Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris

Résumé

Nous décrivons ici, un protocole d’identification des motoneurones phréniques chez la souris après que livraison intrapleurale du fluorophore conjugué bêta de choléra toxine sous-unité. Deux techniques sont comparées pour injecter de la cavité pleurale : transdiaphragmatic par rapport aux approches transthoracique.

Résumé

Motoneurones phréniques sont des neurones de moteur du col utérin provenant de C3 à C6 niveaux en plus des mammifères. Projections axonales convergent dans des nerfs phréniques qui innervent le diaphragme respiratoire. Dans des tranches de la moelle épinière, les motoneurones phréniques ne peut être identifiés d’autres neurones moteurs sur des critères morphologiques ou biochimiques. Nous fournissons la description des procédures pour visualiser les corps cellulaires des motoneurones phréniques chez des souris, des injections d’intrapleurale suivants de bêta de sous-unité choléra toxine (CTB) conjugué à un fluorophore. Ce traceur fluorescent neuroanatomique a la capacité d’être rattrapé à la jonction neuromusculaire de diaphragme, être emportés marqués les axones phréniques et atteindre les corps cellulaires phréniques. On compare les deux approches méthodologiques de la livraison CTB intrapleurale : transdiaphragmatic versus les injections transthoracique. Les deux approches sont efficaces et donner lieu à un nombre similaire de motoneurones phréniques CTB-étiqueté. En conclusion, ces techniques peuvent être appliquées afin de visualiser ou de quantifier les motoneurones phréniques dans diverses études expérimentales telles que celles axées sur le circuit de diaphragme-phrénique.

Introduction

L’objectif de l’étude est de présenter une méthode fiable pour identifier les neurones moteurs phréniques (PhMN) sur des coupes de moelle épinière de souris. Injection d’un traceur fluorescent neuroanatomique dans la cavité pleurale a été choisie comme la méthode de livraison pour atteindre les projections neuromusculaires le diaphragme phréniques et transport rétrograde le long des axones phréniques permet d’étiqueter des corps cellulaires phréniques. Deux techniques de livraison intrapleurale sont décrites : transdiaphragmatic versus transthoracique.

Motoneurones phréniques sont des cellules de relais de la colonne vertébrale dont les axones convergent dans des nerfs phréniques, qui finalement innervent le diaphragme. Ce sont des neurones moteurs inférieurs recevoir l’entraînement inspiratoire des centres respiratoires bulbaires et il relais des messages vers les jonctions neuro-musculaires du diaphragme (NMJ). PhMN sont structurées en deux colonnes de moteurs, un pour chaque hemicord, le long de la colonne vertébrale-cervical. Dans la plupart des espèces de mammifères dont les humains, les colonnes moteurs phréniques propagation de niveaux C3 à C6^1,2,3. Nous et autres avons confirmé que PhMN concentrés dans des niveaux de C3-C5 dans le rat et la souris moelle épinière^4,5,6,7,8. La répartition topographique des cellules phréniques n’est pas au hasard ; motoneurones innervant la partie sternale du diaphragme sont distribués plus dense dans la partie crânienne de la piscine de moteur phrénique (C3), tandis que les motoneurones innervant la partie crurale sont plus caudal (C5)⁹. En outre, les PhMN sont regroupés diversement dans la matière grise de corne ventrale. Au niveau de la C3, les grappes de cellules phréniques se trouvent latéralement, puis qu’elles bougent dans le sens ventro ni sont trouvent ventromedially à la plus caudale niveaux^10,11.

Compte tenu de leur rôle essentiel pendant l’inspiration, il est primordial d’identifier avec précision PhMN dans la moelle épinière en bonne santé, mais également suivre leur sort au cours de pathologies, telles que les traumatismes de la moelle épinière ou de maladies dégénératives. Car PhMN ne diffèrent pas morphologiquement des autres neurones moteurs du col utérin, identification de PhMN repose sur l’administration ciblée des traceurs neuroanatomiques soit au niveau des centres respiratoires primaires⁸, le diaphragme NMJ⁷ ou au le nerf phrénique⁴. Le traceur est absorbé par les fibres nerveuses et transporté jusqu'à les phréniques corps cellulaires dans le rachis cervical, où elle peut être visualisée à l’aide de systèmes de détection directe ou indirecte. Rétrograde ou antérograde traceurs sont commercialement disponibles avec une large gamme de conjugués. Remarquable, chaque traceur est doté de no, basses ou hautes capacités pour le suivi des trans synaptique.

