluğu ölçün.
4. % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile desteklenmiş 2.5 × 10⁵ hücre/mL Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) ile hücrelere sulandırmak. 2 mL (5 × 10⁵ hücreleri) seyreltilmiş hücre süspansiyon 6-şey plakaları her şey için ekleyin.
5. Gecede bir CO₂ kuluçka (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO₂) hücreleri büyümek.
6. HEK293 hücre içine transfection
   Not: endojen Rab10 fosforilasyon incelenmesine ise 1.7 adıma devam edin. Plazmid bu protokol için kullanılan istek üzerine yazarlardan elde edilebilir. Kısa bilgi için Malzemeler tablo ve Şekil S1 DNA'ları için sequences konusuna bakın.
   1. DMEM aliquot 200 µL 1,5 mL tüpler içine.
   2. Her tüp için kodlama HA-Rab10 ve 1,066 µg (son konsantrasyon 5,33 µg/mL) bir plazmid kodlama 3 × bayrak-LRRK2 500 µg/mL plazmid hisse senetleri üzerinden bir plazmid, her iki 0,266 µg (son konsantrasyon 1.33 µg/mL) ekleyin. O zaman 4 µL (20 mM HEPES-NaOH, pH 7,0 çözünmüş) polyethyleneimine 1 mg/mL çözüm ve hemen vortexing 5 tarafından çözüm karıştırın s.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakikadır stand ve bir tüp içeriğini dropwise bir de bir micropipette kullanarak eklemek tüp ver. Yavaşça ve el ile Kültür tabaklar ileri geri birkaç kez iyi eşit olarak diffüz transfection karışım izin için rock.
7. Başka bir 24-36 h (37 ° C, oksijen hava, % 5 CO₂) CO₂ kuluçka için büyümek hücreleri izin.
8. Endojen Rab10 fosforilasyon incelenmesine ise, hücre ve 1 h için LRRK2 inhibitörleri olmayan hücreleri lysing önce tedavi.
   1. Hisse senedi çözümleri LRRK2 inhibitörleri, Dimetil sülfoksit (DMSO) 10 mm inhibitörleri çözülerek hazırlayın. Mlı-2 ve GSK2578215A, son derece özel ve güçlü LRRK2 inhibitörleri kullanmanızı öneririz. Hisse senedi çözümleri-80 ° C'de depolayın
   2. İnhibitörleri çalışma stokları DMSO hisse senedi çözümlerle sulandrarak hazırlamak: mlı-2, sırasıyla 10 µM ve 30 µM endojen ve overexpressed LRRK2 için hazır olun. GSK2578215A için 1 mM ve 3 mM endojen ve overexpressed LRRK2 için sırasıyla hazırlayın.
   3. 2 µL mlı-2 veya GSK2578215A çalışma stoklarının bir de kullanarak bir micropipette ortasına kadar ekleyin ve hafifçe plaka kuyu eşit olarak diffüz inhibitörleri bildirmek için el ile ileri geri birkaç kez rock.
   4. 2 µL DMSO, farklı bir şey adım 1.8.3 inhibitörü için benzer bir şekilde bir negatif kontrol ekleyin.
   5. Tabakları da kuluçka için geri koy ve 1 h için hücreleri kültür.
9. Hücreleri parçalayıcı.
   1. Kültür plakaları buza koy. Kaldırmak ve medya atın. Hücreleri ilk ekleyerek 2 hücre rahatsız edici önlemek için DPBS bulaşıkları tarafına katman ve el ile ileri geri birkaç kez bulaşıkları rock mL tarafından yıkayın.
   2. Kaldırın ve DPBS atmak ve lizis arabellek hücreleri 100 µL ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 7.5, %1 (v/v) polyoxyethylene(10) octylphenyl eter, 1 mM EGTA (etilen glikol-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic asit), 1 mM sodyum orthovanadate, 50 mM sodyum florür, 10 mM β-gliserofosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.1 µg/mL microcystin-LR, 270 mM Sükroz, proteaz inhibitörü kokteyl).
   3. Buz tabakalarına eğilme ve kadar hücre olabildiğince lysate toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyorum. (Buz üzerinde önceden soğutulmuş) 1,5 mL tüpler içine bir micropipette kullanarak lysates toplamak.
      Dikkat: Microcystin-LR yuttu veya cilt ile temasında ölümcül olabilir.
10. Tam lizis için 10 dakika buz üzerinde durmak tüpleri ver. Santrifüjü (20.000 × g, 10 min 4 ° C'de) tarafından hücre lysates açıklamak ve buz üzerinde önceden soğutulmuş yeni 1,5 mL tüpler supernatants aktarmak.
11. Bradford tahlil tarafından temizlenen lysates ölçü protein konsantrasyonu (µg/µL).
    1. Sığır serum albumin (BSA) standartları hazırlamak (0,2 0,4, 0.6, 0.8 ve 1 mg/mL) saf su ile hisse senedi çözüm sulandrarak tarafından. Tarafından temizlenen hücrenin lysates 20 seyreltik distile su ile.
    2. 5 µL/iyi BSA standartları, boş (distile su) ve seyreltilmiş her hücre lysate nüsha bir 96-şey tabağına koyun.
    3. 150 µL/iyi 12 kanallı micropipette kullanarak Bradford tahlil reaktif eklemek ve oda sıcaklığında 5 min için stand plaka.
    4. 595 Absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu ve BSA standartları Karşılaştırılacak.
12. Örneklerin 100 µL SDS-sayfa için hazırlayın. Örnekleri protein konsantrasyonu 1 µg/µL overexpressed HA-Rab10 için ve 2 µg/µL endojen Rab10 için olduğunu.
    1. Adım 1.11.4 quantified konsantrasyonları kullanarak, birim (µL) hücre lysates 100 µg (overexpressed HA-Rab10) eşdeğer veya 200 µg (endojen Rab10) protein miktar (100 µg veya 200 µg) bölünmesi ile lysates (µ protein konsantrasyonu tarafından hesaplama g/µL).
    2. Oda sıcaklığında muhafaza yeni 1,5 mL tüpler için 4 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabelleği (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 8 (w/v) SDS, % 40 (v/v) gliserol, %0.02 (w/v) bromophenol mavi, %4 (v/v) β-mercaptoethanol) 25 µL ekleyin.
    3. Hücrenin her lysates tüp ve mix vortexing 5 tarafından hesaplanan birim ekleme, oda sıcaklığında s.
    4. Vortexing için 5 tarafından 100 µL lizis arabellek ve karışımı ile Toplam hacim getirmek s, oda sıcaklığında.
13. 10 mM ile bağlayıcı Ajan gidermek için MnCl₂ ek. 500 mM MnCl₂1 µL ekleyin. Karıştırmak yanında vortexing için 5 s, oda sıcaklığında.
    Not: Örnekleri içeren MnCl₂ normal SDS-sayfa için uygun olmayabilir.

Bu adım şelat Ajan varlığı nedeniyle gereklidir (ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), EGTA, gibi vb) lizis arabellek. Aksi takdirde, P-etiket Akrilamid birleştiğinde Mn^{2 +} iyonları şelat ajanlar tarafından ayrışmış ve P-tan SDS-sayfası düzgün çalışmaz.

Tüm örnekleri 5 min için 100 ° C'de kaynatın ve örnekleri-20 ° C altında kullanmak kadar saklamak. Haşlanmış örnekleri en az 6 ay kadar saklanabilir.

2. döküm jelleri P-tan SDS-sayfası için

Not: Jelleri jelleri çalışan olarak aynı gün yapılmalıdır. Jelleri ortam ışık koşulları altında yapılabilir.

1. 5 mM P etiketi Akrilamid hisse senedi çözüm toz/kalın P etiketi Akrilamid 10 mg 100 µL metanol ile tamamen çözülerek hazırlamak ve ardından Çift Kişilik distile su ekleyerek için 3,3 mL alın.
   Not: P-etiket Akrilamid ışığa duyarlı olduğunu. Hazır çözüm kadar kullanmak karanlıkta 4 ° C'de muhafaza edilmelidir.
2. % 70 etanol püskürtme ve bir kağıt havlu ile silinerek tarafından temiz hem düz hem çentikli tabaklar. Jel levha bir araya getirin. Bu belirli protokol için kullanılan jel levha boyutlarının 80 olduğundan ya da 100 mm 100 mm genişliğinde uzun. Temiz silikon çubukları arasında düz konur ve çentikli plakaları ve birleştirilmiş plakaları bağlayıcı klipleri ile sabitlenmiş.
   Not: İş sıradan SDS-sayfa için jel kaplamalar her türlü kullanılabilir.
3. Bir tarak koymak (17-şey plastik tarak) monte jel Kaplamalar ve mark jel tabakta kuyu dibinde konumunu içine kalıcı bir kalem ile eskiden.
4. 10 mL % 10 Akrilamid jel karışım hazırlamak (% 10 (w/v) Akrilamid (acrylamide:bis-Akrilamid 29:1 =), 375 mM Tris-HCl (pH 8.8), % 0,1 (w/v) SDS) 15 mL tüp içinde.
   Not: Akrilamid en iyi konsantrasyon kullanılan reaktifler bağlı olarak değişebilir. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum persülfat (APS) bu noktada eklenmelidir değil.
5. 5 mM P etiketi Akrilamid 100 µL ve 1 M MnCl₂ çözümleri 10 µL 50 µM ve 100 µM, son konsantrasyonları sırasıyla ekleyin.
   Not: P-etiket Akrilamid ve MnCl₂ en iyi konsantrasyonları da kullanılan reaktifler bağlı olarak değişebilir.
6. TEMED 15 µL % 0.15 (v/v) son bir konsantrasyon, jel karışıma ekleyip sonra 50 µL % 10 (w/v) APS, %0.05 (w/v) son bir konsantrasyon. De yavaşça 5 s ve dökmek için tüp içine monte plakayı hemen konumu adım 2.3 işaretlenmiş yüksekliği yani 2 mm aşağıda kadar dönen tarafından karıştırın.
7. Yavaşça 2-propanol jelleri ayıran üst düzleştirmek için jel çözüm üzerine katman.
8. Oda sıcaklığında 30 dakika stand jelleri izin. Işıktan jelleri korumak gerekli değildir.
   Not: Soğuk oda sıcaklığında altında ayarlamak jeller için uzun sürebilir. TEMED ve APS eklemeden önce jel karışım gaz giderme bu adımı hızlandırmak yardımcı olur. Bu amaçla, jel karışımı bir 100-200 mL Erlenmeyer şişesi bir emme için bağlı olarak hazırlanabilir. 10 dk için çözüm degas.
9. Katmanlı 2-propanol bir kağıt havlu ile emerek kaldırın.
10. Yıkama şişe distile su ile boşluk doldurma yukarıya tarafından jelleri en iyi yer yıkama ve su Havzası kapalı dökerek atın. Yıkama 3 kez tekrarlayın.
11. Artık su bir kağıt havlu ile emerek jelleri üst uzayda kalan kaldırın.
12. 3 mL % 4 Akrilamid jel karışım hazırlamak (%4 (w/v) Akrilamid (a: crylamide:bis-Akrilamid 29:1 =), 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), % 0,1 (w/v) SDS) 15 mL tüp içinde.
    Not: P-etiket Akrilamid veya MnCl₂ çözüm yığın jel karışıma ekleyin değil.
13. TEMED 7.5 µL ve 24 µL % 10 (w/v) APS %0.25 (v/v) ve %0,08 (w/v), son konsantrasyonlarda sırasıyla ekleyin. De yavaşça 5 s ve üstüne ayrılık jel karışımı dökmek için tüp dönen tarafından karıştırın. Hemen uygun tarak (örneğin örnekleri, en çok 25 µL karşılamak 17-şey plastik tarak) koymak.
14. Oda sıcaklığında 30 dakika stand jelleri izin. Işıktan jelleri korumak gerekli değildir. Yığın jelleri ayarladıktan sonra onları daha fazla depolama çalıştırın.

3. SDS-sayfa ve Immunoblotting

1. Taraklari jelleri kaldırın. Silikon çubukları ve klipleri jelleri kaldır.
2. Döküm jelleri jel tankı koymak ve jel tankı için bağlayıcı klipleri ile sıkma tarafından düzeltin.
3. Alt ve üst kısmında jelleri çalışan arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, % 0,1 (w/v) SDS) dökün. Jel adet kaldırmak için 5 mL şırınga ve 21 G iğne kullanarak çalışan arabellek kızarma tarafından temiz kuyu.
4. Hava kabarcıkları bir şırıngaya bağlı bir bükülmüş iğne kullanarak jelleri alt alanı kaldırın. Bükülmüş bir iğne yapmak için belgili tanımlık uç ve iğne Bankası arasındaki açı 30-45 ° olur, böylece 21 G iğne iğne ortasında el ile viraj.
5. MnCl₂ ' de 20.000 × g oda sıcaklığında 1 dk. için ek açık örneklerini almak için neden precipitates spin.
6. Overexpressed Rab10 ve 30 µg protein fosforilasyon endojen Rab10 için algılamak için 10 µg proteinler yükleyin.
   Not: Bütün Wells örnekleri eşit ses yüklemek için önemlidir. Boş yolları 1 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabellek ile yüklenmesi. Örnekleri MnCl₂içeriyorsa, MnCl₂ aynı konsantrasyonu kukla örnekleri ekleyin.
7. Yüklü örnekleri hacmi bütün Wells aynı yani de yüklü bir molekül ağırlığı marker (MWM) ile de 1 × Laemmli'nın SDS-sayfa örnek arabellek ile takıma.
   Not: örnekleri MnCl₂içeriyorsa, MnCl₂ aynı yoğunlukta MWM için yeniden ekleyin. Alternatif olarak, bir EDTA ücretsiz MWM kullanılabilir.
8. Boya ön ayırma jel haçlar kadar (yaklaşık 30 dakika) istifleme için 50 V jelleri çalıştırın.
9. Örnekler yığını sonra boya açık jelleri sonuna ulaşana kadar gerilim için 120 V ayrılması için değiştirin (yaklaşık 50 ve 80 dk 80 ve 100 mm için uzun jelleri, sırasıyla).
   Not: MWM geçiş desen normal SDS-sayfa jeller üzerinde farklı olması bekleniyor. P-tan SDS-sayfası jeller üzerinde Proteinlerin moleküler ağırlık tahmin etmek için kullanılmamalıdır ancak P etiketi jelleri tekrarlanabilirlik kontrol etmek için kullanılabilir. Tartışma için ayrıntılı bilgi için bakın.
10. MnCl₂ jelleri kaldırmak için jeller yıkayın.
    1. Aktarım arabellek (48 mM Tris, 39 mM glisin, %20 (v/v) metanol) içeren 10 mM EDTA ve %0,05 (w/v) SDS (örneğin, tekneler ağırlığında büyük) bir kaba dökün.

Arabellek hacmi bir jel karşılamak için yeterli olmalıdır.

Ayrılık jelleri jel plakayı çıkarın ve bir jel bir kap içinde koydu. Yığın jel atmak.

Jelleri, oda sıcaklığında 10 dakika sallanan bir shaker (~ 60 rpm) çıkarma.

Yıkama adımları toplam 3 kez tekrarlayın.
Not: taze arabellek her yıkama için kullanın.

10 dakika için bir kez jelleri % 0.05 (w/v) EDTA kaldırmak için SDS içeren Aktarım arabellek ile yıkayın. Arabellek hacmi bir jel karşılamak için yeterli olmalıdır.

Elektro-transfer kullanarak nitroselüloz veya polivinilidin difluoride (PVDF) membranlar tankları ıslak.

1. Transfer için bir sünger yastık üzerinde bir filtre kağıdı (10 x 7 cm) yerleştirin. Jel üzerinde filtre kağıdı yerleştirin. Hiçbir hava kabarcıkları filtre kağıdı ve jel arasında olduğundan emin olun.
2. Bir membran (10 x 7 cm) üzerinde jel koymak ve hiçbir hava kabarcıkları jel ve membran arasında olduğundan emin olun.
3. Başka bir filtre kağıdı (10 x 7 cm) membran üzerinde koymak ve tekrar, yok hava kabarcıkları membran ve filtre kağıdı arasında olduğundan emin olun.
4. Başka bir sünger filtre kağıdı koymak. Membran/filtre kağıt yığını transfer için bir kaset koy.
5. Kaset membran jel ve pozitif yüklü anot arasında yer olduğundan emin bir transfer tankı içine koymak.
6. Tank bir güç kaynağına bağlayın ve stiren köpük kutusunda buz gibi su dolu tank koydu. 100 V 180 dk için Aktarım'ı başlatın.
   Not: uzun süreli aktarım proteinler transferi P etiketi SDS-sayfa jelleri değildir beri bu kadar normal SDS-sayfa jelleri verimli gereklidir. Verimli soğutma jelleri aktarım sırasında erime önlemek için önemlidir.

Transfer kontrol

1. Membranlar cımbız kullanarak jelleri kaldırmak ve bir plastik kap içinde membranlar üzerinde aktarılan proteinler leke bir çözümde Ponceau S (%0,1 (w/v) Ponceau S, %5 (v/v) Asetik asit) membranlar ıslatın. Çözüm hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.
2. Oda sıcaklığında 1 dk. için membranlar el ile rock yaparak kuluçkaya.
   Not: Bir merdiven gruplarından her şeritte görünür hale gelmelidir.
3. Membran dışında boyama çözüm cımbızla al ve grup merdiven nerede örnekleri yüklü her şeritte tek tip desen ve yoğunluğu olup olmadığına bakın.
4. Sonra kontrol boyama, boyama çözüm kaldırın ve TBST arabellek (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, % 0,1 (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate) ekleyin. Arabellek hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.
   Not: Ponceau S çözüm toplanabilir ve birkaç kez yeniden kullanılır.
5. Hiçbir görünür bantları membranlar kalıncaya kadar TBST oda sıcaklığında sallanan bir shaker (~ 60 rpm) üzerinde membranlar rock.
6. 5 min için taze TBST ile çamaşır yineleyin.

Kaldırmak ve TBST atın. %5 (w/v) yağsız süt TBST içinde çözünmüş ekleyerek ve bir shaker (~ 60 rpm) sallanan için oda sıcaklığında 1 h blok. Engelleme çözüm hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.

Birincil antikorlar (anti-Rab10 antikor endojen Rab10 için) ve anti-HA antikor overexpressed HA-Rab10 için engelleme çözüm agzin başına 10 ml sulandrarak birincil antikor çözümleri hazırlamak ( Tablo reçetesi konsantrasyonları için bakınız).

Kaldırın ve engelleme çözüm atmak ve birincil antikor ekleyin. Sallanan bir shaker (~ 60 rpm) membranlar gecede 4 ° C'de kuluçkaya

Birincil antikor çözüm kaldırın ve membranlar yıkamayı TBST ekleyin. Arabellek hacmi bir membran kapak için yeterli olmalıdır.

Membranlar üzerinde sallanan bir shaker (~ 60 rpm) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Yıkama (Adım 3,16) Toplam 3 kez tekrarlayın her seferinde taze TBST kullanarak.

İkincil antikor çözümleri engelleme çözüm agzin başına 10 ml ikincil antikor sulandrarak horseradish peroksidaz (HRP) ile etiketli hazırlayın. HRP ile anti-Rab10 antikor ile probed membranlar için etiketli Anti-tavşan IgG antikor ve anti-fare IgG antikor için o ile belgili tanımlık anti probed HRP ile etiketli kullanın-HA antikor ( Tablo reçetesi konsantrasyon için bakınız).

Kaldırın ve TBST sonra üçüncü yıkama atmak ve ikincil antikor çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 1 h için sallanan bir shaker (~ 60 rpm) membranlar kuluçkaya.

Membranlar TBST içinde 10 dk. yıkama adım toplamda 3 kez, adım 3,17 benzer tekrar yıkayın.

Gelişmiş Kemiluminesan (ECL) kullanarak membranlar geliştirmek.
Not: Pozlama süresi ECL çözüm ve Kemiluminesan tespiti için kullanılan sistemi bağlı olarak değişebilir.

1. Şarj kuplajlı cihaz (CCD) fotoğraf makinesi ile donatılmış bir Imager ve bir bilgisayar için Imager bağlı açın. Denetim yazılımı için Imager başlatın. CCD kamera sıcaklığı-25 ° c ulaşmıştır kadar bekleyin
2. ECL çözüm bir membran için 1 mL plastik bir şal bir bankta yaymak koymak.
3. Bir membran jel-yan-up ECL çözüm üzerinde koymak ve böylece çözüm her iki membran kaplı sonra hızlı bir şekilde çevirmek.
4. Membran pick up ve 5 için bir kağıt havlu membran dokunmatik bir tarafı izin vererek boşaltmak s.
5. NET filmleri (örneğin, net kağıt cepler) arasındaki zar koymak.
   Not: Membranlar sarma için plastik wrap tavsiye edilmez. Membran sarma için kullanılan net filmleri düzensiz arka plan önlemek için görünür kırışıklık olmadan mümkün olduğu kadar düz olması gerekir.
6. Membran siyah bir tepsiye yerleştirin. Imager içinde belgili tanımlık tepsi koymak ve kapıyı kapatın.
7. Kontrol yazılımı penceresinde "Odaklama" düğmesini tıklatın. Membran doğru yerleştirilmiş kontrol edin. "Geri" düğmesini tıklatın.
8. "Hassas" "Pozlama türü için" seçin. "El ile" "Pozlama süresi için" seçeneğini ve pozlama süresi 1 olarak küme s.
9. "İçin duyarlılık/çözüm" "Yüksek" seçin. "Sayısallaştırma yansıması Ekle'yi" işaretlemeyin. Bir görüntü çekmek için "Başlat" düğmesini tıklatın.
10. Çıktı görüntü bilgisayar sergilenen bir TIFF dosyası olarak kaydedin.
11. 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 çekim hızı ile alma görüntüleri tekrar s ve 180 s. Son görüntü çekerken, "Sayısallaştırma yansıması Ekle'yi" kontrol dijital görüntü, membran Kemiluminesan değil aynı anda alınabilir.
12. En iyi görüntüyü en büyük dinamik alan ve herhangi bir doyurarak piksel (kırmızı ile gösterilen) olmayan faiz bantlarında seçin.
    Not: Konvansiyonel röntgen filmleri de algılama¹⁹için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Overexpression sistemi: HA-Rab10 3 tarafından fosforilasyon × bayrak-LRRK2 içinde HEK293 hücreleri:

HEK293 hücreleri HA-Rab10 vahşi tipi ve 1,066 µg 3 × bayrak-LRRK2 (yaban-tipi, etkin olmayan kinaz mutant (K1906M) veya FPD mutantlar) 0,266 µg ile transfected. Rab10 fosforilasyon P etiketi SDS-sayfa bir anti kullanarak immunoblotting tarafından takip tarafından muayene-HA antikor (Şekil 2)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, Rab10 fosforilasyon tarafından LRRK2 P-etiket yöntembilimi'ne dayalı endojen düzeylerde tespit facile ve sağlam yöntemi açıklanmaktadır. Fosforile Rab10 karşı şu anda mevcut antikor ile sadece¹⁵overexpressed proteinler çalıştığından, P-tan SDS-sayfası kullanan mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon endojen düzeylerini değerlendirmek için tek yolu bu. Ayrıca, mevcut yöntemi Rab10 fosforilasyon hücrelerdeki stoichiometry tahmin sağlar. P-etiket metodoloji fosfo-protein...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	homemade		150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving
Sodium chloride	Nacalai Tesque	31320-34
Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water	Wako	196-02835
Potassium chloride	Wako	163-03545
Potassium Dihydrogen Phosphate	Wako	169-04245
2.5% Trypsin (10X)	Sigma-Aldrich	T4549	Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Wako	044-29765
Fetal bovine serum	BioWest	S1560	Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin (100X)	Wako	168-23191
HEPES	Wako	342-01375
Sodium hydroxide	Wako	198-13765
Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)	PolySciences, Inc.	24765-1	Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH
Dimethyl sulfoxide	Wako	045-28335
Tris	STAR	RSP-THA500G
Hydrochloric acid	Wako	080-01066
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether	Wako	160-24751	Equivalent to Triton X-100
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Wako	346-01312
Sodium orthovanadate(V)	Wako	198-09752
Sodium fluoride	Kanto Chemical	37174-20
β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate	Nacalai Tesque	17103-82
Sodium pyrophosphate decahydrate	Kokusan Chemical	2113899
Microcystin-LR	Wako	136-12241
Sucrose	Wako	196-00015
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001	Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23200
Sodium dodecyl sulfate	Nacalai Tesque	31607-65
Glycerol	Wako	075-00616
Bromophenol blue	Wako	021-02911
β-mercaptoethanol	Kanto Chemical	25099-00
Ethanol	Wako	056-06967
Methanol	Wako	136-01837
Phosphate-binding tag acrylamide	Wako	AAL-107	P-tag acrylamide
40% (w/v) acrylamide solution	Nacalai Tesque	06119-45	Acrylamide:Bis = 29:1
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai Tesque	33401-72
Ammonium persulfate (APS)	Wako	016-08021	10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water
2-propanol	Wako	166-04831
Manganese chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard	Bio-Rad	1610374, 1610373, 1610377	Molecular weight marker used in the protocol
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III	Wako	230-02461
Glycine	Nacalai Tesque	17109-64
Amersham Protran NC 0.45	GE Healthcare	10600007	Nitrocellulose membrane
Durapore Membrane Filter	EMD Millipore	GVHP00010	PVDF membrane
Filter Papers No.1	Advantec	00013600
Ponceau S	Nacalai Tesque	28322-72
Acetic acid	Wako	017-00251
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	polyoxyethylenesorbitan monolaurate
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Wako	345-01865
Skim milk powder	Difco Laboratories	232100
Immunostar	Wako	291-55203	ECL solution (Normal sensitivity)
Immunostar LD	Wako	290-69904	ECL solution (High sensitivity)
CBB staining solution	homemade		1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water
CBB R-250	Wako	031-17922
CBB destaining solution	homemade		12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
anti-HA antibody	Sigma-Aldrich	11583816001	Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting.
anti-Rab10 antibody	Cell Signaling Technology	#8127	Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
anti-pSer935 antibody	Abcam	ab133450	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-LRRK2 antibody	Abcam	ab133518	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-α-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T9026	Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-GAPDH antibody	Santa-Cruz	sc-32233	Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	515-035-003	Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhibitors
GSK2578215A	MedChem Express	HY-13237	Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
MLi-2	Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)		Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA	Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee)		This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10			This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10			This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10	Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo)		Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Forma Series II 3110 Water-Jacketed
Auto Pipette	Drummond	Pipet-Aid PA-400
Micropipette P10	Nichiryo	00-NPX2-10	0.5–10 μL
Micropipette P200	Nichiryo	00-NPX2-200	20–200 μL
Micropipette P1000	Nichiryo	00-NPX2-1000	100–1000 μL
Tips for micropipette P10	STAR	RST-481LCRST	Sterile
Tips for micropipette P200	FUKAEKASEI	1201-705YS	Sterile
Tips for micropipette P1000	STAR	RST-4810BRST	Sterile
5 mL disporsable pipette	Greiner	606180	Sterile
10 mL disporsable pipette	Greiner	607180	Sterile
25 mL disporsable pipette	Falcon	357535	Sterile
Hematocytometer	Sunlead Glass	A126	Improved Neubeuer
Microscope	Olympus	CKX53
10 cm dishes	Falcon	353003	For tissue culture
6-well plates	AGC Techno Glass	3810-006	For tissue culture
Vortex mixer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2
Cell scrapers	Sumitomo Bakelite	MS-93100
1.5 mL tubes	STAR	RSV-MTT1.5
15 mL tubes	AGC Techno Glass	2323-015
50 mL tubes	AGC Techno Glass	2343-050
Centrifuges	TOMY	MX-307
96-well plates	Greiner	655061	Not for tissue culture
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M2e
SDS–PAGE tanks	Nihon Eido	NA-1010
Transfer tanks	Nihon Eido	NA-1510B
Gel plates (notched)	Nihon Eido	NA-1000-1
Gel plates (plain)	Nihon Eido	NA-1000-2
Silicon spacers	Nihon Eido	NA-1000-16
17-well combs	Nihon Eido	Custom made
Binder clips	Nihon Eido	NA-1000-15
5 mL syringe	Terumo	SS-05SZ
21G	Terumo	NN-2138R
Power Station 1000 VC	ATTO	AE-8450	Power supply for SDS–PAGE and transfer
Large weighing boats	Ina Optika	AS-DL
Plastic containers	AS ONE	PS CASE No.4	10 x 80 x 50 mm
Rocking shaker	Titech	NR-10
Styrene foam box	generic		The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000	GE Healthcare		An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL