تتبع نيورواناتوميكال إلى الوراء للخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران بعد التسليم المؤدية من fluorophore مترافق الكوليرا السمية الوحيدات بيتا. تتم مقارنة اثنين من التقنيات لحقن التجويف الجنبي: ترانسديافراجماتيك مقابل النهج عبر الصدر.

Abstract

فرينيك الخلايا العصبية الحركية هي سرطان عنق الرحم من الخلايا العصبية الحركية مصدرها C3 إلى مستويات C6 في معظم الثدييات. إسقاطات محواري تتلاقى في الأعصاب فرينيك إينيرفاتينج الغشاء الرئوي. في الحبل الشوكي الشرائح، لا يمكن تحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك من سائر الخلايا العصبية الحركية في المعايير المورفولوجية أو البيوكيميائية. نحن نقدم وصفاً للإجراءات لتصور فرينيك العصبون خلية الهيئات في الفئران، التالية المؤدية حقن الكوليرا السمية الوحيدات بيتا (الحظر) مترافق فلوروفوري. هذا التتبع نيورواناتوميكال نيون لديه القدرة على أن المحاصرين في الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز، ويتم ريتروجراديلي على طول محاور عصبية فرنك والتوصل إلى الهيئات الخلية فرنك. المقارنة بين هذين النهجين المنهجية المؤدية التسليم الحظر الشامل للتجارب: ترانسديافراجماتيك مقابل حقن عبر الصدر. كلا النهجين بالنجاح وتسفر عن عدد مماثل من الحظر الشامل للتجارب المسماة الخلايا العصبية الحركية فرنك. وفي الختام، يمكن تطبيق هذه التقنيات تصور أو تحديد حجم الخلايا العصبية الحركية في مختلف الدراسات التجريبية مثل تلك التي تركز على الدوائر حجاب فرنك فرنك.

Introduction

الهدف من هذه الدراسة تقديم طريقة موثوقة لتحديد فرنك من الخلايا العصبية الحركية (فمن) في أقسام النخاع الشوكي الماوس. حقن التتبع نيورواناتوميكال الفلورية في التجويف الجنبي اختير كأسلوب التسليم للتوصل إلى الإسقاطات العضلية فرينيك على الحجاب الحاجز واستخدام وسائل النقل إلى الوراء على طول محاور عصبية فرينيك لتسمية فرينيك خلية الهيئات. يتم وصف الأساليب اثنين من التسليم المؤدية: ترانسديافراجماتيك مقابل عبر الصدر.

الخلايا العصبية الحركية فرنك هي خلايا العمود الفقري ترحيل محاور عصبية التي تتلاقى في الأعصاب فرنك، الذي يعصب الحجاب الحاجز في نهاية المطاف. هذه هي أقل من الخلايا العصبية الحركية تلقي محرك الأقراص الشهيقيه من المراكز التنفسية الصلبية وترحيل فإن الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز (NMJ). صممت بحيث فمن إلى عمودين موتور، واحد لكل هيميكورد، يعمل على طول العمود الفقري منتصف عنق الرحم. في معظم أنواع الثدييات بما فيها البشر، انتشار الأعمدة موتور فرنك من مستويات C3 إلى C6^1،،من²³. وأكد نحن والآخرين أن فمن تتركز في مستويات C3 C5 في الفئران والفأر الحبل الشوكي^4،5،6،،من⁷⁸. توزيع الخلايا فرينيك الطبوغرافية ليست بشكل عشوائي؛ يتم توزيع الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء القصية من الحجاب الحاجز أكثر كثافة في الجزء الجمجمة تجمع السيارات فرينيك (C3)، في حين الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء المغبنية والذيلية أكثر (C5)⁹. وعلاوة على ذلك، تتجمع فمن طرق مختلفة في القرن البطني الرمادية. مستوى C3، تكمن مجموعات الخلايا فرينيك أفقياً، ثم التحول في اتجاه فينترولاتيرال، وتم العثور على فينتروميديالي في معظم والذيلية مستويات^10،11.

نظراً لدورها الحيوي خلال الإلهام، أهمية قصوى دقة تحديد فمن في الحبل الشوكي سليمة ولكن أيضا متابعة مصيرهم خلال الحالات المرضية، مثل الأمراض التنكسية أو الإصابات الرضية للحبل الشوكي. منذ فمن ولا تختلف شكلياً عن سائر الخلايا العصبية الحركية عنق الرحم، تحديد فمن يعتمد على التنفيذ الهادف لتتبع نيورواناتوميكال أما على مستوى مراكز التنفس الأولية⁸، أو الحجاب الحاجز NMJ⁷ أو في العصب فرنك⁴. التتبع هو تناول الألياف العصبية والتي تصل إلى الهيئات فرينيك بخلية في العمود الفقري العنقي، حيث أنه يمكن تصور استخدام نظم الكشف المباشر أو غير المباشر. الوراء أو تتبع anterograde متوفرة تجارياً مع طائفة واسعة من يصرف. الجدير بالذكر، هبت كل التتبع مع لا، قدرات عالية أو منخفضة للتتبع عبر متشابك.

في الدراسة الحالية، واخترنا الوحيدات بيتا من سموم الكوليرا (الحظر) فونكتيوناليزيد مع أليكسا فلور 555 (يشار إليها من الآن فصاعدا الحظر الشامل للتجارب-fluorophore) كتسمية فلورسنت، مما يتيح تصور مباشرة من فمن على أقسام النخاع الشوكي المجمدة. الحظر الشامل للتجارب يوصف عادة تتبع مونوسينابتيك على الرغم من أن البيانات التجريبية وتميل إلى إظهار مرور ترانسنيورونال¹². الحظر الشامل للتجارب لديه القدرة على ربط جانجليوسيدي GM1 في غشاء البلازما لإنهاء العصب. الحظر الشامل للتجارب متغللة عبر الآليات ويهرب من خلال شبكة ترانس-غولجي تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة في هيولى في^13،أزياء الوراء¹⁴. الاستيعاب والنقل إلى الوراء يبدو أن تعتمد على ال^15،سيتوسكيليتون أكتين¹⁶ فضلا عن شبكة ميكروتوبولي¹⁷.

وتم تسليم fluorophore الحظر الشامل للتجارب لإثبات جدوى الحظر الشامل للتجارب الراسم نيورواناتوميكال إلى الوراء وسم الدوائر الحجاب الحاجز-فمن، إينترابليورالي. الحظر الشامل للتجارب كانت تدار باستخدام تقنيات اثنين: الأول المدرجة فتح البطن وحقن ترانسديافراجماتيك متعددة؛ ثانية واحدة، أقل الغازية، تستخدم حقن عبر الصدر فريدة من نوعها. أربعة أيام تم قياس كمية فمنس في وقت لاحق، المسمى فلوريسسينتلي في الحبل الشوكي عنق الرحم من كلا من سليم ومن جرح سبينالي الحيوانات (C4).

Protocol

البروتوكول التجريبي أجرى امتثالا "توجيهات مجلس الجماعات الأوروبية" "التجربة الحيوانية" (2010/63/الاتحاد الأوروبي، 86/609/EEC و 87-848/EEC) وأقر "الحيوان الأخلاقيات اللجنة للجامعة من نامور" (أخلاقيات المشروع n ° 17-284 ). ويصور الشكل 1 النهجين كل منهما: ترانسديافراجماتيك أو حقن عبر الصدر. استخدام C57bl/6J الفئران الذكور (ن = 18)، والذين تتراوح أعمارهم بين 3 إلى 4 أشهر في الدراسة.

1-إعداد الحل الحظر الشامل للتجارب

1. للحقن ترانسديافراجماتيك:
   1. حل قوة الحظر الشامل للتجارب في الماء المعقم بتركيز 0.2% (w/v).
   2. تحميل ميليلتر 7.5 حل الحظر الشامل للتجارب (0.2% w/v) في معقم 10-ميليلتر-ميكروسيرينجي مع إبرة 33-قياس مرفقة (مجسم مشطوف الحواف حادة أو قصيرة) لكل الماوس.
2. لحقن عبر الصدر:
   1. حل قوة الحظر الشامل للتجارب في الماء المعقم لتركيز 0.1% (w/v).
   2. تحميل 20 ميليلتر من حل الحظر الشامل للتجارب (0.1% w/v) في حقنه الأنسولين-500-ميليلتر عقيمة بإبرة 27-قياس مشطوف الحواف لكل الماوس.
      ملاحظة: تأكد من استخدام الماء المقطر والمعقم ويحل المسحوق الحظر الشامل للتجارب بشكل صحيح. يمكن أن تظل الحل عند 4 درجة مئوية لمدة شهر (عدم تجميد). قد تشكل متسرعا بعد أيام قليلة. تحقيق الحل لدرجة حرارة الغرفة وتخلط جيدا باستخدام ماصة قبل الاستخدام.

2-إعداد قبل الحقن المؤدية

1. تعقيم الأدوات الجراحية قبل الجراحة، استخدام معقم اﻷوتوكﻻف أو حبة الزجاج. إعداد معطف مقاعد البدلاء نظيفة للقيام بعملية جراحية، والتصرف في الأدوات الجراحية.
   ملاحظة: يجب أن يكون أي المواد المستخدمة أثناء العملية الجراحية العقيمة. الصكوك التي لا يمكن تعقيمها مثل ميكروسيرينجي يجب أن تزول إلى أسفل مع مطهر (الكلورهكسيدين) أو ينبغي أن تستخدم مرة واحدة فقط. الجراح يجب غسل الأيدي حقه بمطهر (فرك الكلورهكسيدين) قبل بداية عملية جراحية. الجراح يجب ارتداء قفازات معقمة وفاسيماسك ثوب نظيف.
2. وزن الحيوان، وإدارة جرعة مناسبة من التخدير: حقن داخل مخدر كوكتيل (مثل الكيتامين 100 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ).
3. قرصه إصبع القدم و/أو التحقق من فقدان المنعكس بالبيبرال تحديد ما إذا كان يتم تخديره الماوس بشكل صحيح. تطبيق مرهم التعليم والتدريب المهني لحماية القرنية.
4. يحلق بعناية الجلد البطني (لإجراء ترانسديافراجماتيك) أو حق من جانب الصدر الجلد (للإجراء عبر الصدر)، باستخدام مقص الشعر الكهربائية. يحلق جيدا وواسع ما يكفي للحيلولة دون الدخول في ميدان جراحة الشعر.
5. ضمان ظروف معقمة بتطبيق موضعي للحل اليود 10% في منطقة حلق. فرك الموقع الجراحي مع الحل اليود، مع الحرص على فرك من مركز الموقع تجاه المحيط الخارجي.
6. استخدام لوحة هوميوثيرميك طوال عملية جراحية للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان.

3-المؤدية الحقن باستخدام نهج ترانسديافراجماتيك

1. تقع أسفل الماوس أنيسثيتيزيد في موقف ضعيف على وسادة تدفئة. ضع وسادة شاش تدحرجت تحت رقبة الحيوان. لماوس الكبار، استخدام وسادة شاش تدحرجت من 0.5 بوصة في السمك. الشريط هذه اللوحة إلى المجلس عملية جراحية لتجنب حركة إذا أي.
2. استخدام شفرة المبضع، جداً الجلد البطني على طول خط الوسط: جعل شق من عملية الرهابه إلى منطقة السرة بينما تمتد الجلد جانبياً باليد الأخرى لجعل الجلد مشدود. لا يتم تطبيق الكثير من الضغط على شفرة لتجنب إتلاف الأجهزة الأساسية.
3. بعناية باستخدام مقص صغير، فصل الجلد من عضلات البطن حول الشق. وسيساعد هذا الإجراء في خياطة العضلات والجلد عن بعضها البعض في نهاية الجراحة.
4. القيام بفتح البطن باستخدام مقص صغير. فتح التجويف البطني عن طريق إجراء شق بوتونهولي على مستوى السرة. جداً في عضلات البطن على طول الخط الأبيض ("لينيا ألبا") تصل إلى عملية الرهابه.
5. من أجل تصور سطح البطن من الحجاب الحاجز، سحب عضلات البطن باستخدام الكامشات تجارية أو محلية الصنع.
   ملاحظة: يمكن إجراء هذه الكامشات من ميدي-حجم الورق مقاطع تتشكل في هوك ل¹⁹.
6. تمتد على كلا الجانبين لفتح البطن، والشريط إلى أسفل الكامشات إلى معطف مقاعد البدلاء. تحسين الإضاءة من مجال الرؤية حتى لا يكون لا أكثر في غبش السطح البطني للحجاب الحاجز. جهاز إضاءة أقوى لهذا الغرض مصباح LED مع شعاع ضوء أورينتابل.
7. استخدام الملقط لينة في يد واحدة، رفع الملحق إكسيفويد وهدم الفصوص الجانبية للكبد (الشكل 2A). باستخدام مقص صغير في اليد الأخرى، بعناية قطع في الرباط سوسبينسوري، دون إلحاق الضرر بالمرارة أو الحجاب الحاجز (الشكل 2).
8. استخدام الملقط لينة في يد واحدة، رفع الملحق إكسيفويد. فهم المحاقن هاملتون في اليد الأخرى. استهداف المواقع الثلاثة للحقن في هيميديافراجم الصحيح تغطي على التوالي القصية، الآنسي والمناطق المغبنية (الشكل 3 ألف، اقحم في الشكل 3).
9. كما سمك الغشاء حوالي 0.37 ملم في الفئران⁷، إدراج مم إبرة لا يزيد عن 1 أو 2 بعد ورقة الحجاب الحاجز لمنع الأضرار الرئة أثناء التنفس. تسليم 2.5 ميليلتر من الحظر الشامل للتجارب الحل (0.2% w/v) عن طريق الحجاب الحاجز الحق في كل موقع (الشكل 4 باء). تحقيق الاستقرار للحجاب الحاجز غير مطلوب.
10. كرر هذا الإجراء لثلاثة مواقع عن الحقن (الشكل 1A)، وكونترالاتيرالي لتسمية ثنائية تجمع فمن.
11. لإغلاق الموقع فتح البطن، خياطة عضلات البطن مع ريسوربابل خياطة 4-0. استخدام غرز توقف متباعدة من 3 مم-الجلد تدبيس مغلقة مع مقاطع 9.0 ملم الجرح. تشديد المواد الغذائية الأساسية للحيلولة دون سحب قبالة المواد الغذائية الحيوانية. مساحة الدبابيس بعيداً حوالي 5 ملم. عدم المبالغة في تشديد المقاطع الجرح، وهذا يمكن أن يؤدي إلى شفاء البصر.
12. المحاقن النظيفة الصغيرة مع الماء المقطر للحيلولة دون انسداد. رسم ببطء وطرد 2-3 مرات. لا رسم الهواء في محقن.

4-المؤدية الحقن باستخدام "النهج عبر الصدر"

ملاحظة: هذا الأسلوب هو مستوحاة من الإجراء الموضح في الفئران⁴ وتم تكييفها للماوس.

1. تقع أسفل الماوس أنيسثيتيزيد في اليسار موقف استلقاء الأفقي، على وسادة تدفئة (الشكل 4 أ).
2. تحديد الأضلاع السادسة والسابعة تحت منطقة الكوع بالجس اليدوي (الشكل 4 باء).
3. بينما مساعد يمتد حق الصدارة-وهند-أطرافه (الشكل 5A)، إدراج المحاقن cranially الموجه وعرضية تحت السادسة أو الضلع السابع، 3 مم العميقة من الجلد، ومع المجسم مشطوف الحواف إلى الأسفل (الشكل 1B و الشكل 5 (ب)).
4. رفع الإبرة برفق لتأكيد، من خلال رفع الأضلاع، أن ذلك هو في وضع جيد في تجويف الصدر (الشكل 5، insets في الشكل 1B).
5. استقرار التنفس حركات الصدر عن طريق تطبيق ضغط طفيف مع اثنين من أصابعه على جدار الصدر.
6. أثناء الضغط حقنه في ناحية أخرى، تسليم 20 ميليلتر من حل الحظر الشامل للتجارب (0.1% w/v) في حقنه واحدة.

5-بعد العمليات الجراحية الرعاية

1. مباشرة بعد هذا الإجراء، وضع الماوس في وضع استلقاء جانبية الحق على منصة هوميوثيرميك لاسترداد. وهذا يكفل التتبع تنتشر على الجانب الأيمن من التجويف الجنبي ويسمح بمراقبة التنفس للحيوان.
2. إدارة 1 مل من المحلول الملحي العقيمة القائمة تحت الجلد. توفير الحقن المتابعة إذا ظهر الحيوان المجففة و/أو فاتر.
3. إدارة 0.1 مغ/كغ البوبرينورفين، تحت الجلد مرتين في يوم خلال يومين بعد الجراحة الأولى، التقليل إلى أدنى حد من أي ألم المحتملة.
   ملاحظة: العديد من المؤسسات أن أوصى التسكين المتعدد الوسائط من أجل إجراءات الغازية، مثل فتح البطن يصور هنا. ويمكن أن يشمل استخدام أدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (الأدوية المضادة للالتهاب) و/أو عامل مخدر موضعي في موقع شق. عادة ما يتم تسليم هذه الأدوية قبل الشق الأول للتقليل من الألم التصفية.
4. مراقبة الحيوانات يوميا يصل إلى القتل الرحيم.

النتائج

C57bl/6J الفئران الذكور (ن = 18)، سن من 3 إلى 4 أشهر وأدرجت في الدراسة. في اليوم 0 من التجربة، خضع 8 الفئران كدمة C4 انفرادية، من جانب الحق، وفقا لبروتوكول نشر^7،18. كإجراءات صورية، خضع الفئران 10 الصفيحة على رأس الخلية C4 دون كدمة. في اليوم الثالث، أعدت ا?...

Discussion

يمكن تطبيق البروتوكول المبينة في هذا التقرير إلى أي سلالة من الفئران الكبار أو أي النموذج التجريبي الذي ينبغي تقييم سلامة الدوائر فمن الحجاب الحاجز. على سبيل المثال، التصلب العضلي الجانبي (المرض)، وإصابات النخاع الشوكي عنق الرحم (كسسي) هي الشروط المرتبطة بفقدان فمن، انحطاط anterograde فرنك محا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm