أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

Abstract

ينقول النائمة (س. ب) نظام تكامل غير فيروسية مع أثبتت فعاليتها لنقل الجينات والجينوم الوظيفي. لتحسين إليه ينقول SB، يعملون ترانسبوساسي مفرط التنظيم ترانسكريبتيونالي (SB100X)، والمستندة إلى T2 ينقول. عادة، يتم توفير ترانسبوساسي وينقول عابر من تعداء بلازميد والتعبير SB100X تحركها مروج تأسيسي. وهنا، يمكننا وصف طريقة فعالة لتوصيل المكونات بينالي الشارقة إلى الخلايا البشرية التي مقاومة للعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية تعداء، التحكم في التعبير SB100X وإدماج [ستبلى] مورثة للفائدة (غوي) من خلال SB "قص ولصق" إليه. يتم التعبير عن ترانسبوساسي مفرط رقابة مشددة من جانب النظام على تيت، تستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير الجيني منذ عام 1992. الجينات للاهتمام هو محاط يكرر مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من ينقول T2. يتم حزم كلا العنصرين بينالي الشارقة في التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة عابر تنتج في الخلايا HEK293T. الخلايا البشرية، أما من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية من الأنسجة البشرية، في المختبر ترانسدوسيد عابر مع النواقل الفيروسية. عند إضافة الدوكسي (دوكس، التتراسيكلين التناظرية) في المتوسط الثقافة، يقاس الضبط الدقيق للتعبير ترانسبوساسي والنتائج في على تكامل طويلة الأمد للجينات للفائدة في جينوم الخلايا المعالجة. هذا الأسلوب يتسم بالكفاءة وتنطبق على خط الخلية (مثل خلايا هيلا) والخلايا الأولية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية البشرية)، ويمثل بالتالي أداة قيمة للهندسة الوراثية ونقل الجينات العلاجية.

Introduction

تم بالفعل استخدام ترانسبوساسي SB100X مفرط بالإضافة إلى ينقول المستندة إلى T2 في الجينات السريرية العلاج التطبيقات^1،2،3، الجينوم التعديلات^4،5، و المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية) إعادة برمجة^6،7. عادة، مكونات SB توفرها عابر تعداء بلازميد ومروج تأسيسي قوية التعبير عن ترانسبوساسي محركات الأقراص. ومع ذلك، يظل تقديم النظام المكون الثاني على الرغم من تحسين أساليب جديدة من تعداء، تحديا للعديد من التطبيقات. وهكذا، قد وضع بروتوكول جديد بإيصال اهتماما متزايداً. بالإضافة إلى طرق تعداء بلازميد⁸ ومرناً⁹، الفيروسية التسليم استناداً إلى أدينوفيرال^10،11، مرتبطة بالغدد الفيروسية (إف)¹²، باكولوفيروس¹³، جاماريتروفيرال¹⁴ وناقلات لينتيفيرال¹⁵ وقد اقترح في الماضي. جدير بالذكر أن نظام الاختيار يجب أن تضمن عملية تسليم عابر لمكونات SB دون التكامل بين النواقل الفيروسية. ومع ذلك، التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي يثير الشواغل المتعلقة بالسلامة بسبب خطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.

ولذلك، تنظيم النسخي SB100X بنظام على تيت المكرر هو التحدي الأول. مروج تيت مراعية معدلة، التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال المروج المتقدمة الحد الأدنى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) الأصلي مع المروج (-81) الحد الأدنى من الجينات تيميديني كيناز (المعارف التقليدية) من فيروس "الحلأ البسيط"-1 (هامبورغ-1)¹⁶، هو استنساخ المنبع كدنا SB100X (pTetOTKSB100X). تحور عكس-التتراسيكلين-ترانساكتيفاتور rtTA2^s-أعرب عن M2¹⁷ تحت سيطرة قوي التأسيسي المروج (المروج فوسفوجليسيراتي، PGK) المستنسخة في بلازميد مختلفة (بتشل-PGKrtTA2^S-M2). عند إضافة إلى متوسط الثقافة، يربط دوكس rtTA2^s-المغير M2 والحبال المروج تيت المعقدة، أو الناتجة عن ذلك في شكل محكم التنظيم الاستقراء من التعبير SB100X¹⁸.

التحدي الرئيسي الثاني ينشأ من تعداء الكفاءة البشرية الابتدائية الخلايا بالعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية. لكفاءة تسليم ترانسبوساسي في الخلايا البشرية مقاومة تعداء، SB100X و rtTA2^s-شرائط التعبير M2 يتم حزم في اثنين التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة (إيدلفس)¹⁹: إيدلفتكسب و IDLVrtTA2^s- M2. يتم إنتاج النواقل الفيروسية عابر كناقلات الجيل الثالث في الخلايا HEK293T²⁰ وبسيودوتيبيد مع بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم فيسسيكولار (منظمة-ز)، الذي يمنح طائفة عريضة من العدوى. ناقل الجزيئات هي تتركز تنبيذ فائق ومعاير بفيروس نقص المناعة البشرية-1 "اسكت" إيمونوكابتوري p24. جسيمات ناقلات الرصاصية مع بوليبريني ترانسدوسي خطوط الخلايا والخلايا الأولية، وهي المحتضنة مع الخلايا المستهدفة في وجود أو عدم وجود دوكس. تفعيل مدمني المخدرات من التعبير SB100X في الخلايا ترانسدوسيد تقاس بكمية RT-PCR (قرة-PCR)¹⁸.

تحويل غوي (مثلاً، أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) إلى جينوم الخلية المستهدفة بمجرد يتجلى التعبير ينظم تيت SB100X، يتبع الأحداث الجزيئية وضوح المخططة ب باك وميكيلسن²¹. ثالث إيدلف ناقلات تحمل كاسيت تعبير لحكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب T2-ينقول (IDLVT2) وقد شيدت وتعبئتها كما هو مذكور أعلاه. وأخيراً، يمكن استخدام ثلاث ناقلات إيدلف كفاءة ترانسدوسي الخلايا البشرية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية) في المختبر وإدماج غوي حضور الدوكسيسيكلين¹⁸.

Protocol

1-والبلازميدات المستخدمة

ملاحظة: بلازميد بتشل-PGKrtTA2^S-M2 كان يرجى قدمها الأستاذ زابافيجنا (جامعة مودينا وريدجو إميليا، مودينا، إيطاليا). بلازميد pCMVSB100X تحمل الترميز تسلسل ترانسبوساسي مفرط وبلازميد ينقول pT2/البوسنة والهرسك قدمت تفضلت بزين Z. إيفيكس (معهد بول ايرليك، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا).

1. لجميع أشكال الاستنساخ في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، اتباع استراتيجية الاستنساخ لإجراءات الاختيار وإنزيم التقييد أو [بكر] تضخيم الجزء استنساخ.
   ملاحظة: يلخص الجدول 1 جميع والبلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول. وتقدم وصفاً والمراجع لكل بلازميد.

2. إنتاج النواقل الفيروسية

ملاحظة: يتم إنتاج جميع ناقلات المرض الفيروسي في غطاء واقية على مستوى احتواء BSL2 السلامة الأحيائية، وفقا للقواعد المؤسسية والأنظمة.

1. وتستكمل الثقافة ملتصقة HEK293T الخلايا في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو مع 10% هيكلوني المصل و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم.
2. اليوم 0: إعداد خمس إعداد لوحات/الفيروسية 15 سم والبذور 5.5x10⁶ خلايا في 30 مل الوسط.
3. يوم 1: تعداء
   1. قبل البدء تعداء، إعداد 100 مل من المحلول الملحي المخزن المؤقت x HEPES 2 (HBS):
      كلوريد الصوديوم (م 5) 5.6 مل
      حبيس (1 م) مل 10.0
      غ₂هبو₄ (0.5 م) 0.3 مل
      تعقيم المياه مل 84.1
      ضبط للأس الهيدروجيني 7.1 مع 37% HCl.
      ملاحظة: يمكن تخزين 2 x HBS في 4 درجات مئوية. درجة حموضة دقيق أمر بالغ الأهمية لكفاءة تعداء. مجموعة الرقم الهيدروجيني الأمثل هو 7.10 إلى 7.12.
   2. إزالة المتوسطة وإضافة 22.5 مل/طبق من ح 4 متوسطة جديدة قبل تعداء.
   3. ترانسفيكت الخلايا HEK293T مع بلازميد نقل بلازميد التغليف pMD.Lg/pRRE.D64VInt، بلازميد المغلف-ترميز pMD2.G وبرسف Rev (الجدول 1) وفقا للكمية/اللوحة التالية:
      نقل ميكروغرام بلازميد 25.00
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 ميكروغرام
      pMD2.G 8.75 مكغ
      برسف-القس 6.25 ميكروغرام
      ملاحظة: يتم إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة وفقا لبروتوكول CsCl الموصوفة من مانياتس²² ، أو باستخدام مجموعة مواد تنقية بلازميد خالية من الذيفان.
      1. ريسوسبيند 56.25 ميكروغرام للحمض النووي (مزيج البلازميدات 4) في 1.125 مل الماء المعقم وإضافة 125 ميليلتر من 2.5 م كاكل₂ (الحل A).
      2. إضافة مل 1.250 من 2 x HBS إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل (حل ب).
      3. إضافة الحل (مل 1.250) ب (1.250 مل) دروبويسي بينما محتدما مع 1 أو 2 مل ماصة (حل تعداء، إجمالي حجم مل 2.500).
      4. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      5. استخدام ميكروبيبيتي P1000، توزيع كل من حل تعداء (2.500 مل) أحادي الطبقة خلية دروبويسي.
   4. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂.
4. يوم 2: إزالة المتوسطة وإضافة 15 مل متوسطة جديدة (راجع الخطوة 2، 1).
5. يوم 3: تجميع وتركيز المادة التي تحتوي على الجسيمات لينتيفيرال طافية.
   1. جمع المادة طافية (~ 70 مل) من كل (n = 5) تصفية transfected خلايا لوحات، من خلال 0.45 ميكرومتر بس تصفية وتعبئة أنابيب بوليالومير 2 (1 بوصة × 3.5 بوصة)/الفيروسية إعداد.
   2. تركز الجزيئات متجه تنبيذ فائق في 106,000 س ز ح 2.5، عند 15 درجة مئوية مع الفرامل.
   3. فورا بعد وقف تنبيذ فائق (لتجنب استثارة بيليه في الأنبوب)، بلطف صب المادة طافية في حاوية تحتوي على 10 ٪ التبييض وتعليق الكريات مرئية بالكاد 2 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (+ 1% جيش صرب البوسنة). هذا أمر طبيعي كما بيليه واضحة وصغيرة جداً. استخدام ناقل مركزة طازجة أو الكوة وتخزين الاستعدادات الفيروسية في-80 درجة مئوية.
      تنبيه: يحتوي المادة طافية على جزيئات لينتيفيرال التي يجب أن تكون أبيض دقيق قبل التخلص من النفايات واقية.
6. إلى تيتراتي إعداد ناقلات الأمراض الفيروسية، استخدام أدوات إيمونوكابتوري p24 "اسكت" فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   ملاحظة: لتوحيد إنتاج النواقل الفيروسية، ويمكن استخدام الكواشف المستندة إلى الدهنية. ومع ذلك عيار النواقل الفيروسية يعتمد اعتماداً كبيرا على كفاءة تعداء ونقاء بلازميد الحمض النووي.

3-توصيل خطوط الخلايا البشرية (مثل خلايا هيلا)

ملاحظة: خلايا هيلا تستزرع في متوسطة النسر معدلة دولبيكو لتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم. ويلخص الجدول 1 جميع موجهات المستخدمة في هذا البروتوكول. ويرد وصف لكل ناقل. توصيل خلايا هيلا يسمح تحقق تنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين. قد تكون متعلقة اختلاف جرعة إيدلف المتجهات المعايرة الجسيمات ونوع الخلية الهدف.

1. اليوم 0: البذور 2 × 10⁵ خلايا في 3 مل متوسط لكل بئر من لوحة 6-جيدا. إعداد 4 آبار.
2. يوم 1: توصيل خلايا هيلا.
   1. لكل حالة، وتمييع ناقلات لينتيفيرال إلى وحدة تخزين نهائي لمتوسطة 1 مل (انظر الملاحظة أعلاه) حضور 10 ميكروليتر من بوليبريني (التركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل):
      تمييع جيدا #1: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية).
      تمييع جيدا #2: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24).
      تمييع لآبار #3، #4: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2^s-ناقلات M2 (9,600 نانوغرام p24).
   2. إزالة المتوسطة من كل بئر حيث كانت خلايا هيلا مطلي في اليوم 0 وإضافة تخفيف لينتيفيرال متجه إلى المقابلة جيدا.
   3. سبينوكولاتي لوحة 6-جيدا في غ س 754 لمدة 45 دقيقة في 20-25 درجة مئوية، وثم نقل لوحة 6-جيدا إلى خلية ثقافة حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
   4. بعد ح 6، استبدال ناقلات تحتوي على المتوسط بمتوسطة جديدة في جميع الآبار وإضافة الدوكسي إلى 1 ميكرومتر في شكل جيد #4. وضع اللوحة حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية ح 48.
3. يوم 3: إعداد بيليه خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
   1. قبل فصل الخلايا، تعد حلاً عامل التربسين (س 1):
      2.5% التربسين (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
   2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
   3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 0.5 مل حل عملي التربسين قبل حرارة 37 درجة مئوية لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 7 (في حاضنة ثقافة خلية).
   4. بعد الاحتضان، إضافة 0.5 مل المحتوية على مصل متوسطة لكل بئر لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب الطرد مركزي. أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل من س 1 برنامج تلفزيوني كل، والطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 240 x ز.
   5. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ز وتجاهل المادة طافية. استخدام الكريات الخلية الطازجة التي يتم جمعها أو تخزينها في-80 درجة مئوية. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات لأداء شبه كمي RT-PCR (راجع الخطوة 6).

4-توصيل الخلايا الأولية البشرية (على سبيل المثال، الكيراتينيه)

ملاحظة: يتم المصنف الكيراتينيه الأولية البشرية على دكت المشع 3T3-J2 الخلايا (وحدة تغذية طبقة)²³، هدية نوع من براندون يان (لوزان، لوزان، سويسرا).

1. تنمو خلايا الفأر السويسري 3T3-J2 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو وتستكمل مع المانحين 10% مصل البقر والبنسلين U/mL 50-ستربتوميسين الجلوتامين 4 مم (3T3 المتوسطة).
2. تنمو الخلايا الكيراتينيه مطلي على خلايا المشع دكت 3T3-J2 في المتوسط كفاد و "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو و F12 وسائط مزيج في لحم الخنزير (3:1) تحتوي على مصل بقرى الجنين (10%)، الجلوتامين (2%) الأنسولين (5 ميكروغرام/مل)، (الأدنين، البنسلين-ستربتوميسين (1%) 0.18 مم)، الهيدروكورتيزون (0.4 ميكروغرام/مل)، والسمية الكوليرا (0.1 nM)، و triiodothyronine (2 نانومتر).
3. اليوم 0: البذور 3 × 10⁵ دكت المشع الخلايا 3T3-J2، تضعف سابقا في 3T3 المتوسطة إلى تركيز نهائي 1 × 10⁵ خلايا/مل، في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. إعداد الآبار 9.
4. يوم 1: توصيل من الخلايا الكيراتينيه الأولية
   ملاحظة: توصيل من الخلايا الكيراتينيه يسمح التحديد الكمي لتنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين (بواسطة qRT-PCR) والتحقق من التكامل من "حكومة الهند" (التجارة والنقل) في الخلايا الهدف (بواسطة سيتوفلوريميتريك تحليل).
   1. قبل فصل الخلايا، تعد الحل العامل التربسين:
      0.5% التربسين-يدتا (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
   2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
   3. لفصل الخلايا الكيراتينيه سوبكونفلوينت في الثقافة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من محلول العامل التربسين المعالجون مسبقاً لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية.
   4. بعد الاحتضان، ريسوسبيند خلايا جيدا جيدا ونقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي الذي يحتوي على 2 مل المحتوية على مصل المتوسطة (إذا كان لا يزال يتم إرفاق العديد من الخلايا، احتضانها مين إضافية عند 37 درجة مئوية). أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل 1 x متوسط جديدة أو برنامج تلفزيوني كل وإضافة الحل شطف الأنبوب الطرد المركزي مع تعليق خلية.
   5. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
   6. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
   7. في أنبوب البولي بروبلين 15 مل، تمييع الكيراتينيه 1.6x10⁵ في 1 مل متوسطة كفاد، تمييع واحدة لكل حالة.
   8. تمييع ناقلات لينتيفيرال في 1 مل متوسطة كفاد حضور 20 ميكروليتر من بوليبريني (تركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل في وحدة تخزين نهائي لمل 2):
      تخفيف لآبار #1، #2، #3: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية دون المتجهات).
      تخفيف لآبار #4، #5: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2^s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24).
      تخفيف لآبار #6، #7، #8، #9: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2^s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24) + ناقل IDLVT2 (9,160 نانوغرام p24).
   9. ترانسدوسي الخلايا في تعليق بإضافة كل تمييع متجه لينتيفيرال (1 مل) إلى تعليق keratinocyte المقابلة (الكيراتينيه 1.6x10⁵ في 1 مل).
   10. إزالة المتوسطة من دكت المشع 3T3-J2 الخلايا المصنفة في اليوم 0 ولوحة ترانسدوسيد الكيراتينيه (1.6x10⁵ الكيراتينيه في 2 مل) لهم. وبعد ترانسدوسينج فضلا عن المضي قدما في المرحلة التالية.
   11. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم نقل الخلايا إلى 37 درجة مئوية في ثقافة الخلية الحاضنة ح 6.
       ملاحظة: هل لا الكيراتينيه سبينوكولاتي الأولية، كما البقاء والانتشار ستتأثر بشدة.
   12. بعد ح 6، إضافة 1 مل متوسطة كفاد لكل بئر. أضف 1 ميكرومتر الدوكسي (تركيز النهائية) في الآبار #5 و #8 و #9. إعادة الخلايا إلى 37 درجة مئوية.
5. يوم 2: استبدال المتوسطة كفاد مع 3 مل متوسطة كيه سي مع 10 نانوغرام/مل مماثلة.
6. يوم 3: تريبسينيزي ويغسل خلايا من آبار #1 و #4 و 5 # كما هو موضح من قبل (انظر 4.4.1 إلى 4.4.6). تجميد الخلايا الكريات في-80 درجة مئوية لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي لتحليل qRT PCR (راجع الخطوة 7).
7. تريبسينيزي الخلايا من جيدا #2، #6 و #8 كما هو موضح في الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5 وإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير التجارة والنقل (راجع الخطوة 5).
8. الحفاظ على الثقافة من آبار #3 و #7 و #9 دوبلينجس على الأقل 3-4، كافية لإضعاف الأمم المتحدة المتكاملة لناقلات الأمراض IDLVT2 (5 أيام للبشرية الكيراتينيه الابتدائي مطلي في تغذية طبقة).
9. يوم 6: 5 أيام تقريبا وظيفة توصيل، تريبسينيزي الخلايا (انظر الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5) من آبار #3، #7، و 9 # لإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير بروتينات فلورية خضراء (راجع الخطوة 5).
   ملاحظة: تتأثر الكفاءة توقيت وتوصيل التجربة عالية حسب نوع الخلية الأولية وتقلب من العينات التي تم جمعها.

5-سيتوفلوريميتريك تحليل الكيراتينيه الابتدائية ترانسدوسيد

ملاحظة: سيتوميتير تدفق تكوينه باستخدام ليزر أزرق (488 نانومتر)، ليزر أحمر (633 نانومتر) ومرشحات ليعمل الكشف عن الأسفار التجارة والنقل، وآسيا والمحيط الهادئ (انظر الجدول المواد).

1. لتمييز الخلايا الكيراتينيه من طبقة وحدة تغذية 3T3-J2، الماوس التسمية ترانسدوسيد الكيراتينيه منفصلة في يوم 3 ويوم 6 (انظر الخطوات 4.7 و 4-9) مع APC [مونوكلونل]-مترافق تغذية المضادة الأجسام المضادة.
   1. إعداد 4 مل من تلطيخ المخزن المؤقت لكل عينة:
      5% FBS 200 ميكروليتر
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 2.5 ملم) 20 ميكروليتر
      برنامج تلفزيوني 1 x 3780 ميكروليتر
   2. يغسل خلايا منفصلة مع 1 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
   3. في أنبوب لاقتناء التدفق الخلوي، ريسوسبيند 5 × 10⁴ خلايا في 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت المصبوغة وإضافة 2 ميكروليتر من الأجسام المضادة التغذية (01:50). يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
   4. وبعد 30 دقيقة، يغسل مع 2 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت.
   5. الحصول على إشارات APC والتجارة والنقل ب تحليل سيتوفلوريميتريك¹⁸. بروتينات فلورية خضراء⁺ خلية جزء صغير من السكان خلية الجيش الشعبي الكونغولي^– تشير إلى الخلايا الكيراتينيه ترانسدوسيد.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، إصلاح العينة الملون قبل التدفق الخلوي مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التشغيل.
2. تحليل بيانات التدفق الخلوي بالتآمر النسبة بين النسبة المئوية للتجارة والنقل⁺الخلايا عند نقطة النهاية (5 أيام) والنسبة المئوية للتجارة والنقل⁺الخلايا أيام 2 وظيفة توصيل، تطبيع لمستوى المتبقية من IDLVT2-ترانسدوسيد الخلايا.

6-شبه كمي RT-PCR

ملاحظة: استخدم بكر cycler حرارية.

1. استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من ترانسدوسيد أو التحكم في الخلايا باستخدام مجموعة مواد تنقية الجيش الملكي النيبالي، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   ملاحظة: يمكن تخزين إجمالي الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
2. توليف كدنا في رد فعل 20 ميليلتر استخدام 100 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، ومجموعة المنتسخة العكسية، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
   ملاحظة: يمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
3. كبسولة تفجير تصميم محددة ل SB100X، rtTA2^s-M2 وجابده (جين التدبير المنزلي).
   تصاميم مقترحة:
   SB الأمام التمهيدي:-جككاكتكاجكاجاجاج 5 '-3'
   SB عكس التمهيدي:-جتجتجاجاكككاتتجك 5 '-3'
   rtTAM2 إلى الأمام التمهيدي:-جاكجاكاجااكتكجكتك-3 5''
   rtTAM2 عكس التمهيدي:-تاكككججاجكاتجتكا 5 '-3'
   جابده الأمام التمهيدي:-جاككاكاجتككاتجككاتكاك 5 '-3'
   جابده عكس التمهيدي: 5 '–ككاككاكككتجتجكتجتاج–3'
4. إجراء PCR في حجم رد نهائي من 50 ميليلتر. على وجه الخصوص، التجمع في كل أنبوبة بكر رد فعل التالي:
   كدنا (1:5 إضعاف) (من الخطوة 6، 2) 1.00 ميليلتر
   إلى الأمام التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
   عكس التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
   دنتبس (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
   المخزن المؤقت (+ مجكل₂) (الأسهم 10 x) 5.00 ميليلتر
   بوليميراز بوليميراز (5 أسهم يو/ميليلتر) 0.25 ميليلتر
   ميليلتر الماء المعقم 40.75
5. استخدام البرنامج التالي من cycler الحرارية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تمضي إلى 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ق لدورات SB100X 34، 32 دورات ل rtTA2^s-M2 ، و 25 دورات جابده.
6. إعداد 1% [اغروس] هلام. حل ز 1 من [اغروس] في 100 مل TBE 1 × (10 x الأسهم المخفف في الماء المعقم)، في الكأس أو قارورة. تذوب في فرن ميكروويف، يحوم كل دقيقة حتى يذوب تماما [اغروس]. بارد [اغروس] ذاب حتى تصل إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية، ثم قم بإضافة 5 ميليلتر اثيديوم بروميد (الأوراق المالية 10 ملغ/مل). صب ذاب [اغروس] في علبة جل المجتمعين بمشط، لصب جل.
7. تحميل عينات (10 ميليلتر في كل) على [اغروس] هلام وإجراء التفريد.
8. إذا رغبت في ذلك، الحصول على صورة جل وإجراء تحليل دينسيتوميتريك على عصابات PCR.

7-الكمية RT-PCR (قرة-PCR)

ملاحظة: يعمل "نظام الكشف عن تسلسل" التجارية. [بكر] كبسولة تفجير، ومسبار 6-كاربوكسيفلوريسسين (الاتحاد الماليزي) لنازعة 3-فوسفات جليسيرالديهيدي (جابده) يتم شراؤها تجارياً.

1. للرجعية-النسخ، راجع الخطوة رقم 6، 2.
2. استخدام البرمجيات لتصميم أجهزة الإشعال والتحقيق المحددة ل SB100X.
   التصميم المقترح:
   SB.2 إلى الأمام التمهيدي:-جاجاجككاكتجكتككااا 5 '-3'،
   SB.2 عكس التمهيدي:-ككككاتجتجكاجتجكا 5 '-3'
   التحقيق في الاتحاد الماليزي SB:-كاتاجااجككاجاكتاكج 5 '-3'
3. إجراء PCR الوقت الحقيقي في لوحات 96-جيدا مع مزيج سيد بكر وخلط كبسولة تفجير + التحقيق، في حجم رد نهائي من 25 ميليلتر. على وجه الخصوص، النظر في الرد التالي لكل بئر:
   كدنا (01:10 إضعاف في الماء المعقم) 1.00 ميليلتر
   2 × ميليلتر ميكس ماجستير 12.50
   كبسولة تفجير + 20 x مسبار مزيج ميليلتر 1.25
   ميليلتر الماء المعقم 10.25
   ملاحظة: تنفيذ جميع ردود الفعل في ثلاث نسخ. لمنع الأخطاء بيبيتينج، إعداد مزيج لردود على الأقل n + 3 (دون كدنا). قاسمة استخدام ماصة متعددة القنوات.
4. تشغيل PCR الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 95 درجة مئوية عن 10 دقيقة، ثم دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية 1 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
5. تحليل بيانات qRT PCR بتطبيع التعبير النسبي (RQ القيمة) من SB100X إلى مستوى جابده من نفس العينة كدنا بالكمي^{CT ΔΔ–}2، استخدام برمجيات تحليل البيانات النموذجية.

النتائج

استخدام الإجراء المعروضة هنا، ثلاث ناقلات إيدلف تحمل مكونات بينالي الشارقة ينظم (SB100X، rtTA2^S-ينقول M2 وبروتينات فلورية خضراء-T2) تم تعبئتها واستخدامها لكفاءة تقديم وتنظيم أحكام نظام بينالي الشارقة في الخلايا البشرية. ويبين الشكل 1A مخطط في المختبر ?...

Discussion

هنا، يمكننا وصف منهجية متاحة على نطاق واسع لإدماج غوي ستابلي في جينوم الخلايا المستهدفة الجمال النائم-بوساطة تبديل. على الرغم من أن وضع نظام بينالي الشارقة لتوفير أسلوب فاجيناليس للتحرير الجينوم، تسليم كفاءة إليه التكامل (ترانسبوساسي وينقول T2) إلزامي. ولذلك، استخدام نظام بينالي الش?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.