Dans la présente étude, nous avons choisi la sous-unité bêta de la toxine de choléra (CTB) fonctionnalisée avec Alexa Fluor 555 (désormais dénommé CTB-fluorophore) comme une étiquette fluorescente, ce qui permet une visualisation directe des PhMN sur des coupes congelées de la moelle épinière. CTB est habituellement décrite comme traceur monosynaptique, bien que les données expérimentales tendent à montrer un passage de transneuronal¹². CTB a la capacité de lier le ganglioside GM1 à la membrane plasmique de la terminaison nerveuse. CTB est internalisée par clathrin-dépendante ou - indépendant des mécanismes et des trafics à travers le réseau trans-Golgi dans le réticulum endoplasmique dans un mode rétrograde^13,14. L’internalisation et le transport rétrograde semblent dépendre l’actine cytosquelette^15,16 , ainsi que sur le réseau de microtubules¹⁷.

Pour démontrer l’utilité de la CTB comme traceur neuroanatomique rétrograde étiquetage diaphragme-PhMN circuit, CTB-fluorophore fut livré intrapleurale. CTB a été administré à l’aide de deux techniques : l’une comprenait une laparotomie et injections multiples de transdiaphragmatic ; le second, moins invasive, utilisé une unique injection transthoracique. Quatre jours plus tard, fluorescent marqué PhMNs ont été quantifiés dans la moelle épinière cervicale à la fois sain et animaux (C4) spinal-blessés.

Protocole

Le protocole expérimental a été réalisé conformément aux Directives du Conseil européen des communautés pour l’expérimentation animale (2010/63/UE, 86/609/CEE et 87-848/CEE) et a été approuvé par l’Animal éthique Comité des FUNDP (éthique du projet n ° 17-284 ). La figure 1 illustre les deux approches respectives : transdiaphragmatic ou injections transthoracique. Utilisez la souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois dans l’étude.

1. préparation de la Solution de la CTB

1. Pour les injections de transdiaphragmatic :
   1. Dissoudre la puissance de la CTB dans de l’eau stérile à la concentration de 0,2 % (p/v).
   2. Chargez 7,5 µL de solution de la CTB (0,2 % p/v) dans une stérile 10-µL-microseringue avec une aiguille de calibre 33 ci-joint (biseau émoussé ou court) pour chaque souris.
2. Pour injection transthoracique :
   1. Dissoudre la puissance de la CTB dans de l’eau stérile à la concentration de 0,1 % (p/v).
   2. Charger 20 µL de solution CTB (0,1 % p/v) dans une seringue stérile d’insulino-µl-500 avec une aiguille de calibre 27 biseautée pour chaque souris.
      Remarque : Veillez à utiliser de l’eau distillée et stérile et bien dissoudre la poudre de la CTB. La solution peut être conservée à 4 ° C pendant un mois (ne pas congeler). Un précipité pourrait former après quelques jours. Porter la solution à température ambiante et mélanger bien à l’aide d’une pipette avant utilisation.

