Ретроградная нейроанатомический трассировки диафрагмальный двигательных нейронов у мышей

Резюме

Здесь мы описываем протокол для выявления диафрагмальный двигательных нейронов в мышей после доставки внутриплевральной Флюорофор конъюгированных бета Субблок токсинов холеры. Придать плевральной полости сравниваются две техники: transdiaphragmatic против Трансторакальная подходов.

Аннотация

Диафрагмальный моторные нейроны являются шейки матки двигательных нейронов, возникая от C3, C6 уровни в наиболее млекопитающих. Аксональное прогнозы сходятся в диафрагмального нервов, иннервирующих дыхательной диафрагмы. В спинном ломтиками диафрагмальный моторные нейроны нельзя определить от других двигательных нейронов на морфологические и биохимические критерии. Мы предоставляем описание процедур для визуализации диафрагмальный мотонейрона клеток органов мышей, следующей инъекции внутриплевральной холеры бета Субблок токсин (СТВ) проспряганное Флюорофор. Этот флуоресцентные нейроанатомический трассирующими имеет возможность догнал на стыке нервно диафрагмы, перевозиться retrogradely вдоль диафрагмальный аксонов и достичь диафрагмальный клеток тела. Сравниваются два методологических подходов внутриплевральной CTB доставки: transdiaphragmatic против Трансторакальная инъекции. Оба подхода являются успешными и привести к аналогичное количество CTB-меченых диафрагмальный двигательных нейронов. В заключение эти методы могут применяться для визуализации или количественно диафрагмальный двигательных нейронов в различных экспериментальных исследований, таких как тех, сосредоточены на Диафрагма диафрагмального схемы.

Введение

Цель исследования заключается в представлении надежный метод идентификации диафрагмальный двигательных нейронов (PhMN) на мышь спинной секции. Инъекции флуоресцентные нейроанатомический трассировщика в плевральной полости был выбран в качестве метода доставки достичь диафрагмальный нервно проекции на диафрагму и использовать Ретроградная транспорта вдоль диафрагмальный аксоны маркировать диафрагмальный клеток органов. Описаны два способа доставки внутриплевральной: transdiaphragmatic против трансторакальный.

Диафрагмальный моторные нейроны являются клетки спинного реле, чьи аксонов сходятся в диафрагмального нервов, которые в конечном итоге иннервируют диафрагмы. Это Нижняя моторные нейроны получают вдоха езды от бульбарной дыхательных центров и ретрансляции для диафрагмы нейро мышечной развязок (NMJ). PhMN структурированы в мотор две колонки, одна для каждого hemicord, идущую вдоль середины шейного отдела позвоночника. В большинстве видов млекопитающих, включая человека диафрагмальный мотор столбцы распространилась от уровней C3 С6^1,2,3. Мы и другие подтвердили, что PhMN в основном в С3-С5 уровнях в крысы и мыши спинного^4,5,6,,^7,8. Топографический распределение диафрагмальный клеток не является случайным; двигательных нейронов, иннервирующих грудная часть диафрагмы распределяются более плотно в черепной части диафрагмальный автопарк (С3), тогда как моторные нейроны, иннервирующих части голеней являются более хвостового (C5)⁹. Кроме того PhMN сгруппированы различно в вентральной Рог серого вещества. На уровне С3 кластеры диафрагмальный клетки лежат сбоку, то они сдвиг в направлении, вентролатеральной и ventromedially, находятся в наиболее хвостового уровней^10,11.

Учитывая их жизненно важную роль во вдохновение, это крайне важно точно определить PhMN в спинной мозг здорового, но также следить за их судьбу в ходе патологических состояний, таких как дегенеративных заболеваний или травм спинного мозга. Так как PhMN не морфологически отличаются от других шейки матки двигательных нейронов, выявление PhMN опирается на адресности нейроанатомический Трейсеры либо на уровне первичной дыхательных центров⁸, или в Диафрагма NMJ⁷ или в диафрагмальный нерв⁴. Трассировщик принятые нервных волокон и осуществляется до диафрагмальный клеток тела в шейном отделе позвоночника, где могут быть визуализированы с помощью систем прямого или косвенного обнаружения. Антероградная Трейсеры коммерчески доступны с широким спектром конъюгаты или ретроградной. Примечательно, каждый трассирующими наделен нет, низкой или высокой способности для транс синаптических трассировки.

В текущем исследовании мы выбрали бета Субблок холеры токсин (СТВ) функционализированных с Alexa 555 Fluor (далее CTB-Флюорофор) как флуоресцентные метки, позволяя прямой визуализации PhMN на замороженных спинной секции. CTB обычно описывается как трассировщик monosynaptic хотя экспериментальных данных, как правило, чтобы показать transneuronal проход¹². CTB обладает способностью связывать Ганглиозиды GM1 на плазматической мембране нервные окончания. CTB включены через Клатрин зависимые или - независимые механизмы и трафика через сеть транс Гольджи в эндоплазматический ретикулум в ретроградное мода^13,14. Ретроградная транспорта и интернализации, как представляется, зависит от Цитоскелет актина,^15,,¹⁶ , а также сети микротрубочек¹⁷.

Чтобы продемонстрировать полезность ДВЗИ как Ретроградная нейроанатомический трассирующими маркировки диафрагма PhMN схема, СТВ Флюорофор было поставлено intrapleurally. CTB осуществлялось с помощью двух методов: первая включала лапаротомии и несколько transdiaphragmatic инъекции; Вторая, менее инвазивные, используется уникальный Трансторакальная инъекции. Четыре дня спустя, дневно меченых PhMNs были количественно оценены в шейного отдела спинного от обоих из здоровых и spinally povrejdennyx животных (C4).

протокол

Экспериментальный протокол был проведен во исполнение директивы Совета европейских сообществ для животного эксперимента (2010/63/ЕС, 86/609/ЕЕС и 87-848/EEC) и была утверждена животных этики Комитет из университета Намюр (этика проекта n ° 17-284 ). Рисунок 1 изображает два соответствующих подходов: transdiaphragmatic или Трансторакальная инъекции. Используйте самцов мышей C57bl/6J (n = 18), в возрасте от 3 до 4 месяцев в исследовании.

1. Приготовление раствора СТВ

1. Для transdiaphragmatic инъекции:
   1. Растворите CTB власть в стерильной воде в концентрации 0,2% (w/v).
   2. Загрузите 7,5 мкл раствора (0,2% w/v) СТВ в стерильные 10-мкл microsyringe с прилагаемой 33-иглы (тупой или короткие скос) для каждой мыши.
2. Для Трансторакальная инъекций:
   1. Растворите CTB власть в стерильной воде в концентрации 0,1% (w/v).
   2. Загрузите 20 мкл раствора (0,1% w/v) СТВ в стерильный шприц 500-мкл инсулин с скошенный 27-иглы для каждой мыши.
      Примечание: Убедитесь, что пользоваться дистиллированной и стерильной водой и должным образом растворить порошок ВЗИ. Раствор может храниться при температуре 4 ° C на месяц (не замораживать). Через несколько дней могут образовывать осадок. Довести раствор до комнатной температуры и перемешать хорошо с помощью пипетки перед использованием.

2. подготовка до внутриплевральной инъекции

1. Стерилизуйте хирургические инструменты до операции, используя автоклаве или штапика стерилизатор. Подготовьте слой чистого скамейке делать операцию и распоряжаться хирургические инструменты.
   Примечание: Любой материал, используемый в ходе хирургической процедуры должны быть стерильными. Инструменты, которые нельзя стерилизовать, такие, как microsyringe должно быть вытер вниз с дезинфицирующим средством (хлоргексидин) или должно быть одноразового использования только. Хирург должен мыть его руки дезинфицирующим средством (хлоргексидин скраб) перед началом операции. Хирург должен носить стерильные перчатки, маску и чистое платье.
2. Вес животного и осуществлять соответствующую дозу наркоза: внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейль (например кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг).
3. Щепотка мыс проверять и/или за потерю глазной рефлекс, чтобы определить, если мышь должным образом под наркозом. Примените мазь ветеринара для защиты роговицы.
4. Бритье тщательно вентральной (для transdiaphragmatic процедуры) или правосторонняя грудной клетки кожи (для Трансторакальная процедуры), используя электрические машинки для стрижки. Бритье хорошо и достаточно широкой для предотвращения вдаваясь в области хирургии волос.
5. Обеспечения асептических условиях актуальным применение 10% раствор йода на область побрился. Скраб для хирургической сайта раствором йода, стараясь вымыть из центра сайта к периферии.
6. Используйте пусковую площадку гомойотермных всей операции для поддержания температуры тела животного.

3. внутриплевральной инъекции с использованием Transdiaphragmatic подход

1. Сложить наркотизированных мышь в лежачем положении на грелку. Места проката марлевой под шею животного. Для взрослой мыши используйте рулонный марлевой 0,5 дюйма толщиной. Лента эту площадку в Правление хирургии чтобы избежать движения, если таковые имеются.
2. С помощью лезвие скальпеля, надрезать вентральной кожу вдоль средней линии: сделать разрез от мечевидного отростка в пупочную регион при растяжении кожи боков с другой стороны, чтобы кожа стягивается. Не применять слишком много давления на лезвии, чтобы избежать повреждения основных органов.
3. Использование малых ножницами, аккуратно отсоедините кожу от брюшной мышцы вокруг разрез. Эта процедура поможет при шитье мышцы и кожу врозь в конце операции.
4. Выполните лапаротомия, используя маленькие ножницы. Откройте брюшной полости, выполняя петли разрез на уровне пупка. Надрезать мышцы живота по белой линии («linea alba») до мечевидного отростка.
5. Для того, чтобы визуализировать брюшной поверхности диафрагмы, отозвать мышцы живота, с использованием коммерческих или домашнее ретракторы.
   Примечание: Эти ретракторы могут быть сделаны из скрепки midi размер формы в L-крюк¹⁹.
6. Растянуть обе стороны лапаротомия, и лентой вниз ретракторы скамейке пальто. Оптимизируйте освещения поля зрения, чтобы на брюшной поверхности диафрагмы no more в полутени. Наиболее мощные устройства освещения для этой цели является светодиодная лампа с ориентируемых луч света.
7. С помощью мягкой пинцета в одной руке, поднимите вверх xyphoid приложение и потяните вниз боковых долей печени (рис. 2A). С помощью маленькие ножницы с другой стороны, тщательно отрезать отлагательное связки, не повреждая желчного пузыря или диафрагмы (рис. 2B).
8. С помощью мягкой пинцета в одной руке, поднимите вверх xyphoid приложение. Возьмите шприц Гамильтон в другой. Конечные три сайтов инъекции в правильном hemidiaphragm к соответственно покрыть грудины, медиальной и голеней регионов (рис. 3A, врезка в рисунке 3B).
9. Как толщина диафрагмы около 0,37 мм⁷мышей, вставьте иглы не более чем 1 или 2 мм за мембраны лист для предотвращения повреждения легких во время дыхания. Доставить 2,5 мкл раствора CTB (0,2% w/v) через правый диафрагму на каждом сайте (рис. 4В). Не требуется стабилизация диафрагмы.
10. Повторите эту процедуру для трех ипсилатеральные сайтов впрыска (рис. 1а) и contralaterally для двусторонних маркировки пула PhMN.
11. Чтобы закрыть сайт лапаротомия, шовные брюшных мышц с рассасывающимся швом 4-0. Использовать Прерванный швы на расстоянии 3 мм по. штапель кожи закрыты с 9,0 мм раны клипов. Закрепите скобы для предотвращения животных от потянув скобы. Пространство скобы примерно 5 мм друг от друга. Не затягивайте слишком сильно рану клипов, как это может привести к нарушения заживления.
12. Чистой микро шприц с дистиллированной водой для предотвращения засорения. Медленно подготовить и выслать 2 - 3 раза. Не сделать воздух в шприц.

4. внутриплевральной инъекций с использованием Трансторакальная подход

Примечание: Этот метод вдохновили от процедуры, описанной в крыс⁴ и была адаптирована к мыши.

1. Сложить наркотизированных мыши в левой боковой пролежни позицию, на грелку (рис. 4A).
2. Идентифицировать шестого и седьмого ребра под локоть региона ручной пальпация (рис. 4В).
3. В то время как помощник расширяет правый передний план - и задних конечностей (Рисунок 5A), вставьте шприц краниально ориентированной и нагнетается под шестого или седьмого ребра, 3 мм, глубиной от кожи, с наклонной вниз (Рисунок 1B и Рисунок 5B).
4. Поднимите иглу осторожно, чтобы подтвердить, подняв ребер, что он хорошо позиционируется в грудной полости (рис. 5 c, вставками в Рисунок 1B).
5. Стабилизируйте дыхательные движения грудной клетки, применяя небольшое давление с двумя пальцами на грудной стенке.
6. Держа шприц с другой стороны, доставить 20 мкл раствора (0,1% w/v) СТВ в одной инъекции.

5. послеоперационный уход

1. Сразу же после процедуры заложить мыши в правой боковой пролежни позиции на гомойотермных площадку для восстановления. Это обеспечивает трассировщик распространить на правой стороне плевральной полости и позволяет для контроля дыхания животных.
2. Вводят 1 мл стерильным физиологическим раствором и.п. подкожно. Обеспечивать последующие инъекции, если животное появляется сухой и вялой.
3. Администрировать подкожно 0,1 мг/кг бупренорфина, дважды в день в течение первых двух дней после операции, для сведения к минимуму любых потенциальных боль.
   Примечание: Многие учреждения рекомендую Мультимодальная анальгезия инвазивных процедур, таких как лапаротомия, изображенные здесь. Это могло бы включать использование нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) или местной анестезией агент в месте разреза. Эти препараты обычно доставляются до первый разрез для сведения к минимуму предметы боли.
4. Мониторинг животных ежедневно до эвтаназии.

Результаты

Самцов мышей C57bl/6J (n = 18), в возрасте от 3 до 4 месяцев, были включены в исследование. В день 0 эксперимента 8 мышей претерпел односторонних C4 ушиба, правосторонняя, согласно опубликованной протокол^7,18. Как процедура Шам 10 мышей претерпел Лами?...

Обсуждение

Протокол, описанные здесь, могут применяться к любой штамм взрослых мышей или любой экспериментальной парадигмы, в котором должны оцениваться целостности цепи диафрагма PhMN. К примеру боковой амиотрофический склероз (ALS) и травмы шейного отдела спинного (cSCI) являются условия, связанные ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm