Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

Resumen

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Resumen

El transposón Durmiente (SB) es un sistema integrador no virales con eficacia demostrada para la transferencia génica y genómica funcional. Para optimizar la maquinaria de transposon de SB, se emplean una transposasa hiperactiva transcripcionalmente regulada (SB100X) y transposones basada en T2. Típicamente, la transposasa y transposon transitoriamente por la transfección del plásmido y SB100X expresión es conducida por un promotor constitutivo. Aquí, describimos un método eficiente para entregar los componentes de la SB a las células humanas que son resistentes a varios métodos de transfección física y química, para controlar la expresión de SB100X y estable integrar un gen de interés (GOI) a través de un "cortar y pegar" SB mecanismo. La expresión de la transposasa hiperactiva es estrechamente controlada por el sistema de Tet-ON, ampliamente utilizado para controlar la expresión génica desde 1992. El gen de interés es flanqueado por repeticiones invertidas (IR) de los transposones de T2. Ambos componentes SB vienen en vectores lentivirales defectuosos transitorio producidos en células HEK293T integración. Las células humanas, líneas celulares o células primarias del tejido humano, están en vitro transduced transitoriamente con vectores virales. Además de doxiciclina (dox, análogo de la tetraciclina) en el medio de cultivo, un ajuste fino de la transposasa expresión se mide y da lugar a una integración duradera del gen de interés en el genoma de las células tratadas. Este método es eficaz y aplicable a la línea celular (por ejemplo, las células HeLa) y células primarias (por ejemplo, keratinocytes humanos primarios) y así representa una valiosa herramienta para la ingeniería genética y transferencia de genes terapéuticos.

Introducción

La transposasa hiperactiva de SB100X juntada al transposon basada en T2 ya se ha utilizado en preclínica gene terapia aplicaciones^1,2,3, genoma modificaciones^4,5, y célula de vástago pluripotent inducidas (iPSC) reprogramación^6,7. Típicamente, los componentes del SB son provistos transitoriamente por transfección del plásmido y un fuerte promotor constitutivo conduce la expresión de la transposasa. Sin embargo, a pesar de los nuevos métodos de mejora de la transfección, entrega del sistema de dos componentes sigue siendo un desafío para muchas aplicaciones. Así, el desarrollo de un nuevo protocolo de entrega tiene creciente interés. Además de métodos de transfección de plásmidos⁸ y mRNA⁹, entrega viral basado en adenoviral^10,11, adeno-associated virus (AAV)¹², Baculovirus¹³gammaretroviral¹⁴ y vectores lentivirales¹⁵ ha sido propuesto en el pasado. En particular, el sistema de elección debe garantizar una entrega transitoria de los componentes del SB sin integración del vector viral. Sin embargo, la expresión constitutiva de la transposasa plantea preocupaciones de seguridad debido al riesgo de rehopping incontrolable de los transposones.

Por lo tanto, la regulación transcripcional de SB100X por un refinado sistema de Tet-ON es el primer desafío. Se clona un promotor TTE responden modificado, obtenido mediante la sustitución del original promotor desarrollado mínimo citomegalovirus (CMV) con el promotor mínimo (-81) del gen Timidine quinasa (TK) del Virus del Herpes simple 1 (HSV-1)¹⁶, aguas arriba de la CDNA de SB100X (pTetOTKSB100X). La transformada inversa-tetraciclina-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte (fosfoglicerato promotor, PGK) clonado en un plásmido diferentes (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Cuando se añade al medio de cultivo, dox une el rtTA2^s-modulador M2 y anclar el promotor de Tet o complejo, dando como resultado una inducción bien regulada de SB100X expresión¹⁸.

El segundo gran reto surge de la ineficiente de la transfección de células primarias humanas por varios métodos físicos y químicos. Para administrar transposasa en células humanas resistentes a la transfección, la SB100X y la rtTA2^s-cassettes de expresión M2 vienen en dos integración vectores lentivirales defectuoso (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB y IDLVrtTA2^s- M2. Vectores virales se producen transitoriamente como tercer vectores de generación de células HEK293T²⁰ y pseudotyped con la glicoproteína G del Virus de la estomatitis Vescicular (VSV-G), que le confiere un amplio espectro de la infección. Las partículas de vector son concentradas por ultracentrifugación y graduadas por Inmunocaptura p24 de HIV-1 Gag. Para transducir las líneas celulares y células primarias, las partículas de vector son complexed con polibreno y se incuban con las células Diana en la presencia o ausencia de dox. Activación dependiente de la droga de SB100X expresión en células transduced se mide por RT-PCR (qRT-PCR) cuantitativa¹⁸.

Una vez que se demuestra expresión regulada de Tet SB100X, transposición de lo GOI (p. ej., proteína verde fluorescente, GFP) en el genoma de la célula objetivo sigue los eventos moleculares claramente esquematizados por Bak y Mikkelsen²¹. Un tercer IDLV vector llevar un casete de expresión para el GOI clonado entre el IRs transposon T2 (IDLVT2) tiene que ser construido y empaquetado como se mencionó anteriormente. Por último, los tres vectores IDLV pueden utilizarse para transducir las células humanas (por ejemplo, queratinocitos primarios) en vitro e integrar el GOI en presencia de doxiciclina¹⁸.

Protocolo

1. los plásmidos empleados

Nota: Plásmido pCCL-PGKrtTA2^S-M2 fue amablemente proporcionado por Prof. Zappavigna (Universidad de Modena y Reggio Emilia, Módena, Italia). El plásmido de pCMVSB100X llevando la secuencia de codificación de la transposasa hiperactiva y el plásmido de transposon pT2/BH fueron amablemente proporcionadas por Prof Z. Ivics (Instituto de Paul Ehrlich, Langen, Alemania) y Prof. Z. Izvak (Max Delbruck centro de Medicina Molecular, Berlín, Alemania).

1. De todo clonado en Escherichia Coli (e. coli), siga la estrategia de clonación del proceso de elección y enzima de la restricción o amplificación por PCR del fragmento a ser clonados.
   Nota: La tabla 1 resume todos la plásmidos empleada en el presente Protocolo. Se ofrecen una descripción y las referencias de cada plásmido.

2. producción del vector viral

Nota: Todos los vectores virales se producen en una campana de biohazard en un nivel de contención de bioseguridad BSL2, según normas institucionales.

1. Células HEK293T adherentes en cultivo en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero HyClone, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina y glutamina 2 mM.
2. Día 0: Preparar cinco preparación viral placas de 15 cm y semilla 5.5x10⁶ células en 30 mL de medio.
3. Día 1: transfección
   1. Antes de comenzar la transfección, preparar 100 mL de solución salina 2 x HEPES buffer (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      Na₂HPO₄ (0,5 M) 0,3 mL
      Estéril de agua mL 84,1
      Ajustar el pH a 7.1 con 37% HCl.
      Nota: 2 x HBS pueden almacenarse a 4 ° C. Un pH exacto es muy importante para la transfección eficiente. El rango de pH óptimo es de 7.10 a 7.12.
   2. Retirar el medio y añadir 22,5 mL/placa de fresco mediano 4 h antes de la transfección.
   3. Transfectar las células HEK293T con el plásmido de la transferencia, el plásmido de empaquetado de pMD.Lg/pRRE.D64VInt, el plásmido pMD2.G de codificación envolvente y pRSV-Rev (tabla 1) según la siguiente cantidad/placa:
      transferencia de μg de plásmido 25.00
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 μg
      pMD2.G 8.75 μg
      pRSV-Rev 6,25 μg
      Nota: El plásmido DNAs se preparan según el protocolo de CsCl descrito por Maniatis²² o mediante un kit de purificación del plásmido libre de endotoxinas.
      1. Suspender 56.25 μg de DNA (mezcla de 4 plásmidos) de 1,125 mL de agua estéril y añadir 125 μl de 2.5 M CaCl₂ (solución A).
      2. Añadir a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril (solución B) 1,250 mL de 2 x HBS.
      3. Añadir solución un 1,250 mL a B (1,250 mL) gota a gota mientras burbujea con una pipeta de 1 ó 2 mL (solución de transfección, volumen total 2,500 mL).
      4. Incubar por 20 min a temperatura ambiente (RT).
      5. Usando una micropipeta P1000, distribuir todo de la solución de transfección (2,500 mL) a la monocapa celular gota a gota.
   4. Incubar durante una noche en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C, 5% CO₂.
4. Día 2: Quite el medio y añadir 15 mL de medio fresco (vea el paso 2.1).
5. Día 3: Recoger y concentrar el sobrenadante que contiene partículas lentivirales.
   1. Recoger sobrenadante (~ 70 mL) de todos (n = 5) placas de células transfected, filtrar a través de un 0.45 μm PESS filtrar y llenar 2 tubos de polyallomer (1 pulgadas x 3.5 pulgadas) / viral preparación.
   2. Concentrar las partículas de vector por ultracentrifugación a 106.000 g x 2,5 h, a 15 ° C con freno.
   3. Inmediatamente después de dejar la ultracentrifugación (para evitar la resuspensión del precipitado en el tubo), suavemente Vierta el sobrenadante en un recipiente que contiene 10% de lejía y suspender las pastillas apenas visibles 2 en 100 μl de PBS 1 x (+ 1% BSA). Esto es normal como el pellet es claro y muy pequeñas. Utilizar el vector concentrado recién preparado o alícuota y almacenar las preparaciones virales a-80 ° C.
      PRECAUCIÓN: El sobrenadante contiene partículas lentivirales que deben ser blanqueadas minuciosamente antes de deshacerse de los residuos de riesgo biológico.
6. Para valorar la preparación de vectores virales, utilice un kit de Inmunocaptura p24 Gag de VIH-1 según protocolo del fabricante.
   Nota: Para estandarizar la producción de vectores virales, podrían emplearse reactivos basados en liposomas. Sin embargo, el título del vector viral es altamente dependiente en la eficiencia de transfección y pureza del ADN del plásmido.

3. transducción de líneas celulares humanas (por ejemplo, las células HeLa)

Nota: Las células HeLa son cultivadas en medio modificado Eagle de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal de ternera, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina y 2 mM glutamina. La tabla 1 resume todos los vectores empleados en el presente Protocolo. Se proporciona una descripción para cada vector. Transducción de células HeLa permite la verificación de la regulación transcripcional de la transposasa de SB en la mejor combinación de dosis de los dos vectores IDLV. Variación de dosis IDLV puede estar relacionado con vector valoración de partícula y tipo de la célula blanco.

1. Día 0: Semilla 2 x 10⁵ células en 3 mL de medio para cada pocillo de una placa de 6 pozos. Preparar 4 pozos.
2. Día 1: Transducción de células HeLa.
   1. Para cada condición, diluir vectores lentivirales para un volumen final de 1 mL medio (ver nota anterior) en presencia de 10 μL de polibreno (concentración final 8 μg/mL):
      Dilución para el pozo #1: burlarse de células transduced (control negativo).
      Dilución para el pozo #2: vector IDLVTKSB (2.600 ng de p24).
      Dilución para los pozos #3, #4: vector IDLVTKSB (2.600 ng de p24) + IDLVrtTA2^s-vector M2 (9.600 ng de p24).
   2. Retire el medio de cada pozo donde las células HeLa fueron plateadas en el día 0 y agregar diluciones de vectores lentivirales para el correspondiente bien.
   3. Spinoculate la placa de 6 pozos en 754 x g durante 45 minutos a 20-25 ° C y entonces traslado la placa de 6 pozos a una incubadora de cultivo celular en 37 ° C y 5% CO₂.
   4. Después de 6 h, sustituir los vectores que contienen medio por medio fresco en todos los pozos y añadir doxiciclina a 1 μM en el pozo #4. Poner la placa en una célula cultura la incubadora a 37 ° C durante 48 h.
3. Día 3: Preparación de pellets celulares para extracción de RNA.
   1. Antes de desmontar las células, prepare una solución de trabajo de tripsina (1 x):
      2.5% tripsina (10 x) 5,0 mL
      500 mM EDTA (concentración final = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
   2. Solución de trabajo de tripsina caliente a 37 ° C antes de usar. Solución de trabajo de tripsina a 4 ° C.
   3. Medio de quitar y lavar las células con PBS 1 x. Agregar 0,5 mL de solución de trabajo de tripsina con 37 ° C en cada pocillo e incubar a 37 ° C por 7 min (en una incubadora de cultivo celular).
   4. Después de la incubación, Añadir 0,5 mL de suero que contienen media a cada pocillo para inactivar células recogemos en un tubo de centrífuga y tripsina. Enjuagar bien una vez con 3 mL de PBS 1 x y Centrifugue la suspensión celular por 5 min a 240 x g.
   5. Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS, centrifugar durante 5 min a 240 x g y descartar el sobrenadante. Use perdigones recién recogidos de la célula o almacenar a-80 ° C. Extraer ARN de pellets para realizar RT-PCR semicuantitativa (ver paso 6).

4. transducción de células primarias humanas (por ejemplo, queratinocitos)

Nota: Keratinocytes humanos primarios se siembran sobre 3T3-J2 irradiados letalmente células (capa de alimentador)²³, un amable regalo de Yan Barrandon (EPFL, Lausana, Suiza).

1. Crecer células de ratón Swiss 3T3-J2 en modificado Eagle suplementado de Dulbecco con 10% suero bovino de donantes, 50 U/mL de penicilina-estreptomicina y glutamina 4 mM (3T3 medio).
2. Crecimiento de queratinocitos plateado en células 3T3-J2 irradiados letalmente cFAD, medio de Eagle modificado de Dulbecco y mezcla de medios Ham F12 (3:1) que contenga suero fetal bovino (10%), penicilina-estreptomicina (1%), glutamina (2%), insulina (5 μg/mL), adenina ( de 0.18 m m), hidrocortisona (0,4 μg/mL), la toxina del cólera (0.1 nanómetro) y la triyodotironina (2 nM).
3. Día 0: Semilla 3 x 10⁵ letalmente irradiadas las células 3T3-J2, previamente diluidas en medio 3T3 a una concentración final de 1 X 10⁵ células/mL, en cada pocillo de la placa de 6 pozos. Preparar 9 pozos.
4. Día 1: Transducción de los queratinocitos primarios
   Nota: Transducción de keratinocytes permite cuantificación de la regulación transcripcional de la transposasa de SB en la mejor combinación de dosis de los dos vectores IDLV (qRT-PCR) y verificar la integración de GOI (GFP) en las células diana (cytofluorimetric Análisis).
   1. Antes de desmontar las células, preparar la solución de trabajo de la tripsina:
      0.5% tripsina-EDTA (10 x) 5,0 mL
      500mM EDTA (concentración final = 5 mM) 0,5 mL
      1 x PBS 44,5 mL
   2. Solución de trabajo de tripsina caliente a 37 ° C antes de usar. Solución de trabajo de tripsina a 4 ° C.
   3. Para desasociar subconfluente queratinocitos en cultivo, quiten medio las células con PBS 1 x y añadir 1 mL de solución de trabajo de tripsina precalentado a cada pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 min en la incubadora de la cultura de célula.
   4. Después de la incubación, resuspender las células de un pozo bien y transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga que contiene 2 mL de suero que contiene medio (si muchas células estén fijadas, incubar durante un minuto adicional a 37 ° C). Enjuagar bien una vez con 3 mL de 1 x PBS o medio fresco y añadir la solución de enjuague para el tubo de centrífuga con la suspensión de células.
   5. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
   6. Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS, centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
   7. En un tubo de polipropileno de 15 mL, diluir 1.6x10⁵ keratinocytes en 1 mL de medio de cFAD, una dilución para cada condición.
   8. Diluir vectores lentivirales en 1 mL de medio de cFAD en presencia de 20 μL de polibreno (concentración final de 8 μg/mL en un volumen final de 2 mL):
      Diluciones para los pozos #1, #2, #3: burlarse de células transduced (control negativo sin vectores).
      Diluciones para los pozos #4, #5: vectores IDLVTKSB (13.000 ng de p24) + IDLVrtTA2^s-vector M2 (48.000 ng de p24).
      Diluciones para los pozos #6, #7, #8, #9: vector IDLVTKSB (13.000 ng de p24) + IDLVrtTA2^s-vector M2 (48.000 ng de p24) + vector IDLVT2 (9.160 ng de p24).
   9. Transducir las células en suspensión mediante la adición de cada dilución de vectores lentivirales (1 mL) a la correspondiente suspensión de queratinocitos (1.6x10⁵ keratinocytes en 1 mL).
   10. Retire el medio de las células 3T3-J2 irradiados letalmente sembradas en el día 0 y placa transduced queratinocitos (1.6x10⁵ keratinocytes en 2 mL) en ellos. Después transducing bien proceder con la siguiente.
   11. Incubar a 25 ° C por 30 min y luego se transfieren las células a 37 ° C en la incubadora de cultivo celular de 6 h.
       Nota: No spinoculate queratinocitos primarios, como la viabilidad y proliferación serán fuertemente afectados.
   12. Después de 6 h, añadir 1 mL de medio de cFAD a cada pocillo. Añadir doxiciclina μM 1 (concentración final) en los pozos #5, #8 y #9. Volver a las células a 37 ° C.
5. Día 2: Reemplazar cFAD mediano con 3 mL de medio KC con EGF de 10 ng/mL.
6. Día 3: Trypsinize y lavar las células de los pozos #1, #4 y #5 como se describe antes (véase 4.4.1 a 4.4.6). Congelación de gránulos de la célula a-80 ° C para extraer ARN total para análisis de qRT-PCR (ver paso 7).
7. Trypsinize células de pozo #2, #6 y #8 como se describe en pasos 4.4.1 a 4.4.5 y realizar análisis cytofluorimetric para la expresión de GFP (ver paso 5).
8. Mantener la cultura de los pozos #3, #7 y #9 para doblajes de al menos 3-4, suficientes para diluir no integrados IDLVT2 vector (5 días de keratinocytes humanos primarios sobre capa de alimentador).
9. Día 6: Aproximadamente 5 días post transducción, trypsinize las células (ver pasos 4.4.1 a 4.4.5) de los pozos #3, #7 y #9 para realizar análisis de cytofluorimetric para la expresión de GFP (ver paso 5).
   Nota: Eficiencia de sincronización y transducción de experimento están influenciados altamente por tipo la célula primaria y por la variabilidad de muestras colectadas.

5. Cytofluorimetric análisis de transduced queratinocitos primarios

Nota: Un citómetro de flujo configurado un láser azul (488 nm), un láser rojo (633 nm) y filtros para la detección de la fluorescencia de GFP y APC es empleada (véase Tabla de materiales).

1. Discriminar los queratinocitos de la capa de alimentador 3T3-J2, etiqueta transduced queratinocitos separados en día 3 y 6 (ver pasos 4.7 y 4.9) con mouse APC monoclonal-anticuerpo conjugado de anti-alimentador.
   1. Preparar 4 mL de buffer para cada muestra la coloración:
      5% FBS 200 ΜL
      500 mM EDTA (concentración final = 2.5 mM) 20 μL
      ΜL de PBS 1 x 3780
   2. Lavar las células separadas con 1 mL de tampón de tinción. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante.
   3. En un tubo para la adquisición de la citometría de flujo, suspender 5 x 10⁴ células en 100 μL de tampón de tinción y añadir 2 μL de anticuerpo anti-alimentador (1:50). Mezclar bien e incubar durante 30 min en hielo en la oscuridad.
   4. Después de 30 min, lavar con 2 mL de tampón de tinción. Centrifugar durante 5 min a 580 x g y descartar el sobrenadante. Resuspender en 200 μL de tampón de tinción.
   5. Adquirir señales de APC y GFP por cytofluorimetric análisis¹⁸. La fracción de células GFP⁺ de la población de células APC^– indica queratinocitos transduced.
      Nota: Si se desea, fijar la muestra teñida antes de citometría de flujo con paraformaldehído al 2% en PBS 1 x y almacenar a 4 ° C en la oscuridad hasta la ejecución.
2. Analizar datos de citometría de flujo mediante el trazado de la relación entre el porcentaje de GFP⁺las células en el extremo (5 días) y el porcentaje de GFP⁺células 2 días post transducción, normalizado a nivel residual de IDLVT2-transduced células.

6. semi-cuantitativa de RT-PCR

Nota: Use un termociclador PCR.

1. Extracto total de RNA de transduced o controlar las células usando un kit de purificación de RNA, según protocolo del fabricante.
   Nota: El ARN Total se puede almacenar a-80 ° C.
2. Sintetizar el cDNA en una reacción de 20 μl usando 100 ng de RNA total y un kit de la transcriptasa reversa, según protocolo del fabricante.
   Nota: cDNA puede ser almacenado a-20 ° C.
3. Diseño de cebadores específicos para SB100X, rtTA2^s-M2 y GAPDH (un gen de la limpieza).
   Diseños sugeridos:
   SB hacia delante la cartilla: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
   SB inversa cartilla: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
   rtTAM2 hacia delante la cartilla: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
   rtTAM2 inversa cartilla: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
   GAPDH adelante cartilla: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
   GAPDH inversa cartilla: 5'––CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'
4. Realizar PCR en un volumen final de reacción de 50 μl. En particular, montar en cada tubo PCR la reacción siguiente:
   cDNA (dilución 1:5) (desde el paso 6.2) 1.00 μl
   Adelante la cartilla (stock de 10 μm) 1.00 μl
   Revertir la cartilla (stock de 10 μm) 1.00 μl
   dNTPs (10 acciones de μm) 1.00 μl
   Buffer (+ MgCl₂) (10 x stock) 5,00 μl
   Taq polimerasa (stock de 5 U/μL) 0.25 μl
   Μl de agua estéril 40,75
5. Utilizar el siguiente programa en el termociclador: 1 ciclo a 95 ° C por 5 min luego proceder a 95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s y 72 ° C por 30 s para 34 ciclos de SB100X, 32 ciclos de rtTA2^s-M2 y 25 ciclos de GAPDH.
6. Preparar el gel de agarosa al 1%. Disolver 1 g de agarosa en 100 mL de TBE 1 x (10 x población diluido en agua estéril), en un vaso de precipitados o matraz. Derretir en el microondas, se arremolinan cada minuto hasta que la agarosa se disuelva completamente. Enfriar la agarosa fundida hasta que llegue aproximadamente a 50 ° C y luego añadir 5 μl de bromuro de etidio (bolsa de 10 mg/mL). Verter la agarosa fundida en una bandeja de gel montado con un peine, gel de fundición de.
7. Muestras (10 μl) de la carga en el gel de agarosa y realizar la electroforesis.
8. Si lo desea, adquirir imagen de gel y realizar análisis densitométrico en las bandas PCR.

7. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)

Nota: Se emplea un sistema comercial de detección de secuencia. Cebadores PCR y sonda 6-carboxyfluorescein (FAM) para el gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) son adquiridos comercialmente.

1. Para retro-transcripción, vea paso 6.2.
2. Utilizar software para diseño de primers y sondas específicas para SB100X.
   Diseño sugerido:
   SB.2 hacia delante la cartilla: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
   SB.2 inversa cartilla: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
   sonda de SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
3. Realizar PCR en tiempo real en placas de 96 pocillos con un PCR Master Mix y mezcla de cebadores + sonda, en un volumen final de reacción de 25 μl. En particular, considere la siguiente reacción para cada bien:
   cDNA (1:10 dilución en agua estéril) 1.00 μl
   2 μl de la Master Mix 12.50
   Cebadores + sonda x 20 1.25 μl de la mezcla
   Μl de agua estéril 10.25
   Nota: Realice todas las reacciones por triplicado. Para evitar errores de pipeteo, preparar una mezcla de por lo menos n + 3 reacciones (sin cDNA). Alicuotar con una pipeta multicanal.
4. Ejecutar mediante el siguiente programa PCR en tiempo real: 1 ciclo a 95 ° C por 10 minutos, luego de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 1 min y mantener a 4 ° C.
5. Analizar datos de qRT-PCR, normalizando la expresión relativa (valor RQ) de la SB100X al nivel de la GAPDH de la misma muestra de cDNA por la cuantificación de 2^{–CT ΔΔ}, utilizando el software de análisis de datos típicos.

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí, tres vectores IDLV llevar los componentes regulados de SB (SB100X, rtTA2^S-transposon M2 y T2-GFP) eran empaquetados y brindar de manera eficiente y regular bien el sistema de SB en células humanas. Figura 1A se muestra un esquema para en vitro la transducción de las células HeLa, que fue realizada para evaluar la regulación transcripcional de la transposasa de SB con la mejor combinación d...

Discusión

Aquí, describimos una metodología ampliamente accesible para integrar estable un GOI en el genoma de las células de la blanco de La bella durmiente-mediada por transposición. Aunque el sistema de SB fue desarrollado para proporcionar un método nonviral para la edición del genoma, una entrega eficiente de la maquinaria de integración (transposasa y T2 transposon) es obligatoria. Por lo tanto, para utilizar el sistema de SB en células primarias apenas transfectable, una entrega viral de los componentes del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.