2. préparation avant injection intrapleurale

1. Stériliser les instruments chirurgicaux avant la chirurgie, à l’aide d’un stérilisateur autoclave ou verre-perle. Préparer un manteau banc propre à faire de la chirurgie et à disposer des outils chirurgicaux.
   Remarque : N’importe quel matériel utilisé au cours de l’intervention chirurgicale doit être stérile. Instruments qui ne peuvent pas être stérilisés comme la microseringue doit être essuyé avec un désinfectant (chlorhexidine) ou doit être à usage unique seulement. Le chirurgien doit laver ses mains avec un désinfectant (chlorhexidine gommage) avant le début de l’intervention chirurgicale. Le chirurgien doit porter des gants stériles, un masque et une blouse propre.
2. Peser l’animal et d’administrer une dose appropriée de l’anesthésie : injection intrapéritonéale de cocktail anesthésique (p. ex. kétamine 100 mg/kg et xylazine 5 mg/kg).
3. Pincer les orteils et/ou vérifiez pour la perte du réflexe palpébral afin de déterminer si la souris est correctement anesthésiée. Appliquer une pommade vétérinaire pour protéger la cornée.
4. Se raser avec soin la peau ventrale (pour transdiaphragmatic procedure) ou la côté droit thoracique peau (pour procédure transthoracique), à l’aide de tondeuses électriques. Se raser bien et suffisamment large pour éviter les cheveux dans le domaine de la chirurgie.
5. Assurer des conditions d’asepsie par application topique de solution d’iode de 10 % sur la zone rasée. Frotter le site chirurgical avec la solution d’iode, en prenant soin de frotter du centre du site vers la périphérie.
6. Utiliser un tampon homéothermes tout au long de la chirurgie pour maintenir la température du corps de l’animal.

3. intrapleurale Injections à l’aide de la méthode Transdiaphragmatic

1. Fixer la souris anesthésiée en décubitus dorsal sur un coussin chauffant. Placez une compresse de gaze roulée sous le cou de l’animal. Pour une souris adulte, utilisez une compresse de gaze roulée de 0,5 pouce d’épaisseur. Ce coussin à la Commission de la chirurgie pour éviter tout mouvement éventuel du ruban.
2. À l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, inciser la peau ventrale le long de la ligne médiane : faire une incision du processus xiphoïde pour la région ombilicale tout en étirant la peau latéralement de l’autre main pour rendre la peau tendue. Ne pas appliquer trop de pression sur la lame pour éviter d’endommager les organes sous-jacents.
3. À l’aide de petits ciseaux, détacher délicatement la peau des muscles autour de l’incision abdominales. Cette procédure permettra à piquer les muscles et la peau part à la fin de la chirurgie.
4. Effectuer une laparotomie à l’aide de petits ciseaux. Ouvrir la cavité abdominale en effectuant une incision de la boutonnière au niveau de l’ombilic. Inciser les muscles abdominaux le long de la ligne blanche ("linea alba ») jusqu'à le processus xiphoïde.
5. Afin de visualiser la surface abdominale du diaphragme, rétraction des muscles abdominaux, l’utilisation commerciales ou maison enrouleurs.
   NOTE : Ces rétracteurs peuvent être faites de midi-taille trombones en forme de crochets en L¹⁹.
6. Étirer les deux côtés de la laparotomie et bande vers le bas les rétracteurs à la couche de banc. Optimiser l’éclairage du champ de vision de sorte que la surface abdominale du diaphragme n’est plus dans la pénombre. Le dispositif d’éclairage plus puissant à cet effet est une lampe à LED avec un faisceau lumineux orientable.
7. Utilisez des pinces souples dans une main, soulevez l’appendice xyphoid et tirer vers le bas des lobes latéraux du foie (Figure 2 a). À l’aide de petits ciseaux dans l’autre main, découpez soigneusement le ligament suspenseur, sans endommager la vésicule biliaire ou du diaphragme (Figure 2 b).
8. Utilisez des pinces souples dans une main, soulevez l’appendice xyphoid. Tenez la seringue de Hamilton dans l’autre main. Cibler les trois sites d’injection dans l’hémidiaphragme droit pour couvrir respectivement le sternum, du côté médial et les régions crurales (Figure 3 a, incrustés dans la Figure 3 b).
9. L’épaisseur de la membrane étant environ 0,37 mm de souris⁷, insérer l’aiguille ne pèse que 1 ou 2 mm au-delà de la feuille de membrane pour empêcher des dommages de poumon au cours de la respiration. Fournir 2,5 µL de solution de la CTB (0,2 % p/v) à travers le diaphragme droit sur chaque site (Figure 4 b). Stabilisation de la membrane n’est pas nécessaire.
10. Répétez cette procédure pour les trois sites ipsilatérale d’injection (Figure 1 a) et controlatérale pour un étiquetage bilatérale de la piscine de PhMN.
11. Pour fermer le site de la laparotomie, suture des muscles abdominaux avec résorbable 4-0 suture. L’utilisation interrompus points espacés de 3 mm. peau Staple fermée avec clips 9,0 mm enroulé. Serrer les agrafes pour empêcher l’animal arrachant les agrafes. Espace des agrafes environ 5 millimètres. Ne pas trop serrer les attaches de la plaie, car cela peut conduire à la guérison avec facultés affaiblies.
12. Microseringue nettoyer avec de l’eau distillée pour éviter tout colmatage. Lentement, dresser et expulser 2 ou 3 fois. Ne pas prendre l’air dans la seringue.

4. intrapleurale Injection en utilisant une approche transthoracique

Remarque : Cette méthode est inspirée de la procédure décrite dans les rats⁴ et a été adaptée à la souris.

1. Fixer la souris anesthésiée en position de décubitus latéral, sur un coussin chauffant (Figure 4 a) à gauche.
2. Identifier les sixième et septième côtes dans la région du coude par palpation manuelle (Figure 4 b).
3. Alors qu’un assistant s’étend à droite avant - et -membres postérieurs (Figure 5 a), insérer la seringue parotidien orientée et tangentiellement au titre de la sixième ou la septième côte, 3 mm de profondeur de la peau, le biseau vers le bas (Figure 1 b et Figure 5 b).
4. Élever l’aiguille doucement pour confirmer, en soulevant les côtes, qu’il est bien placé dans la cavité thoracique (Figure 5, encarts dans la Figure 1 b).
5. Stabiliser les mouvements de la poitrine de la respiration en appliquant une légère pression avec deux doigts sur la paroi thoracique.
6. Tout en tenant la seringue dans l’autre main, livrer 20 µL de solution CTB (0,1 % p/v) en une seule injection.

5. soins postopératoires

1. Immédiatement après l’intervention, poser la souris en position de décubitus latéral droit sur un bloc homéothermes pour la récupération. Cela garantit le traceur à se répandre sur le côté droit de la cavité pleurale et permet de surveiller la respiration de l’animal.
2. Administrer 1 mL de solution saline stérile i.p. par voie sous-cutanée. Fournir des injections suivies si l’animal semble déshydraté et/ou apathique.
3. Administrer par voie sous-cutanée de 0,1 mg/kg de buprénorphine, deux fois par jour au cours de la première chirurgie après deux jours, afin de minimiser toute douleur potentielle.
   NOTE : De nombreuses institutions recommande une analgésie multimodale pour les procédures invasives, telles que la laparotomie représentée ici. Cela pourrait inclure l’utilisation d’un non-stéroïdiens anti-inflammatoires (AINS) et/ou un agent anesthésique local à l’emplacement de l’incision. Ces médicaments sont généralement envoyées avant la première incision pour minimiser la douleur lié à la conversion.
4. Surveiller les animaux tous les jours jusqu'à l’euthanasie.

Résultats

Les souris C57bl/6J mâles (n = 18), âgés de 3 à 4 mois ont été inclus dans l’étude. Au jour J0 de l’expérience, 8 souris ont subi une contusion unilatérale de C4, côté droit, selon le protocole publié^7,18. Comme intervention factice, 10 souris ont subi une laminectomie sur le dessus de C4 sans contusion. Au 3e jour, souris ont été préparés pour les injections intrapleurale de CTB-fluorophore selon les deux proc...

Discussion

Le protocole décrit ci-après peut être appliqué à une souche de souris adultes ou à n’importe quel paradigme expérimental où l’intégrité de la circuiterie de diaphragme-PhMN doit être évaluée. Par exemple, sclérose latérale amyotrophique (SLA) et du col de la moelle épinière (cSCI) sont des conditions liées à la perte de PhMN, antérograde une dégénérescence des axones phréniques et compromis respiratoire subséquente. Modèles animaux de SLA ou cSCI imitent les déficits respiratoires histopat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm