طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط لسرعة إنتاج مئات من وسائط النمو السلكية أجار، لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة من ايليجانس كاينورهابديتيس لكل بئر. هذه الثقافات مفيدة لفحص الكائنات كله المظهرية. نحن نركز هنا على استخدام هذه الثقافات إلى شاشة المواد الكيميائية للآثار المؤيدة طول العمر.

Abstract

ايليجانس كاينورهابديتيس كائن مفيدة لاختبار تأثيرات المواد الكيميائية على علم وظائف الأعضاء. الكائن الحي كله جزيء صغير شاشات عرض مزايا هامة لتحديد الهياكل الكيميائية النشيطة بيولوجيا التي يمكن تعديلها تعمل معقدة مثل عمر. الموصوفة هنا بروتوكول بسيط لإنتاج مئات لوحات الثقافة 96-جيدا مع أرقام متسقة إلى حد ما من C. ايليجانس في كل بئر. المقبل، ونحن تحديد كيفية استخدام هذه الثقافات إلى الشاشة الآلاف من المواد الكيميائية للآثار على عمر ديدان أسطوانية C. ايليجانس. هذا البروتوكول يجعل استخدام سلالات عقيمة حساس درجة الحرارة وظروف بلايت أجار والحيوان بسيطة التعامل مع تيسير إنتاج الثقافات الحيوان متزامنة للفحص السريع وارتفاع الإنتاجية.

Introduction

هنا هو وصف بروتوكول تم تطويره لفحص إنتاجية عالية من المركبات الكيميائية للآثار على عمر ايليجانس كاينورهابديتيس . البروتوكول نفسه سهولة التكيف للشاشات المظهرية الأخرى، بما في ذلك دراسات استخدام سلالات C. ايليجانس المراسل. هذا البروتوكول واستخدمت بنجاح لتحديد مركب نشيطة بيولوجيا رواية، NP1 (نيتروفينيل-الببرازين، 1)، الذي يمتد بقوة عمر C. ايليجانس من خلال إليه قيود غذائية. NP1 ووصف لأثر ذلك على عمر، بما في ذلك وصف للمسارات الجينية في اللعب، وكان سابقا في أماكن أخرى ووصف¹. أن يتضمن التقرير أيضا وصفاً للنتائج من تطبيق على نطاق واسع من الشاشة. هنا يصف لنا بالكثير من التفصيل أكبر المنهجية والإعداد للشاشة نفسها، وقابلة للتطوير للتطبيقات الصغيرة والكبيرة الحجم.

وكان الهدف الذي أدى إلى إنشاء البروتوكول هو موضح هنا لتطوير منصة ثقافة C. ايليجانس يسمح بالفحص السريع للمكتبات الكيميائية الكبيرة للمركبات النشيطة بيولوجيا رواية. بينما الشاشات الكيميائية قد أجريت قبل وضع هذا البروتوكول، هذه كانت أساسا الصغيرة و/أو نوع مرشح النهج^2،3. في الواقع، تستخدم معظم الشاشات أداؤها في المختبر على عشرات مركبات فحوصات مقاومة الإجهاد، مع يجري فرزهم لطول العمر آثار⁴مرات. هذه الدراسة تسعى بدلاً من ذلك إلى الشاشة مباشرة للآثار عمر. بشكل ملحوظ، كانت هناك بعض الأوصاف في الكتابات العلمية في وقت أداء شاشات كيميائية واسعة النطاق مع C. ايليجانس. في الواقع، مقارنة بالأنواع الأخرى من شاشات^5،،من⁶⁷، الفحص الكيميائية على نطاق واسع استخدام C. ايليجانس ويبدو أن العمالة الناقصة.

وهناك أوصاف اثنين من شاشات كيميائية واسعة النطاق في C. ايليجانس التي استخدمت كأساس لتطوير هذا النهج. وكان أول هذه دراسة أنيقة من بيتر روي المختبر باستخدام شاشات الكيميائية للتعرف على المركبات التي يمكن التشويش تنمية الحيوانات. ثم تابعت الدراسة مع شاشة الطفرات إلى الأمام لتحديد أهداف هذه المواد الكيميائية⁸الوراثية. استخدام البروتوكول الموصوفة في هذه الدراسة باتيس 24-جيدا، وهو ببساطة غير قابلة للتطبيق لتلبية الاحتياجات المحددة لهذه الدراسة (كميات محدودة من المادة الكيميائية في مكتبة ومساحة حاضنة المتاحة محدودة). وكانت الدراسة الأخرى الشاشة مايكل بيتراشيك جزيء صغير المبتكرة والطموحة لتوسيع نطاق المواد الكيميائية^9،10عمر. هذه الدراسة تستخدم لوحات 384-جيدا والثقافات السائل. وكان السمة الرئيسية الأخرى لهذه الشاشة استخدام فودر (5-فلوروديوكسيوريديني) تمنع إنتاج ذرية كيميائيا. بعد كبير النظر في البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة، تم تفادي التعقيم الكيميائي والثقافات السائل من C. ايليجانس .

على الرغم من أن فودر يستخدم على نطاق واسع في تجارب عمر C. ايليجانس ، كانت هناك مخاوف أن فودر قد يسبب تفاعلات العقاقير غير متوقعة، أو أن فودر نفسها قد يكون له بعض التأثير على عمر. مؤخرا هذا القلق الأخير تم التحقق من، على الأقل في بعض التركيزات وخاصة في 25 درجة مئوية¹¹. للالتفاف على مشكلة التلوث بذرية، تم استخدام سلالة C. ايليجانس TJ1060، التي تؤوي اثنين من الطفرات حساسة مستقلة في درجات الحرارة (جمعية مهندسي البترول-9 (hc88) الأول؛ rrf-3(b26)II) أن إلغاء إنتاج الحيوانات المنوية، ولقد ثبت أن تكون مفيدة للثقافات الجماعية للسكان متزامن¹². هذه السلالة عقيمة تماما عند 25 درجة مئوية، ولكن سوف تنتج ذرية عند مثقف في 15-20 درجة مئوية. استخدمت هذه الدراسة ظروف الثقافة التقليدية، مع الديدان الزحف على سطح أجار، النتائج التي تم الحصول عليها مع الثقافات السائلة ليست دائماً استنساخه بلوحات أجار التقليدية. في حين أن هذه الظاهرة ليست مفهومة تماما، فإنه قد ثبت أن الديدان مثقف في الاستجابة السائل للدكتور (تقييد الغذائية) بطريقة مختلفة من الديدان مثقف في وسائل الإعلام القياسية^13،14. ولذلك فمن المعقول أن السائل وسائل الإعلام يمكن أن تخفي بعض mimetics الدكتور خلاف ذلك سوف يتم تحديدها مع الشاشة.

وقد استقر على شروط الثقافة أجار، اعتبرت خيارات مختلفة لتسجيل أداء الآبار في هذا التحليل. بينما تتوفر فحوصات استناداً إلى مختلف الآلي أو التصوير، أنها استلزمت حيازة ونشر تحديا من الناحية التقنية الأجهزة، معظمها باهظ التكلفة. حين النظر في هذه الخيارات، من الضروري الرجوع إلى السابق عمر الشاشات من جميع الأنواع. وفي النهاية، استخدمت هذه الدراسة أسلوب التهديف مقتبس من الجينوم كله [رني] الشاشة مختبر لي سيلفيا سيو ل تعمل عمر¹⁵. على وجه التحديد، تم إعداد جميع عمر لوحات بنفس الطريقة، ولكن تم رصد الضوابط السلبية فقط. متى تأكدت لوحات التحكم السلبي قرب وفيات كاملة، قد سجل لوحات الاختبار باليد. في هذه الشاشة على نطاق واسع، أكدتها إيجابيات إعادة الاختبار مع المواد الكيميائية الطازجة باستخدام تكرار ثلاث نسخ من إيجابيات الأولية.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة

1. مرق رطل
   1. استخدام حبيبات قبل مختلطة (انظر الجدول المواد) واتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة للتحضير.
2. وسائل الإعلام (NGM) نمو السلكية أجار
   1. مزيج 23 ز لاجار، والجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم، 2.5 g من ببتون بكتو، والمياه إلى 0.972 L. اﻷوتوكﻻف واسمحوا باردة إلى 60 درجة مئوية، ثم إضافة 25 مل من 1 متر العازلة الفوسفات (مشرف₄) البوتاسيوم (pH 6.0)، 1 مل م 1 سلفات المغنيزيوم (مجسو₄) ، 1 مل كلوريد الكالسيوم 1 م (كاكل₂)، و 1 مل من الكوليسترول 5 ملغ/مل (في الإيثانول).
3. تحت كلوريت الحل
   1. مزيج 5 مل م 5 كوه، 4 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم (6%)، ومنزوع ح₂س إلى إجمالي حجم 50 مل.
4. S القاعدية
   1. مزيج من 5 غ من كلوريد الصوديوم، ز 1 من ك₂مكتب البراءات الهنغاري₄، ز 6 خ₂ص₄، والماء المتأين الشطب إلى 1 لتر، ثم اﻷوتوكﻻف.

2-إعداد مركزة كولاي (OP50)

ملاحظة: تركز هذه الخطوة 1 لتر حل كولاي المشبعة إلى 25 مل من المخزن المؤقت S القاعدية.

1. تلقيح 5 مل مرق LB يعقم (الخطوة 1، 1) مع مستعمرة واحدة كولاي (الضغط OP50)، واحتضان ح 4-6 في 37 درجة مئوية مع الهز (250 لفة في الدقيقة). استخدام 0.1 مل من هذا الحل لتطعيم 1 لتر رطل في قارورة Erlenmeyer ل 2. تبني في 1 لتر قوارير بين عشية وضحاها (12-16 ح) عند 37 درجة مئوية مع الهز (250 لفة في الدقيقة).
2. الطرد المركزي 1 لتر الثقافات بين عشية وضحاها في زجاجات للطرد المركزي 500 مل لمدة 5 دقائق 10 آلاف x ز و 4 درجات مئوية بيليه البكتيريا وصب بعيداً من وسائل الإعلام المتبقية. ريسوسبيند بيليه في 25 مل من S القاعدية (الخطوة 1، 4). مخزن في 4 درجات مئوية.

3-إعداد لوحات الثقافة NGM

1. للثقافة الجماهيرية لوحات تستخدم لإنتاج إعداد كبيرة من الديدان، الاستغناء عن 30 مل أجار NGM المنصهر (60 درجة مئوية) (الخطوة 1، 2) في مجلس الوزراء على لوحات الثقافة 10 سم مع جهاز الاستغناء عن السوائل الآلي أو ماصة مصلية تدفق الصفحي. واسمحوا أن الجافة بين عشية وضحاها.
2. بيبيت 2 مل OP50 تتركز على كل لوح 10 سم، تنتشر لتغطي كامل سطح أجار بإمالة وتدوير اللوحة، ثم السماح لوحات الجافة. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
3. إنتاجية عالية لوحات الثقافة المقايسة المستخدمة للفرز، الاستفادة موزع قناة 8 الآلي الاستغناء عن 0.15 مل من المنصهر NGM أجار في كل من لوحة جيدا 96 في خزانة الاندفاق الصفحي جيدا. استخدام الرعاية جعل متأكد من الآبار خالية من الفقاعات، كهذه ستمكن تختبئ الديدان التي سوف تنال من التحليل في هذا البئر. واسمحوا أن الجافة بين عشية وضحاها. تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

4-إعداد درجة الحرارة حساسة (ts) العقيمة ايليجانس جيم الثقافات الشامل

1. لبدء تشغيل الثقافات، باستخدام 'دودة اختيار' (بيك ماصة زجاجية مع سلك البلاتين مرفقة أو دودة مصنعة) تحت مجهر تشريح، نقل البيض 20 (سلالة TJ1060: جمعية مهندسي البترول-9 (hc88) الأول؛ rrf-3(b26)II) على plate(s) الثقافة الجماهيرية التي أعدت في الخطوة 3، 1. ثم احتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 6 أيام (يسمح لأكثر من جيل واحد من النمو، كما كنت تستهدف جمع الذرية البيض 20 نقل).
2. مجهر تشريح بصريا التأكد من وجود جرابيد الكبار (البيض في الرحم). جمع الكبار جرافيد بالاستغناء عن 2-3 مل S القاعدية على لوح استخدام ماصة زجاج. دوامة السائل حول اللوحة باليد، ثم جمع السائل في أنبوب 15 مل استخدام ماصة زجاجية.
3. تدور أسفل الأنبوبة (1,000 ز x 1.5 دقيقة عند 20 درجة مئوية) إلى بيليه الديدان، ثم نضح قبالة المادة طافية. إضافة 10 مل هيبوكلوريت (خطوة 1، 3) حل لبيليه دودة وسرعة يهز الأنبوبة باليد في اتجاه من أعلى لأسفل إينكوباتي س. 5 لمدة 5 دقائق، هز كل دقيقة 2.5.
4. ومرة أخرى، تدور أسفل الأنبوبة (ز س 1,000 لدقيقة 1.5)؛ ينبغي أن يكون بيليه مصفر-براون. نضح قبالة المادة طافية. إضافة 10 مل هيبوكلوريت الحل إلى بيليه البيض واهتز بشدة الأنبوب. 1-3 دقيقة، مع الهز أحياناً، وفي حين رصد مظهر مع مجهر تشريح احتضان. وتؤكد بصريا البيض فقط هي المتبقية، والمضي قدما إلى الخطوة التالية.
5. وتدور أسفل الأنبوبة (1,000 ز x 1.5 دقيقة) نضح قبالة المادة طافية. ينبغي أن يكون بيليه الأبيض مع لا التلون البنى.
   ملاحظة: بعد إزالة الحل تحت كلوريت، من الأهمية بمكان استخدام تقنيات عقيمة والمخازن المؤقتة، منذ التلوث (البكتيرية والفطرية، وبخاصة) يمكن أن تدمر التجربة، وإضاعة الوقت الثمين والمواد الكاشفة. هذه الدراسة تستخدم خزانة الاندفاق الصفحي مصفاة ونقل السوائل باستخدام ماصات معقم ونصائح فقط.
6. فتح الأنابيب في الفضاء عقيمة. أغسل بيليه 3 مرات مع S القاعدية، الغزل إلى أسفل (س 1,000 ز لمدة دقيقة 1.5) ويسفط بعيداً المادة طافية في كل مرة. إعادة تعليق بيليه البيض في 2-3 مل S القاعدية. يمكن استخدام هذه البيض الآن لفتحه بين عشية وضحاها في المخزن المؤقت لجمع L1 اليرقة (الخطوة 5).

5-تفقيس بيض ايليجانس جيم في المخزن المؤقت للحصول على الثقافات المتزامنة (إعداد L1 اليرقات ايليجانس جيم )

1. صب بيليه البيض والمخزن المؤقت في طبق بتري زجاج عقيمة مع غطاء. شطف البيض المتبقي من الأنبوب إلى طبق استخدام ماصة مصلية مع 2-3 مل S القاعدية. إضافة 5 مل S القاعدية لتخفيف الازدحام، كما قد يشجع هذا الفقس، كما سوف تضيء تهز (20 لفة في الدقيقة مع شاكر راقصة مداري). تبني بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية، لإتاحة الوقت البيض إلى هاتش (ح 16-24). سيتم اعتقال hatchlings كافة في مرحلة اليرقات^ش 1 (L1) نظراً لعدم وجود الغذاء.
   ملاحظة: يشير الأدلة القولية إلى أن الأعمال التحضيرية الطازجة L1 (ح 16-36 بعد جمع البيض) إنشاء السكان الأكثر متزامن من الديدان الكبار.
2. جمع L1s في أنبوب 15 مل مع ماصة مصلية. تدور أسفل L1s في أجهزة الطرد مركزي (1,000 ز x 1.5 دقيقة) ونضح بعيداً من المادة طافية، وكرر حتى تم جمع جميع L1s من الفقس لوحات، بينما تترك 10 مل S القاعدية للخطوة التالية.
3. من أنبوبة تحتوي على L1s، ميكروبيبيتي من 0.01 مل (مباشرة بعد خلط) والاستغناء عن على المصنف (لا كولاي) لوحة NGM. حساب عدد L1s على اللوحة. كرر 10 مرات والحصول على متوسط لعدد L1s في كل قاسمة. وبشكل عام، نتوقع بين L1s 1-3 كل ميليلتر (عندما يبدأ ب 1 لوحة الثقافة الجماهيرية التي تحتوي على البيض 20).
4. تحديد مع ماصة مصلية حجم S القاعدي عقد في L1s. ثم استقراء مع العزم متوسط عدد الديدان كل 0.01 مل، التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة، لتقدير العدد الإجمالي ل L1s. وبوجه عام، تتوقع بين 10,000 30,000 L1s (لكل لوحة الثقافة الجماهيرية التي تحتوي على البيض 20).
5. لاستخدام هذه الثقافة في مقايسة 96، حسنا، تمييع تعليق L1 إلى 1 L1 كل ميليلتر في زجاجة وسائل الإعلام جولة عقيمة، ثم انتقل إلى الخطوة 7. إذا كانت هذه الثقافة لاستخدامها لتوليد إضافية C. ايليجانس الجماعي الثقافات، ثم انتقل إلى الخطوة 6.

6-واسعة النطاق الثقافة متزامن إعداد

ملاحظة: يمكن استخدام الحلول L1 بسرعة زيادة السكان دودة.

1. لإنشاء أرقام دودة كبيرة مع حلاً L1، الاستغناء عن L1s يصل إلى 5,000 في كل من العدد المطلوب من لوحات الثقافة الجماهيرية. جمع الكبار جرابيد 2.5 يوما في وقت لاحق (20 درجة مئوية) كما هو موضح في الخطوات من 4، 1-2، والمضي قدما إلى الخطوة 4.3 لجمع البيض.
2. كما أنه قد لوحظ الروايات المتناقلة أن تكرار جمع تحت كلوريت يمكن التشديد على السكان المغلوبة على أمرها، وتقسيم السكان بالانتقاء البيض للنشر قبل إخضاع السكان المتبقين إلى علاجات تحت كلوريت، حتى أن متعددة أجيال السكان لا تخضع للعلاج الحل تحت كلوريت مرارا وتكرارا.

7-إعداد لوحات المقايسة 96-جيدا

1. السماح لوحات الفحص (إعدادها في الخطوة 3، 3) تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم في مجلس الوزراء الاندفاق الصفحي، إضافة 5 ميليلتر من مركزة OP50 (أعد في الخطوة 2، 2) لكل بئر. كما كان من قبل، استخدام عبوة 8 قناة الآلي.
2. إضافة 10 ميليلتر من تعليق L1 لكل بئر باستخدام عبوة 8 قناة الآلي. هذا سيؤدي في الديدان في المتوسط 10 الواحد جيدا، نظراً لأنها موجودة في التعليق في 1 L1 كل ميليلتر. لتعزيز المساواة في توزيع L1s من الملاط، الاستغناء عن L1s من زجاجة جولة وسائط مختلطة بنشاط مع تحول شكل معتدل ببطء شريط إثارة.
3. تغطية صفيحة مع غطاء، دفعات مربع من اللوحات، واحتضان عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.

8-علاج 1 ^st "الكبار اليوم" C. ايليجانس مع المواد الكيميائية

1. إزالة لوحات المكتبة الكيميائية من الثلاجة، والسماح بلوحات تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
   ملاحظة: ألواح المكتبة الكيميائية كما هو موضح هنا هي لوحات جيدا 96 التي تحتوي على مركبات منفصلة في كل بئر، جميعها في تركيز نفسه ويذوب في [دمس]. هذه المكتبات لا تستخدم الأعمدة الخارجي، وكذلك كل لوحة كحد أقصى من المواد الكيميائية المميزة 80. في البروتوكول هو موضح هنا، تركيز مكتبة 10 ملم. من المهم النظر في الآثار تعمل المذيبات. بينما شاشات هذه الدراسة بتركيز 0.5% [دمس]، تم تجاوز هذا المستوى ابدأ في هذه الاختبارات عمر وفحوصات الإنتاجية منخفضة، حيث أنها أكثر احتمالاً لاختيار تركيز حل أسهم مركب. هذا البروتوكول لا يتجاوز 0.25 في المائة، وهو مستوى الذي عمر التعديلات لا تحدث¹⁶، على الأقل في سلالة N2.
2. بلطف يهز لوحة لفة في الدقيقة 60 على شاكر ميكروسكوبية لمدة 1 دقيقة مباشرة قبل استخدامها.
3. استخدام الآلي السائل 96-جيدا معالج أو نقل 0.75 ميليلتر من المجمع (أو [دمس]) من لوحة مكتبة إلى لوحة المقايسة. عمق ماصة أثناء الولادة السائل إلى لوحة الفحص يتم التحكم بعناية، مثل أن النصائح ماصة معالج السائلة هي إيصال حجم ميليلتر 0.75 إلى ميليلتر ~ 15 من السائل على سطح أجار (مع الديدان ومركزة OP50 من الخطوات 7.1 -2) ولا اختراق السطح أجار في البئر. لا تستخدم الممصات متعددة القنوات دليل 8 أو 12 ما عدا في شاشات صغيرة جداً (< 10 لوحات)، كما أنها يمكن أن تزيد من خطأ وغالباً ما تسفر عن ثقب السطح أجار، والذي يهدد المقايسة.
4. إعداد لوحات التحكم السلبي المكتبة الكيميائية مع [دمس] (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)، افتراض المكتبة يجري اختبار يستخدم [دمس] المذيب. جعل لوحة التحكم السلبي 1 لكل 5 اختبار لوحات، ما يصل إلى 10 لوحات التحكم السلبي. إذا كان ذلك ممكناً، كما جعل لوحة تحكم إيجابي (NP1¹ في 20 مم، لتركيز تحليل نهائي من 0.1 ملم، وفعالة لهذا الغرض؛ انظر القسم نتائج الممثل). عدم إضافة مواد كيميائية (اختبار أو مراقبة) للأعمدة الخارجية 2 من اللوحات، وكما هم عرضه بشكل خاص إلى جفاف.

9-التجفيف الثقافات

1. لإزالة السائل من على سطح الأرض لاجار، جاف لوحات في التدفق الصفحي مجلس الوزراء ح 4-8. من الأهمية بمكان أن هذه اللوحات هي تجفف تماما ولكن لا تصبح مبشور. بعض لوحات سوف يستغرق وقتاً أطول لتجف من غيرها، رصد جميع لوحات عن كثب وإزالة حالما هم جافة. تأكيد التجفيف بالفحص البصري الدقيق من الآبار الفردية اللوحة.
   ملاحظة: اعتماداً على العوامل التي تشمل معدل العادم من مجلس الوزراء، يأخذ هذا يجب أن يكون تجريبيا تحديد الوقت. ويمكن اتخاذ هذه الخطوة التجفيف حوالي 4-8 ح لكامل أعضاء حكومة.
2. ختم لوحات مع فيلم شفاف، ثم وضعت على لوحة الأغطية.
3. تدور لوحات المقايسة 96-جيدا ل 45 ثانية في 1,000 س ز.
4. تخزين لوحات مقلوب عند 25 درجة مئوية.

10-سجل الثقافات ايليجانس جيم لطول العمر

1. مراقبة لوحات التحكم السلبي حتى > يلاحظ وفيات 95%. فحص الصفائح أسبوعيا للاولين أسابيع ويوميا بعد ذلك. عرض كاينورهابديتيس أفواج من نفس السلالة والأنواع إعمار مختلفة اختلافاً كبيرا عن طريق محاكمة¹⁷.
   ملاحظة: للمقايسة عمر الموصوفة هنا، مع الحيوانات TJ1060 مثقف عند 25 درجة مئوية، وقد حدث وفيات 95% في هؤلاء السكان من الكبار اليوم 16-20.
2. عندما تعتبر آبار المراقبة السلبية وصلت إلى > علامة 95%، وتدور أسفل كل ألواح المقايسة 96-جيدا ل 45 s على الطرد جدول أعلى مع ميكروسكوبية كيفت الدوار (غ 250 x ل 45 s عند 20 درجة مئوية).
3. نقاط جميع الآبار في لوحات التحكم. يتم ذلك عن طريق العد وتسجيل العدد من الحيوانات على قيد الحياة ومات في كل بئر. يمكن أن تكون متباينة الديدان الميت من الديدان على قيد الحياة بافتقارها التام للحركة. إثارة الحركة في الديدان حيا بإسقاط اللوحة جيدا 96 من حوالي 7 سم على سطح مجهر تشريح بينما تبحث من خلال العدسة لأي رد مقولة. الديدان الميت لن يستجيب، والاصحاب مختبر قريب قد لا نقدر الضوضاء المتكررة.
4. لوحات الاختبار، عد وتسجيل الآبار فقط التي تحتوي على ديدان حية. عندما يلاحظ دودة حية، عد جميع الحيوانات على قيد الحياة ومات في ذلك جيدا، جنبا إلى جنب مع الموقف جيدا ولوحة.
   ملاحظة: يكون من المفيد غالباً نقاط إعادة اللوحات بعد > 99 ٪ ديدان الرقابة السلبية ميتة. في الشاشات الكبيرة، قد يكون هذا أفضل نقطة للقيام بالتسجيل الأولى. وفي كلتا الحالتين، نقاط/إعادة-سكر كما هو موضح أعلاه

11-إعادة اختبار المركبات

1. عند اختبار سوى عدد صغير من المركبات المرشحة (< مركبات 320)، ومع إعادة اختبار أو شاشة مرشح (انظر نتائج الممثل)، تقييد المقايسة إلى الآبار المركزية 32 في محاولة للتقليل إلى أدنى حد ممكن لوحة التأثيرات. وهذا يترك الآبار 2 الأقرب إلى حافة اللوحة غير المعالجة ولكن لا يزال يحتوي على أجار، والغذاء، والديدان.

النتائج

نبدأ بدراسة نتائج تمثيلية من استخدام هذا البروتوكول لفحوصات عمر 96-جيدا. في المثال الأول، واستخدمت الأسلوب الشاشة من خلال المواد الكيميائية 30,000 بنجاح تحديد المواد الكيميائية أن تمديد عمر C. ايليجانس، ويشمل أيضا نتائج من شاشة متابعة إعادة اختبار أفضل أداء باستخدام المواد الكيميائية البروتوكول نفسه. وكانت هذه النتائج هو موضح سابقا¹. يستخدم المثال الثاني نفس البروتوكول في شاشة أصغر حجماً من المركبات المرشحة.

الشاشة على نطاق واسع وإعادة اختبار: الشاشة على نطاق واسع اختبار المركبات 30,000 أجريت في جرعة واحدة، في تكرار. ولذلك تم اختبار كل مادة كيميائية في بئرين مع مجموع سكان حيوانية المتوقعة من 20. لتحقيق هذا الهدف، تم فحص ثلاث مجموعات منفصلة من مركبات 10,000 (بالتكرار) على مدى فترة ~ 3 أشهر لتغطية المركبات 30,000 كامل. هذا كان عمله في جزء منه، لضمان مبلغاً معقولاً التهديف اليدوية في نهاية المقايسة والمطلوبة ما مجموعة 260 ألواح المقايسة 96-جيدا في كل مجموعة من المجموعات. في لوحات مكتبة المخزون، والوارد فقط 80 بئرا المجمع؛ تكرار واحد من مركبات 10,000 يجعل 125 فحص الصفائح. استخدمت هذه الدراسة 2 replicates مع 10 لوحات التحكم السلبي في كل مجموعة. لزيادة الإنتاجية، ولوحات كانت سجل عندما قيمت السكان السيطرة السلبية التي شهدت وفيات ~ 99%. اختبار جميع الآبار ثم بحثت للديدان الحية.

المواد الكيميائية في الآبار مع دودة حية واحدة كانت تسمى يضرب. المواد الكيميائية في الآبار التي تحتوي على أكثر من 1 دودة على قيد الحياة كانت أيضا يسمى يضرب، وعلاوة على ذلك جميع الديدان في هذه الآبار (حيا وميتا) أحصى لتوليد نقاط بسيطة (نسبة إلى النتيجة على قيد الحياة؛ عدد الديدان حيا مقسوماً على عدد القتلى الديدان). كل مادة كيميائية في المكتبة يمكن لذلك أن يسمى ضرب مرتين ويمكن أن تلك الزيارات، ولكن قد لا يكون عشرات المرتبطة بها. تم استدعاء المواد الكيميائية المميزة 512 مرات (مرة واحدة على الأقل) من شاشة مركبات 30,000. وقد أجرى الشاشة قصد تحديد الآثار المؤيدة طول العمر (استنساخه) قوية و/أو قوية. هاتين الخاصيتين مختلفة قد آثاراً متميزة. يمكن زيادة المواد الكيميائية القوية كبيرة عمر، في هذه الحالة فإننا نتوقع نسبة عالية من الديدان على قيد الحياة بشكل جيد تلك المادة الكيميائية. لمواد كيميائية قوية، يتوقع كلا replicates قد الديدان الحية. كان مرتبة في القائمة على أساس هذه المعايير. 179 من المواد الكيميائية أسفرت عن ارتفاع نسبة عشرات على قيد الحياة، أو أصيبت في كلا replicates واختيرت لذلك لإعادة الاختبار. معظم المواد الكيميائية المتبقية التي كانت تسمى يضرب، لكن لم يتم تحديدها لإعادة الاختبار، قد لا يتضمن إلا دودة واحدة على قيد الحياة في أحد الآبار نسخ متماثل.

وكان إعادة الاختبار من الزيارات المؤداة، مشابهة للشاشة الرئيسية ما عدا مع replicates 3 (السكان الحيوانية الإجمالية المتوقعة من 30)، والقياس الكمي الدقيق لإعمار الحيوانات في لوحات التحكم غير المعالجة. وأضيفت هذه التغييرات للمساعدة في المقارنة بين آبار الاختبار والمراقبة. أمرت بإعادة 179 مرات الكيميائية، تضعف إلى 10 ملم، واقتحمت 96 لوحات جيدا. استخدمت الآبار 24 الداخلية فقط للمقايسة إعادة اختبار (الإصدارات الحالية من هذا البروتوكول قد استخدمت الآبار 32 الداخلية كما هو موضح في المقطع بروتوكول لإعادة اختبار شاشات) والمركبات كانت إعادة اختبارها في ثلاث نسخ بست لوحات المقايسة المراقبة السلبية تعامل مع المذيب [دمس]. لوحة التحكم سلبية واحدة سجلت بشكل دوري لبقاء مجموع (الشكل 1أ). عند حوالي 95% من مراقبة الحيوانات قد لقوا حتفهم، وسجل جميع لوحات كانت تماما (كل معاملة العيش واحصى القتلى الديدان).

لاستدعاء يضرب من نتائج إعادة الاختبار، تم وقف في النقاط على قيد الحياة نسبة متوسط الانحرافات القياسية السلبية السيطرة + 2 (SD). لاختبار الآبار، بلغ في المتوسط % على قيد الحياة (وقت التسجيل) حسبت العشرات بمتوسط نقاط النسبة المئوية على قيد الحياة من replicates ثلاثة لكل بئر. لهذا التحليل خاصة، حسبت العشرات على قيد الحياة نسبة متوسط آبار المراقبة السلبية كمتوسط replicates ثلاثة آبار 48 (2 مجموعات من لوحات التحكم سلبية ثلاث). وكان SD المستخدمة في استدعاء عدد من مجموعة المواد الكيميائية إعادة اختبار SD عبر المراقبة السلبية 48 بلغ متوسط النسبة المئوية العشرات على قيد الحياة. باستخدام هذه الاستراتيجية، وجدت هذه الدراسة تبلغ 57 من المكتبة إعادة اختبار المركبات 179، مما يدل على أن ما مجموعة 32% من المواد الكيميائية إعادة اختبار اختبار إيجابي (الشكل 1ب). Binning من عشرات حيا متوسط النسبة المئوية لمراقبة واختبار الآبار السلبية أشارت إلى أن اختبار الآبار تفوقت الآبار التحكم (الشكل 1ج).

مرشح الشاشة: شاشات صغيرة الحجم يمكن أن يؤديها بطريقة مماثلة لإعادة اختبار الموصوفة أعلاه. هنا، يمكننا وصف النتائج من شاشة مرشح مع مركبات 139. تم تجميع هؤلاء المرشحين كالهياكل المحتمل لتعزيز طول العمر. على هذه الشاشة، أجرينا replicates 5 لوحات الاختبار على جرعتين مختلفة (50 ميكرون و 100 ميكرومتر). بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا 8 لوحات التحكم السلبي، مع لوحة تحكم إيجابي واحد (NP1) التي تحتوي على جرعتين مختلفة؛ ميكرومتر 50 و 100 ميكرومتر.

وتم رصد لوحات التحكم السلبي حتى ~ 90% حيوانات قد لقوا حتفهم. في ذلك الوقت، وقد سجل الآبار عد الديدان الحية والميتة في كل مراقبة الآبار، ومن آبار الاختبار يحتوي على الديدان الحية. واستخدمت نسبة حيا في الوقت سجل لحساب متوسط الدرجات على قيد الحياة النسبة المئوية لكل بئر. كان 32 بئرا للضوابط السلبية، وعشرات على قيد الحياة نسبة من 8 replicates. لعناصر إيجابية، كانت هناك 4 درجات جيدا في المتوسط عبر replicates 4 لكل جرعة. ودعي يضرب الآبار مع نقاط على قيد الحياة نسبة متوسط ما يزيد متوسط نقاط المراقبة السلبية في المئة على قيد الحياة + 2 التنمية المستدامة. قطع هذا ترك يضرب 14 من الشاشة مرشح واستبعاد كل من آبار المراقبة السلبية. أن قطع وشملت أيضا كل من عنصر التحكم إيجابية تعامل الآبار تعامل في 100 ميكرومتر و 50% من عناصر إيجابية في 50 ميكرومتر. وترد هذه النتائج هنا كإهمال بلغ متوسط نسبة عشرات حيا 50 ميكرومتر (الشكل 2أ) والشاشات الاختبار 100 ميكرومتر (الشكل 2ب).

أخيرا، كانت جميع لوحات سجل جديد في نقطة وقت متأخر، التي تناظر وقت عندما تعامل أكبر من 99 ٪ السيطرة السلبية الحيوانات قد لقوا حتفهم. تلك النتائج أشارت إلى أن آبار مراقبة إيجابية يقوم الآن خارج آبار المراقبة والاختبار السلبي (الشكل 2-ج). وفي حين اختبار الآبار التي كانت أفضل قليلاً من عناصر سلبية. هذه النتيجة الأخيرة منحازة بالإشارة إلى أن العديد من الآبار الاختبار يبدو معرض سمية مقارنة بمعاملة السيطرة (الجدول 1)، وبالتالي الخلط هذا التفسير البسيط. وهذا كان متوقعا، نظراً للمكتبة مرشح كان شاشة حقيقية من المواد الكيميائية ذات النشاط البيولوجي غير معروف في C. ايليجانس، بينما الشاشة إعادة اختبار أساسا فرزهم للمركبات غير سامة. نظراً لهذه الشاشة الرئيسية للمركبات التي تطول عمر، إلى حد كبير المواد الكيميائية السامة يجب أن لا في إعادة اختبار تم.

الشكل 1 : الممثل ناتجة عن ارتفاع الشاشة الإنتاجية وإعادة الاختبار
حالة البقاء على الحياة (أ) منحنى من لوحة تحكم سلبي ممثل المستخدمة في التحليل إعادة اختبار. وقد شيد هذا المنحنى من سجل جميع الديدان الحية والميتة في الآبار 24 المستخدمة في هذا التحليل 4 مرات على مدى 18 يوما من المقايسة. في يوم 18 من مرحلة البلوغ، تم تقييم الضوابط أن يكون بقاء ~ 5% وقد سجل كل اختبار عنصر التحكم ولوحات ثم أيضا. (ب) جدول يلخص نتائج الشاشة وإعادة اختبار. (ج) بينينج من عشرات الآبار في المتوسط على قيد الحياة نسبة لشروط مراقبة واختبار من شاشة إعادة اختبار. لعناصر التحكم، عشرات هي من آبار 48 كل يتألف من متوسط 3 replicates. نتائج الاختبار هي من 179 بئرا كل منها تتألف من درجة متوسطة من replicates ثلاثة. يرد الرقم 1 من منشور سابق¹. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : الممثل النتائج من شاشة مرشح
(أ) بينينج من النتائج من الشاشة المرشح 50 ميكرومتر. تمثل نتائج اختبار الآبار 139 نقاط على قيد الحياة نسبة متوسط من 5 replicates. نتائج المراقبة السلبية 32 تتكون من متوسط الدرجات على قيد الحياة نسبة من 8 replicates. 4 نتائج إيجابية تحكم تتألف من عشرات على قيد الحياة نسبة متوسط من 4 replicates (إجمالي 16 آبار NP1 تحتوي على 50 ميكرومتر). (ب) بينينج من النتائج من الشاشة المرشح 100 ميكرومتر. كل ما هو نفسه كما في (أ)، إلا أن اختبار الآبار وعناصر إيجابية يعاملون تركيزات 100 ميكرومتر. تظهر لوحات التحكم السلبي نفسه في على حد سواء (A و B). (ج) ممثل ناتجة عن إعادة تسجيله اللوحات عند نقطة وقت تأخر الشديد نسبيا. عناصر إيجابية هائلة تفوقت جميع الآخرين، وإذا كانت المحاسبة فقط للنسبة المئوية من الآبار مع الديدان حية عند هذه النقطة الزمن، الذي هو متحيز ضد آبار الاختبار كما هو موضح في النص الرئيسي و الجدول 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

	Binning متوسط النسبة المئوية عشرات على قيد الحياة
عشرات مجمعة	جميع القتلى (0)	1-10	11-20	21-30	31-40	> 41
إعادة اختبار
# (-) لعنصر التحكم	16	31	1	0	0	0
# اختبار الآبار (50µM)	46	69	50	8	3	3
مرشح الشاشة
# (-) لعنصر التحكم	0	11	21	0	0	0
# (+) التحكم (50µM)	0	0	2	2	0	0
# (+) التحكم (100µM)	0	0	0	0	2	2
# اختبار الآبار (50µM)	94	22	21	2	0	0
# اختبار الآبار (100µM)	86	25	21	6	1	0

الجدول 1: يؤدي الممثل من binning شاشات مختلفة
نقدم هنا binning عشرات حيا متوسط النسبة المئوية من الشاشتين (إعادة اختبار والمرشح). في شاشة إعادة اختبار، الذروة مماثلة لمراقبة سلبية مع اختبارات إعادة متجاوزا مراقبة سلبية هائلة على الحق الجانب (المعمرة) من الجدول. وهذا يدل على وجود عدة مركبات المؤيدة طول العمر موجودة في مجموعة إعادة اختبار. في شاشة المرشح، أننا نرى أن الذروة في الفئة جميع القتلى، بينما هناك أيضا إشارة واضحة من الجانب الأيمن من الجدول. هذا يشير إلى وجود المركبات المؤيدة طول العمر في تعيين مرشح، ولكن أيضا يدل على وجود سمية كبيرة بين المجموعة المرشحة للمركبات.

Discussion

هنا لقد قمنا بوصف طريقة بسيطة لاستزراع C. ايليجانس في لوحات 96-جيدا. يمكننا وصف هذه الثقافات لاستخدامها في الكشف عن المواد الكيميائية وفحوصات عمر، ولكن يمكن استخدامها لأنواع عديدة من الاختبارات. بينما سابقا كانت ظروف الثقافة المتعددة جيدا للفحص الكيميائية المبلغ عنها⁸، بما في ذلك تحليل عمر¹⁰، تختلف المقايسة الموصوفة هنا في عدة طرق. مقايسة عمر الموصوفة هنا تستخدم لوحات 96-جيدا ويعتمد على طفرات العقيمة (بدلاً من التعقيم الكيميائي) ويستخدم أجار الثقافة الشروط، ويستخدم السائل بسيطة التعامل مع نقل الديدان وهو سجل يدوياً في نقطة النهاية. قد يكون النهج المختلفة المستخدمة في هذا التحليل لمساعدة الباحثين تبحث عن فحص الأساليب التي تتضمن هذه الشروط.

مركز العناصر الحاسمة لهذا البروتوكول أساسا على نوعية اللوحات المنتجة للانزيم. أولاً، عندما صنع ألواح يتحتم أن السطح أجار مجاني فقاعات وعيوب أخرى. هذه الاختلافات في السطح أجار تؤدي دائماً تقريبا إلى تختبئ وفقدان البئر. ثانيا، وهذا البروتوكول يعتمد على تجفيف قبالة السوائل المودعة خلال مراحل الإعداد والتخدير. من الأهمية بمكان أن تتم إزالة هذه السوائل تماما، ولكن لا تصبح جفت في أجار. الروايات المتناقلة، ويبدو أن الديدان في الآبار التي ليست تماما المجففة (سباحة في السائل) يعيش أطول من الآبار الجافة بشكل صحيح، بينما الإفراط تجفيف اللوحات ويؤدي إلى جفاف وتكسير لاجار، الأمر الذي يؤدي إلى دودة تختبئ والخسارة. عنصر حاسم آخر من هذا البروتوكول هو الحفاظ على ظروف معقمة. كما مع أي عمر المقايسة، وهناك الكثير من العمل تشارك في إعداد لوحة، وهناك العديد من الفرص والوقت للمقايسة تخريب التلوث تسوية وتنمو على اللوحات.

بينما الإنزيم عمر الموصوفة هنا مفيد لفحص المركبات في C. ايليجانس، فيقتصر على الخلفيات الوراثية خاصة، كما أنها لا تعتمد على سلالة عقيمة حساسة (ts) درجة حرارة؛ كنا TJ1060، الذي قد penetrance العقم عالية. وهذا يقيد سلالات متاحة للفحص مع هذا الأسلوب. النهج البديلة بما في ذلك عبور إتس الطفرات العقيمة إلى الخلفية المطلوبة أو استخدام التعقيم الكيميائي. لقد حاولنا عدم التعقيم الكيميائي مع هذا التحليل، ولكن ينبغي أن يكون ممكناً. وتشمل العقبات المحتملة وضع المطهر على الديدان في المرحلة الصحيحة وفي الجرعة الصحيحة. هنا يستخدم بروتوكول وصف موزع سائلة بسرعة، ولكن لا يبدو أن الاستغناء عن البالغين على نحو فعال. لذا، هذه الديدان وضع على اللوحات ولذلك يجب أن تعامل مع التعقيم الكيميائي على اللوحات. تحديد الجرعة المثلى والتوقيت سيكون مهما للنجاح. وتشمل الاستراتيجيات البديلة استخدام أسلوب الاستغناء عن نقل الكبار. في الماضي، وقد وجدنا أن آلات قادرة على تحديد وفرز البالغين عموما أبطأ بكثير من معالجات السائل البسيطة، التي يمكن الاستغناء عن عجائن متجانسة من اليرقة مع وقف التنفيذ.

وبصفة عامة، نستخدم هذا الأسلوب بسرعة الشاشة المواد الكيميائية والعلاجات لآثار إيجابية كبيرة على عمر. الطريقة فعالة بشكل خاص عند استخدامها بجرعات متعددة، وتكرار أرقام عالية، ورصد دقيق لعناصر سلبية دائماً الحفاظ على ويتخلل بين لوحات الاختبار. عناصر إيجابية مفيدة أيضا عند تصميم وتنفيذ الشاشات الموصوفة في هذه المخطوطة. ومع ذلك، يكون إيجابية فعالة، عنصر التحكم سيلزم قوية إلى حد ما و/أو قوية جداً. عندما تم نشر الشاشة أصلاً، تعذر تعريف مركب قوية ومتينة على نحو ملائم. حاليا، هناك العديد من التقارير في الأدب 'الشيخوخة' من المرشحين المحتمل لعناصر إيجابية مفيدة في الشاشات الموصوفة هنا. كما هو موضح في المقطع شاشة مرشح قسم النتائج المتوقعة من هذه المخطوطات، وفي الشكل 2 و الجدول 1, NP1 مجمع عنصر إيجابي فعال لهذه الشاشة. ونؤكد عموما يضرب إيجابية من هذه الشاشات مع فحوصات عمر القياسية على ألواح الثقافة 3 مم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth Miller Granules	VWR
Unispense	Wheaton Science Products		automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370	Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser	Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick	Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker	Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital	IKA Works, inc.
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler	Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor	Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes	we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film	USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R	Eppendorf