효율적인 체 외에서 이항 메서드인 Transcriptionally 규제 자 아름다움 시스템 통합 결함이 Lentiviral 벡터에 포장 하 여

요약

이 프로토콜 transcriptionally 규제 잠자는 미녀 시스템에 의해 인간 게놈에 관심사의 유전자의 안정적인 통합을 달성 하는 방법을 설명 합니다. 결함이 lentiviral 벡터, 인간의 세포, 생체 외에서 변환 및 불리고 세포에 분자 분석 결과의 통합의 준비 보고 됩니다.

초록

잠자는 미녀 (SB) transposon는 유전자 이동 및 기능 유전체학에 대 한 입증 된 효능 비 바이러스 성 통합 시스템입니다. SB transposon 기계를 최적화 하려면 transcriptionally 규제 활동적인 transposase (SB100X) 및 T2 기반 transposon 고용 됩니다. 일반적으로, transposase와 transposon 제공한 정도 플라스 미드 transfection 그리고 SB100X 식 제정 발기인에 의해 구동 됩니다. 여기, 우리는 여러 가지 물리적, 화학적 transfection 방법 SB100X 식 제어 통합 하 고 안정적으로 "잘라내기 및 붙여넣기" SB 통해 관심 (GOI)의 유전자에는 인간의 세포에 SB 구성 요소를 제공 하는 효율적인 방법 설명 메커니즘입니다. 활동적인 transposase의 식은 단단히 Tet에 시스템, 1992 년부터 유전자 발현 제어를 널리 의해 제어 됩니다. 관심사의 유전자는 T2 transposon의 거꾸로 반복 (IR)에 의해 측면 이다. 두 SB 부품 결함이 lentiviral 벡터 뚜렷이 HEK293T 세포에서 생산 하는 통합에 포장 됩니다. 인간 세포, 세포 선 또는 인간 직물에서 1 차 셀에 체 외에 바이러스 성 벡터와 정도 불리고 있습니다. 문화 매체에 doxycycline (dox, 항생물질 아날로그)의 추가, 시 transposase 식의 미세 조정 측정 되 고 긴-지속적인 통합 치료 세포의 게놈의 유전자의 결과. 이 방법은 효율적이 고 셀 라인 (예를 들어, HeLa 세포) 및 1 차 셀 (예를 들어, 인간의 기본 keratinocytes)에 적용 되 고 따라서 유전 공학 및 유전자 치료 이동에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다.

서문

T2 기반 transposon에 결합 된 활동적인 SB100X transposase 전 임상 유전자 치료 응용 프로그램^1,2,3, 게놈 수정^4,5에 이미 사용 되 고 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 프로그래밍^6,7. 일반적으로, SB 구성 요소 정도 플라스 미드 transfection에 의해 제공 됩니다 및 강한 제정 발기인 드라이브는 transposase의 표현. 그러나, transfection의 향상 된 새로운 방법에도 불구 하 고 배달 두 구성 요소 시스템의 많은 응용 프로그램에 대 한 도전 남아 있습니다. 따라서, 새로운 배달 프로토콜의 개발 증가 관심이 있다. 플라스 미드⁸ 및 mRNA⁹transfection 방법, 외 바이러스 배달 adenoviral^10,11, adeno 관련 바이러스 (AAV)¹², 잠재¹³, gammaretroviral^{14에 따라} 및 lentiviral 벡터¹⁵ 과거에 제안 되었습니다. 특히, 선택의 시스템에 바이러스 성 벡터의 통합 없이 SB 부품의 과도 납품을 보장 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, transposase의 구성 식 안전 관심사는 transposon의 통제 rehopping의 위험으로 인해 발생 합니다.

따라서, 세련 된 Tet-켜 짐 시스템에 의해 SB100X의 transcriptional 규칙은 첫 번째 도전 이다. 포진 심 플렉스 바이러스 1 (HSV-1)¹⁶, Timidine 키 니 아 제 (TK) 유전자의 최소 발기인 (-81)과 함께 원래 개발 된 최소한의 세포 (CMV) 발기인을 대체 하 여 얻은 수정된 Tet 응답 발기인 복제의 상류는 SB100X cDNA (pTetOTKSB100X) 돌연변이 역-항생물질-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ 다른 플라스 미드에 복제 강한 제정 발기인 (phosphoglycerate 발기인, PGK)의 통제 표현 된다 (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). 문화 매체에 추가, dox 바인딩합니다 rtTA2^s-M2 변조기 tethers Tet 발기인 복잡 하거나, SB100X 식¹⁸단단히 규제 유도 결과 및.

두 번째 주요 과제는 여러 가지 물리적, 화학적 방법으로 인간의 1 차 셀의 비효율적인 transfection에서 발생합니다. 효율적으로 인간의 세포 transfection는 SB100X 및 rtTA2^s에 transposase를 전달 하기 위해-M2 식 카세트 2 통합 결함이 lentiviral 벡터 (IDLVs)¹⁹으로 포장 된다: IDLVTKSB 및 IDLVrtTA2^s- M2입니다. 바이러스 성 벡터는 HEK293T 셀²⁰ 에 Vescicular 구내 염 바이러스 (VSV-G), 광범위 한 감염을 수 여 하의 당단백질 G와 pseudotyped 제 3 세대 벡터로 정도 생산 된다. 벡터 입자 ultracentrifugation에 의해 집중 되며 p24 immunocapture V 1 개 그에 의해 적정. 셀 라인 및 1 차 셀 transduce를 벡터 입자 polybrene에 complexed 고 dox의 유무에서 대상 셀으로 알을 품. 불리고 셀에 SB100X 식의 약 의존 활성화 양적 RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸에 의해 측정 됩니다.

Tet 규제 SB100X 식 시연, 일단 대상 세포 게놈으로 GOI (예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)의 전위 명확 하 게 박 고 Mikkelsen²¹에 의해 도식화 분자 이벤트를 다음과 같습니다. 제 3 IDLV 벡터 GOI T2 transposon 국세청 (IDLVT2) 간의 복제에 대 한 식 카세트는 건설 하 고 위에서 언급 한 대로 포장 운반. 마지막으로, 3 개의 IDLV 벡터 효율적으로 인간의 세포 (예를 들어, 기본 keratinocytes) 시험관에 transduce doxycycline¹⁸존재 GOI 통합을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 플라스 미드 고용

참고: 플라스 미드 pCCL-PGKrtTA2^S-m 2는 친절 하 게 교수 Zappavigna (모 데 나 대학 및 레지오 에밀리 아, 모 데 나, 이탈리아)에 의해 제공. PCMVSB100X 플라스 미드 활동적인 transposase의 코딩 시퀀스를 들고와 pT2/BH transposon 플라스 미드 친절 하 게 제공한 교수 Z. Ivics (폴 Ehrlich 연구소, 랑겐, 독일)와 교수 Z. Izvak (Max Delbruck 센터 분자 의학, 베를린, 독일)입니다.

1. 대장균 (대장균)에 모든 복제에 대 한 선택과 제한 효소 절차의 복제 전략 또는 복제할 파편의 PCR 증폭을 따릅니다.
   주: 표 1 이 프로토콜에 플라스 미드의 모든 요약 합니다. 대 한 설명 및 각 플라스 미드에 대 한 참조가 제공 됩니다.

2. 바이러스 성 벡터 생산

참고: 모든 바이러스 성 벡터는 기관 규칙 및 규정에 따라 BSL2 biosafety 견제 수준에서 생물 학적 후드에서 생산 됩니다.

1. Dulbecco의 수정이 글 중간에 문화 부착 HEK293T 세포 10 %HyClone 혈 청, 스-100 U/mL 페니실린와 2mm 글루타민 보충.
2. 하루 0: 5 15 cm 접시/바이러스 준비 및 매체의 30 mL에 씨앗 5.5x10⁶ 셀을 준비 합니다.
3. 제 1 일: Transfection
   1. Transfection를 시작 하기 전에 2 x HEPES 버퍼 식 염 수 (HBS) 100 mL를 준비:
      NaCl (5m) 5.6 mL
      HEPES (1 M) 10.0 mL
      나₂HPO₄ (0.5 M) 0.3 mL
      살 균 84.1 mL 물
      PH 7.1 37%에 조정 HCl.
      참고: 2 x HBS는 4 ° c.에 저장 될 수 있다 정확한 pH 효율적인 transfection에 대 한 매우 중요 하다. 최적의 pH 범위는 7.10 7.12.
   2. 매체를 제거 하 고 추가 transfection 전에 신선한 중간 4 h의 22.5 mL/접시.
   3. HEK293T 셀 전송 플라스 미드, pMD.Lg/pRRE.D64VInt 포장 플라스 미드, pMD2.G 봉투 인코딩 플라스 미드와 pRSV-레 브 (표 1) 다음 금액/접시에 transfect:
      플라스 미드 25.00 µ g를 전송
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µ g
      pMD2.G 8.75 µ g
      pRSV-레 브 6.25 µ g
      참고: 플라스 미드 DNAs CsCl 프로토콜 Maniatis²² 또는 내 무료 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 설명에 따라 준비 됩니다.
      1. Resuspend 살 균 물의 1.125 ml DNA (4 플라스 미드의 혼합)의 56.25 µ g을 2.5 M CaCl₂ (솔루션)의 125 µ L를 추가 합니다.
      2. 살 균 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (솔루션 B)에 2 x HBS의 1.250 mL를 추가 합니다.
      3. 추가 솔루션 (1.250 mL) B (1.250 mL)에 dropwise 버블링 하는 동안 1 개 또는 2 mL 피 펫 (transfection 솔루션, 총 볼륨 2.500 mL).
      4. 실 온 (RT)에서 20 분 동안 품 어.
      5. Dropwise 셀 단층 transfection 솔루션 (2.500 mL)의 모든 배포 P1000 micropipette를 사용 하 여.
   4. 37 ° C, 5% CO₂에서 셀 문화 인큐베이터에서 밤새 품 어.
4. 주 2: 매체를 제거 하 고 15 mL 신선한 매체의 추가 (단계 2.1 참조).
5. 제 3 일: 수집 하 고 집중 lentiviral 입자 포함 된 상쾌한.
   1. 모든에서 상쾌한 (~ 70 mL)를 수집 (n = 5) transfected 세포 판, 0.45 μ m PESS 필터링 및 2 polyallomer 튜브 (1 인치 x 3.5 인치) 작성을 통해 필터 / 바이러스 준비.
   2. 브레이크를 가진 15 ° C에서 2.5 h 106000 x g에서 ultracentrifugation에 의해 벡터 입자를 집중.
   3. 즉시 부드럽게 ()을 피하기 위해 튜브에 펠 릿의 물의 resuspension ultracentrifugation를 중지 한 후 10% 표 백제를 포함 하는 컨테이너에는 상쾌한을 부 어 및 1 x PBS의 100 µ L에 2 겨우 보이는 알갱이 일시 중단 (+ 1 %BSA). 이 펠 릿은 명확 하 고 매우 작은 정상입니다. 집중된 벡터 갓, 또는 aliquot를 사용 하 고 바이러스 준비-80 ° c.에 저장
      주의:는 상쾌한 lentiviral 입자를 생물 학적 폐기물에서 폐기 하기 전에 철저 하 게 표백 해야 합니다 포함 되어 있습니다.
6. 바이러스 성 벡터 준비 적정, 에이즈-1 개 그 p24 immunocapture 키트 제조 업체의 프로토콜에 따라 사용 합니다.
   참고: 바이러스 성 벡터 생산 표준화, 리 기반 시 약 채택 될 수 있었다. 그럼에도 불구 하 고, 바이러스 성 벡터 titer는 transfection 효율 및 플라스 미드 DNA의 순도 매우 의존 합니다.

3. 인간의 세포 라인 (예를 들어, HeLa 세포)의 변환

참고: HeLa 세포는 Dulbecco의 수정된 독수리의 매체와 10% 태아 종 아리 혈 청, 스-100 U/mL 페니실린, 2mm 글루타민 보충으로 경작 된 표 1 은이 프로토콜에서 사용 하는 벡터의 모든 요약 되어 있습니다. 각 벡터에 대 한 설명을 제공 합니다. 헬러 세포 변환 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합에 SB transposase의 transcriptional 규칙의 확인을 수 있습니다. IDLV 복용량의 벡터 입자 적정 및 대상 셀 형식을 관련이 있을 수 있습니다.

1. 하루 0: 3 ml 6 잘 플레이트의 각 음에 대 한 매체의 씨앗 2 x 10⁵ 셀. 4 우물을 준비 합니다.
2. HeLa 세포의 제 1 일: 변환입니다.
   1. 각 조건에 대 한 희석 lentiviral 벡터 1 mL 매체의 마지막 볼륨 (위의 참고 참조) polybrene (최종 농도 8 μ g/mL)의 10 μ의 존재:
      잘 # 1에 대 한 희석: 모의 불리고 셀 (부정적인 제어).
      잘 # 2에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (2600 p24의 ng).
      웰 스 #3, # 4에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (2600 p24의 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 벡터 (9600 p24의 ng).
   2. HeLa 세포 주 0에 도금 했다 각 우물에서 매체를 제거 하 고 해당 잘 lentiviral 벡터 희석을 추가 합니다.
   3. Spinoculate에서 20-25 ° C, 및 다음 이전 6 잘 플레이트 37 ° C, 5% CO₂셀 문화 인큐베이터에서 45 분 754 x g 6 잘 플레이트.
   4. 6 h 후 모든 우물에 신선한 매체와 매체 포함 벡터를 대체 하 고 추가 doxycycline 잘 # 4에 1 μ M. 48 h에 대 한 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 넣어.
3. 주 3: RNA 추출에 대 한 셀 펠 릿의 준비.
   1. 세포를 분리 하기 전에 트립 신 작업 솔루션 (1x) 준비:
      2.5 %trypsin (10 배) 5.0 mL
      500 mM EDTA (최종 농도 = 5 m m) 0.5 mL
      mL PBS 44.5 x 1
   2. 사용 하기 전에 37 ° C에서 따뜻한 trypsin 작업 솔루션입니다. 4 ° c.에 트립 신 작업 솔루션 저장
   3. 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀. 각 우물을 미리 데워 진된 37 ° C의 트립 신 작업 솔루션의 0.5 mL을 추가 하 고 (셀 문화 인큐베이터)에서 7 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   4. 부 화 후 추가 포함 하는 혈 청 0.5 mL trypsin 및 원심 분리기 튜브에 수집 셀 비활성화를 각 잘 중간. 1 x PBS의 3 mL에 각 잘 한 번 헹 구 고 5 분 240 x g 세포 현 탁 액을 원심.
   5. 1 x PBS, 240 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 하 고 상쾌한 삭제. 갓 수집된 셀 펠 릿을 사용 하 여 또는-80 ° c.에 저장 반 정량적 RT-PCR을 수행 하기 위해 펠 릿에서 총 RNA 추출 (6 단계 참조).

4. 인간의 1 차 셀 (예를 들어, keratinocytes)의 변환

참고: 인간의 기본 keratinocytes 치명적 방사능된 3T3-J2 셀 (피더 레이어)²³, 연의 Barrandon (EPFL, 로잔, 스위스)에서 종류 선물에 시드 있습니다.

1. Dulbecco의 수정이 글 중간 10% 기증자 소 혈 청, 스-50 U/mL 페니실린, 4mm 글루타민 (3T3 매체)와 보완에 스위스 마우스 J2 3T3 세포 성장.
2. Keratinocytes 류 매체, Dulbecco의 수정이 글 중간에 햄의 F12 매체 혼합물 (3:1) 치명적 방사능된 3T3-J2 세포를 소 태아 혈 청 (10%), 페니실린-스 (1%), 글루타민 (2%), 인슐린 (5 µ g/mL), 아데닌 (를 포함 하는 도금을 성장합니다 0.18 m m), 하이드로 코 티 손 (0.4 µ g/mL), 콜레라 독 소 (0.1 nM), 및 triiodothyronine (2 nM).
3. 하루 0: 시드 3 x 10⁵ 치명적 3T3 J2 셀, 이전 1 X 10⁵ 셀/mL, 6 잘 플레이트의 각 우물에서의 최종 농도에 3T3 매체로 희석 반구. 9 웰 스를 준비 합니다.
4. 기본 keratinocytes의 제 1 일: 변환
   참고: keratinocytes의 변환 (여 qRT-PCR) 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합에 SB transposase의 transcriptional 규칙의 부 량 수 (cytofluorimetric에 의해 통합의는 GOI (GFP) 대상 셀에서을 확인 하려면 분석)입니다.
   1. 세포를 분리 하기 전에 트립 신 작업 솔루션을 준비:
      0.5 트립 신-EDTA % (10 배) 5.0 mL
      500 mM EDTA (최종 농도 = 5 m m) 0.5 mL
      mL PBS 44.5 x 1
   2. 사용 하기 전에 37 ° C에서 따뜻한 trypsin 작업 솔루션입니다. 4 ° c.에 트립 신 작업 솔루션 저장
   3. 문화에 subconfluent keratinocytes를 분리 하려면 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS와 셀 각 우물을 미리 데워 trypsin 작업 솔루션의 1 mL를 추가. 셀 문화 인큐베이터에서 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
   4. Resuspend 우물의 세포는 부 화 후 철저 하 게 포함 하는 혈 청의 2 개 mL를 포함 하는 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 매체 (많은 세포는 여전히 연결 되어 있다면, 품 어 37 ° C에서 추가 분에 대 한). 3 mL PBS 또는 신선한 매체 x 1의 각 잘 한 번 헹 구 고 린스 솔루션 세포 현 탁 액을 원심 관에 추가.
   5. 580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
   6. 1 x PBS, 580 x g에 5 분 동안 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 하 고는 상쾌한 삭제.
   7. 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 1.6x10⁵ keratinocytes 류 매체, 각 조건에 대 한 희석의 1 mL에 희석.
   8. Polybrene (2 mL의 최종 볼륨에서 8 µ g/mL의 최종 농도)의 20 μ 존재 류 매체의 1 mL에 lentiviral 벡터 희석:
      웰 스 #1, #2, # 3에 대 한 희석: 모의 불리고 셀 (부정적인 제어 벡터 없이).
      웰 스 #4, # 5에 대 한 희석: IDLVTKSB 벡터 (13000 p24의 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 벡터 (48000 p24의 ng).
      희석 우물 #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB 벡터 (13000 p24의 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 벡터 (48000 p24의 ng) + IDLVT2 벡터 (9,160 p24의 ng).
   9. 해당 keratinocyte 정지 (1 ml에서 1.6x10⁵ keratinocytes)에 각 lentiviral 벡터 희석 (1 mL)을 추가 하 여 셀에에서 transduce.
   10. 치명적 방사능된 3T3-J2 셀 0 및 그들에 불리고 플레이트 keratinocytes (2 ml에서 1.6x10⁵ keratinocytes)에 시드에서 매체를 제거 합니다. 시험 잘 후 다음으로 진행 합니다.
   11. 30 분, 25 ° C에서 품 어 그리고 셀 6 h에 대 한 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에 전송.
       참고: 생존 및 확산 강하게 영향을 받을 것으로 spinoculate 기본 keratinocytes를 하지 마십시오.
   12. 6 h 후 각 잘 하 류 매체의 1 mL를 추가 합니다. #5, #8, #9 스에서 1 μ M doxycycline (최종 농도)를 추가 합니다. 37 ° c 셀 반환
5. 주 2: 10 ng/mL EGF와 KC 매체의 3 mL 류 매체를 바꿉니다.
6. 제 3 일: Trypsinize 고 웰 스 #1, #4, # 5로 설명 (참조 4.4.1 4.4.6) 앞에서 세포를 씻어. QRT-PCR 분석에 대 한 총 RNA 추출-80 ° C에서 펠 릿 셀 고정 (7 단계 참조).
7. 4.4.1 4.4.5 단계에 설명 된 대로 잘 #2, #6, # 8에서 셀 trypsinize 및 GFP 식에 대 한 cytofluorimetric 분석 수행 (단계 5 참조).
8. #3, #7 및 #9 우물 적어도 3-4 doublings, 유엔 통합된 IDLVT2 벡터 (인간의 기본 keratinocytes 급지대 레이어에 도금에 대 한 일)을 희석 하기에 충분 한에 대 한 문화를 유지.
9. 제 6 일: 약 5 일 변환 게시, #3, #7 및 #9 GFP 식에 대 한 cytofluorimetric 분석을 수행 하기 위해 우물에서 (보십시오 단계 4.4.1 4.4.5) 셀 trypsinize (단계 5 참조).
   참고: 실험 타이밍 및 변환 효율은 높은 영향을 기본 셀 유형 및 수집 된 샘플의 다양성.

5. Cytofluorimetric 분석 기본 keratinocytes 불리고

참고: 블루 레이저를 사용 하 여 구성 흐름 cytometer (488 nm), 빨간 레이저 (633 nm) GFP와 APC 형광의 탐지는 사용에 대 한 필터 ( 자료 표참조).

1. 3T3 J2 급지대 레이어에서 keratinocytes를 차별, 레이블 불리고 keratinocytes 3 일과 하루 6 (단계 4.7 그리고 4.9 참조)에서 분리 된 단일 클로 널 APC 마우스-활용된 안티 피더 항 체.
   1. 각 샘플에 대 한 버퍼를 얼룩이 지기의 4 mL를 준비:
      5% FBS 200 Μ
      500 mM EDTA (최종 농도 = 2.5 m m) 20 μ
      PBS 1 x 3780 μ
   2. 워시 버퍼를 얼룩이 지기의 1 mL와 분리 된 세포. 580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
   3. 교류 cytometry 인수에 대 한 튜브에 얼룩 버퍼의 100 μ에서 5 x 10⁴ 셀을 resuspend 하 고 안티 피더 항 체 (1:50)의 2 μ를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 어둠 속에서 얼음에 30 분 동안 품 어.
   4. 30 분 후 버퍼를 얼룩이 지기의 2 mL로 씻으십시오. 580 x g에 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 버퍼를 얼룩이 지기의 200 μ에 resuspend.
   5. Cytofluorimetric 분석¹⁸에 의해 송출 및 GFP 신호를 취득 합니다. APC^- 세포 인구의 GFP⁺ 셀 분수 불리고 keratinocytes를 나타냅니다.
      참고: 원하는 경우, PBS 1에서에서 2 %paraformaldehyde cytometry 전에 스테인드 샘플 수정 x 및 실행까지 어둠 속에서 4 ° C에서 저장소.
2. GFP⁺의 비율 사이 비율을 그려서 흐름 cytometry 데이터 분석끝점 (5 일)⁺GFP의 비율에서 셀셀 2 일 게시물 IDLVT2 불리고의 잔여 수준으로 정규화 변환 셀입니다.

6. 반 정량적 RT-PCR

참고: PCR 열 cycler를 사용 합니다.

1. 추출 총 RNA에서 불리고 또는 제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 셀을 제어 합니다.
   참고: 총 RNA는-80 ° c.에 저장 될 수 있다
2. 100을 사용 하 여 20 µ L 반응에 cDNA 합성 총 RNA의 역전사 키트, 제조 업체의 프로토콜에 따라 ng.
   참고: cDNA는-20 ° c.에 저장 될 수 있다
3. SB100X, rtTA2^s에 대 한 특정 디자인 뇌관-m 2와 GAPDH (내부 관리 유전자).
   제안 된 디자인:
   SB 전달 뇌관: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
   SB 반전 뇌관: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
   rtTAM2 전달 뇌관: 5'-GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
   rtTAM2 반전 뇌관: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
   GAPDH 전달 뇌관: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
   GAPDH 반전 뇌관: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
4. 50 µ L의 최종 반응 볼륨에서 PCR을 수행 합니다. 특히, 각 PCR 튜브에 조립 다음 반응:
   (6.2 단계)에서 (1:5 희석) cDNA 1.00 µ L
   뇌관 (10 µ M 주식) 전달 1.00 µ L
   반전 뇌관 (10 µ M 주식) 1.00 µ L
   dNTPs (10 µ M 주식) 1.00 µ L
   버퍼 (+ MgCl₂) (배 재고) 5.00 µ L
   Taq 중 합 효소 (5 U / µ L 주식) 0.25 µ L
   메 마른 물 40.75 µ L
5. 열 cycler의 다음 프로그램을 사용 하 여: 1 주기 95 ° C에서 5 분 동안 다음 진행 95 ° C 30에 대 한 s, 58 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 SB100X에 대 한 34 주기 위한 s, rtTA2^s32 주기-M2 그리고 GAPDH 25 주기.
6. 1 %agarose 젤 준비. 비 커 나 플라스 크 (10 x 주식 살 균 물에 희석), x TBE 1의 100 ml에서 agarose의 1 g을 분해. 전자 레인지, 소용돌이 agarose는 완전히 용 해 될 때까지 매 순간에에서 녹아. 약 50 ° C를 도달할 때까지 녹 인된 agarose를 냉각 하 고 ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 주식)의 5 µ L를 추가 합니다. 녹은 agarose 젤 캐스팅 빗 조립된 젤 트레이에 붓으십시오.
7. Agarose 젤에 샘플 (10 µ L 각)를 로드 하 고 전기 영동을 수행.
8. 원하는 경우, 젤 그림을 취득 하 고 PCR 악대에 densitometric 분석을 수행.

7. 양적 RT-PCR (qRT-PCR)

참고: 상업 시퀀스 검출 시스템 채택 된다. PCR 뇌관 및 6-carboxyfluorescein (FAM) 프로브 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH)에 대 한 상업적으로 구매 된다.

1. 복고풍-전사 단계 6.2 참조.
2. 소프트웨어를 사용 하 여 뇌관 디자인 및 SB100X에 대 한 특정 조사.
   제안 된 디자인:
   SB.2 전달 뇌관: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
   SB.2 반전 뇌관: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
   SB 팸 프로브: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
3. PCR 주인 혼합으로 96 잘 접시에 실시간 PCR을 수행 하 고 프라이 머 + 프로브 믹스, 25 µ L의 최종 반응 볼륨에서. 특히, 각 잘 다음 반응을 고려 하십시오.
   cDNA (1시 10분 살 균 물에 희석) 1.00 µ L
   마스터 믹스 12.50 µ L x 2
   프라이 머 + 20 x 프로브 믹스 1.25 µ L
   메 마른 물 10.25 µ L
   참고: 3 중에서 모든 반응을 수행 합니다. Pipetting 오류를 방지 하려면 (cDNA) 없이 적어도 n + 3 반응에 대 한 혼합을 준비 합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 약 수입니다.
4. 다음 프로그램을 사용 하 여 실시간 PCR 실행: 95 ° c 10 분, 다음 95 ° C의 40 주기 1 주기 15 s와 1 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 60 ° C
5. 2^-ΔΔCT 정량화, 일반적인 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 동일한 cDNA 샘플의 GAPDH의 수준에 SB100X의 상대 식 (RQ 값)을 정상화 하 여 qRT-PCR 데이터를 분석.

결과

여기, 제시 된 절차를 사용 하 여 레 귤 레이트 된 SB 부품을 운반 하는 3 개의 IDLV 벡터 (SB100X, rtTA2^S-m 2와 t 2-GFP transposon) 포장 하 고 효율적으로 제공 하 고 밀접 하 게 인간의 세포에서 SB 시스템을 조절 하는 데 사용 했다. 그림 1A 는 생체 외에서 변환 HeLa 세포 ( 표 2에 보고 된) 두 IDLV 벡터의 좋은 복용량 조합으로 SB transposase...

토론

여기, 우리는 안정적으로 GOI 잠자는 미녀여 대상 세포의 게놈으로 통합 하는 광범위 하 게 액세스할 수 있는 방법론을 설명-이항 중재. SB 시스템 게놈 편집에 대 한 nonviral 방법을 제공 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 통합 기계 (transposase 및 T2 transposon)의 효율적인 제공은 필수입니다. 따라서, SB 시스템을 사용 하 여 거의 transfectable 1 차 셀에,에 SB 구성 요소의 바이러스 배달 최근 몇 년 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.