Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo simples para produzir rapidamente centenas de ágar de mídia de crescimento nematoide, placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de Caenorhhabditis elegans por bem. Estas culturas são úteis para a seleção fenotípica de organismos toda. Nós focamos usando essas culturas para produtos químicos de tela para efeitos de pro-longevidade.

Resumo

Caenorhabditis elegans é um organismo útil para testar os efeitos químicos sobre fisiologia. Telas de pequenas moléculas de todo organismo oferecem vantagens significativas para a identificação de estruturas químicas biologicamente ativas que podem modificar fenótipos complexos tais como expectativa de vida. Aqui descrito é um protocolo simples para produzir centenas de placas de cultura de 96 poços, com números consistentes de c. elegans em cada poço. Em seguida, especificamos como usar essas culturas para tela milhares de produtos químicos para efeitos sobre a expectativa de vida do nemátodo c. elegans. Este protocolo faz uso de cepas estéril sensível de temperatura e condições de placa de ágar simples animal para facilitar a produção rápida e alta taxa de transferência das culturas animais sincronizadas para rastreio de manipulação.

Introdução

Aqui um protocolo é descrito que foi desenvolvido para a seleção de alta taxa de transferência de compostos químicos para efeitos na expectativa de vida Caenorhabditis elegans . O protocolo em si é facilmente adaptável para outras telas fenotípicas, incluindo estudos utilizando cepas de c. elegans de repórter. Este protocolo foi utilizado com sucesso para identificar um novo composto biologicamente ativo, PN1 (nitrofenil-piperazina 1), que fortemente se estende a vida útil de c. elegans , através de um mecanismo de restrição dietética. Pn1 e uma caracterização do seu efeito sobre a expectativa de vida, incluindo uma descrição das vias genéticas em jogo, foi anteriormente descritos em outra parte¹. O relatório também inclui uma descrição dos resultados de uma implementação em larga escala da tela. Aqui descrevemos mais detalhadamente a metodologia e a configuração da tela em si, que é escalável para ambas as aplicações de pequena e grande escala.

O gol que levou à criação do protocolo descrito aqui foi desenvolver uma plataforma de cultura de c. elegans que permitiu para a seleção rápida de grandes bibliotecas químicas para romance compostos biologicamente ativos. Enquanto telas químicas foram realizadas antes do desenvolvimento do presente protocolo, estas foram principalmente em pequena escala e/ou tipo de candidato se aproxima de^2,3. Na verdade, a maioria das telas realizadas no laboratório em dezenas de compostos utilizados ensaios de resistência do stress, com hits, sendo projectados para longevidade efeitos⁴. Em vez disso, este estudo procurou diretamente da tela para efeitos de expectativa de vida. Surpreendentemente, houve poucas descrições na literatura científica aquando da realização de telas químicas de grande escala com c. elegans. Com efeito, em comparação com outros tipos de telas^5,6,7, triagem de química em larga escala usando c. elegans parecia ser subempregados.

Havia duas descrições das telas de química de grande escala em c. elegans que foram usadas como base para desenvolver esta abordagem. O primeiro deles foi um elegante estudo de laboratório de Peter Roy usando telas químicas para identificar compostos que poderiam perturbar o desenvolvimento dos animais. O estudo seguiu então com uma tela de mutagénese frente para identificar os alvos genéticos destes produtos químicos⁸. O protocolo descrito nesse estudo usado pates 24-bem, que foi simplesmente impraticável para necessidades específicas do presente estudo (quantidades limitadas de química na biblioteca e espaço limitado disponível incubadora). Outro estudo foi de Michael Petrascheck inovador e ambiciosa pequeno-molécula tela para expectativa de vida estendendo produtos químicos^9,10. Esse estudo usou placas boas 384 e culturas líquidas. A outra característica principal desta tela foi o uso de FUDR (5-fluorodeoxyuridine) para inibir a produção de descendência quimicamente. Após considerável consideração do protocolo descrito nesse estudo, foram evitadas tanto esterilização química e culturas líquidas de c. elegans .

Embora FUDR é amplamente utilizado em experiências de vida útil de c. elegans , havia preocupações que FUDR podem causar interações medicamentosas imprevistos, ou aquele FUDR em si pode ter algum efeito na expectativa de vida. Recentemente esta última preocupação foi validada, pelo menos em algumas concentrações e em particular a 25 ° C¹¹. Para contornar o problema da contaminação de progênie, c. elegans estirpe TJ1060 foi usado, que abriga duas mutações sensíveis de temperatura independentes (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) que suprimir a produção de espermatozoides e tem sido demonstrado para ser útil para culturas em massa das populações síncrona¹². Esta estirpe foi completamente estéril a 25 ° C, mas irá produzir descendência quando cultivadas em 15-20 ° C. Este estudo usado condições de cultura convencional, com vermes rastejando na superfície do ágar, conforme os resultados obtidos com as culturas de líquido nem sempre são reproduzíveis com placas de ágar convencional. Enquanto este fenômeno não é completamente compreendido, foi demonstrado que minhocas cultivadas em líquido responder a DR (restrição dietética) de uma maneira diferente do que vermes cultivadas na mídia padrão^13,14. Assim, é plausível que media líquidos pode mascarar alguns mimetics DR que caso contrário seria identificado com a tela.

Tendo resolvido sobre as condições de cultura de ágar, consideraram-se diferentes opções para pontuar o desempenho dos poços neste ensaio. Enquanto vários ensaios com base automatizados ou imagem estavam disponíveis, eles exigiram a aquisição e implantação de tecnicamente desafiador dispositivos, a maioria dos quais eram proibitivamente cara. Enquanto essas opções a considerar, era essencial para se referir a anterior telas de expectativa de vida de todos os tipos. Em última análise, este estudo usou um Pontuação método adaptado de tela de RNAi do Siu Sylvia Lee laboratório genoma inteiro para vida útil fenótipos¹⁵. Especificamente, todas as placas de expectativa de vida foram criadas da mesma forma, mas somente os controles negativos foram monitorados. Uma vez que as placas de controle negativo foram confirmadas para ter perto de mortalidade completa, placas de teste foram marcadas com a mão. Nesta tela em grande escala, positivos foram confirmados por re-testes com produtos químicos preparados na hora, usando triplicado repete o primário positivos.

Protocolo

1. preparação de Buffers

1. Caldo LB
   1. Use pré-misturados grânulos (veja a Tabela de materiais) e seguir o protocolo do fabricante para a preparação.
2. Crescimento de nematoides Media (NGM) ágar
   1. Misture a 23 g de ágar-ágar, 3 g de NaCl, 2,5 g de bacto peptona, e água desionizada para 0.972 L. Autoclave e deixe esfriar a 60 ° C, em seguida, adicionar 25 mL de tampão de fosfato (KPO₄) de potássio 1m (pH 6,0), 1 mL de 1m de sulfato de magnésio (MgSO₄) , 1 mL de 1 M de cloreto de cálcio (CaCl₂) e 1 mL de colesterol de 5 mg/mL (em etanol).
3. Solução de hipoclorito
   1. Misture 5 mL de 5 M de KOH, 4 mL de solução de hipoclorito de sódio (6%) e desionizada H₂O para um volume total de 50 mL.
4. S basal
   1. Misture 5 g de NaCl, 1 g de K₂HPO₄, 6 g de KH₂PO₄e água desionizada para 1L, então autoclave.

2. preparação de concentrado de Escherichia coli (OP50)

Nota: Este passo se concentra em 1 L de uma solução saturada de Escherichia coli em 25 mL de tampão basal de S.

1. Inocular 5ml de autoclavado caldo LB (etapa 1.1) com uma única colônia de e. coli (cepa OP50) e incube por 4-6 h a 37 ° C, com agitação (250 rpm). Use 0,1 mL desta solução para inocular 1 L de LB em um Erlenmeyer de 2 L. Incube os 1L frascos durante a noite (12-16 h) a 37 ° C, com agitação (250 rpm).
2. Centrifugue a culturas durante a noite de 1 L em garrafas de 500 mL centrífuga durante 5 min à 10.000 x g e 4 ° C para as bactérias de pelotas e decantar fora mídia restantes. Resuspenda o pellet em 25 mL de S Basal (etapa 1.4). Loja a 4 ° C.

3. preparação das placas de cultura NGM

1. Para placas de cultura de massa usadas para produzir um grande número de vermes, dispense 30 mL de ágar NGM fundido (60 ° C) (etapa 1.2) em um fluxo laminar em placas de cultura de 10 cm com um aparelho de distribuição fluido automatizado ou uma pipeta sorológica. Deixe secar durante a noite.
2. Pipetar 2 mL do concentrado OP50 em cada placa de 10 cm, espalhar para cobrir completamente a superfície do agar por inclinar e girar a placa, então deixe chapas secar. Armazenar as placas a 4 ° C por até 2 semanas.
3. Para placas de cultura de ensaio de alto throughput usadas para a seleção, utilizam um dispensador de 8 canais automatizados para dispensar 0,15 mL de ágar NGM derretido em cada cavidade de uma placa bem 96 em um gabinete de fluxo laminar. Muito cuidado para fazer poços de certo são desprovido de bolhas, como estas permitirá escoar-se de vermes que irão comprometer o ensaio naquele poço. Deixe secar durante a noite. Armazenar as placas a 4 ° C por até 2 semanas.

4. preparação de temperatura sensível (ts) culturas de massa estéril C. Elegans

1. Para iniciar as culturas, usando um 'verme pick' (escolher uma pipeta de vidro com um fio de platina anexado ou um verme manufacturado) sob um microscópio de dissecação, transferir 20 ovos (estirpe TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) em placas de cultura de massa, preparadas na etapa 3.1. Em seguida, incubar as placas a 20 ° C por 6 dias (permite mais de uma geração de crescimento, como você está direcionando para a coleção da descendência dos 20 ovos movidos).
2. Visualmente, confirme presença de gravid adultos (ovos presentes no útero) com um microscópio de dissecação. Colete os adultos gravid por dispensar 2-3 mL de S basal na chapa usando uma pipeta de vidro. Agite o líquido ao redor da placa à mão, em seguida, recolher o líquido em um tubo de 15 mL com uma pipeta de vidro.
3. Girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos a 20 ° C) para vermes de pelotas e, em seguida, Aspire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de solução de hipoclorito (etapa 1.3) para a pelota de verme e agitar rapidamente o tubo à mão em uma direção de cima para baixo durante 5 s. Incubar por 5 min, agitando a cada 2,5 min.
4. Novamente, girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos); o sedimento deve ser marrom-amarelada. Aspire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de solução de hipoclorito para a pelota de ovo e agitar vigorosamente o tubo. Incube a 1-3 min, agitando ocasionalmente e enquanto monitora a aparência com o microscópio de dissecação. Confirme visualmente apenas ovos restam e prossiga para a próxima etapa.
5. Girar o tubo (1.000 x g durante 1,5 minutos) e aspire o sobrenadante. O sedimento deve ser branco com nenhuma coloração marrom.
   Nota: Após a remoção da solução de hipoclorito, é fundamental usar técnicas estéreis e buffers, desde contaminação (bacteriana e fúngica, em particular) podem arruinar a experiência, desperdiçando um tempo precioso e reagentes. Este estudo usou um gabinete de filtrado de fluxo laminar e mudou-se líquidos usando somente pipetas estéreis e dicas.
6. Abra os tubos em um espaço estéril. Lave o pellet 3 vezes com S basal, girando para baixo (1.000 x g durante 1,5 min) e aspiração afastado o sobrenadante de cada vez. Ressuspender o pellet de ovo em 2-3 mL S basal. Estes ovos agora podem ser usados para uma escotilha da noite no buffer para coletar larva L1 (passo 5).

5. C. Elegans dos ovos para incubação em Buffer para obter culturas síncronas (preparação de larva L1 C. Elegans )

1. Decante o buffer e o pellet de ovo para um prato de petri de vidro estéril com uma tampa. Lave os ovos restantes do tubo em um prato com uma pipeta sorológica com 2-3 mL de S basal. Adicione 5 mL de S basal para aliviar apinhamento, como isto pode incentivar a incubação, como acender-se-á de agitação (20 rpm com um agitador orbital de dançarina do ventre). Incube durante uma noite a 20 ° C, para permitir que o tempo de ovos à escotilha (16-24 h). Todos os filhotes prenderá a 1 fase larval^st (L1), devido à ausência de alimentos.
   Nota: A evidência anedótica indica que preparações frescas de L1 (16-36 h após a coleta de ovos) geram as populações mais síncronas de vermes adultos.
2. Colete L1s em um tubo de 15 mL com uma pipeta sorológica. Spin para baixo L1s em um centrifugador (1.000 x g durante 1,5 minutos), embora Aspire o sobrenadante e repita até que todos os L1s foram coletados de incubação placas, deixando 10 mL de S basal para a próxima etapa.
3. Do tubo contendo L1s, micropipeta sair 0,01 mL (imediatamente após a mistura) e dispense-lo em um não-semeada (não de e. coli) placa NGM. Conte o número de L1s na placa. Repetir 10 vezes e obter uma média para o número de L1s em cada alíquota. Geralmente, espera-se entre 1-3 L1s por µ l (quando começando com 1 placa de cultura de massa, contendo 20 ovos).
4. Determine com uma pipeta sorológica, o volume de S basal segurando o L1s. Então extrapolar com determinado número médio de vermes por 0,01 mL, obtida na etapa anterior, para estimar o número total de L1s. Geralmente, espera que entre 10.000-30.000 L1s (por placa de cultura de massa contendo 20 ovos).
5. Para usar esta cultura com 96 poços-teste, diluir a suspensão de L1 a 1 L1 por µ l em um frasco estéril redonda mídia e, em seguida, avance para o passo 7. Se esta cultura é para ser usado para gerar adicionais c. elegans culturas de massa, em seguida, avance para o passo 6.

6. grande escala síncrono cultura preparação

Nota: Soluções de L1 podem ser usadas para aumentar rapidamente a populações de verme.

1. Para gerar números de verme grande com uma solução de L1, dispense até 5.000 L1s em cada uma das placas de cultura de massa, o número desejado. Coletar gravid adultos 2,5 dias depois (20 ° C), conforme descrito nas etapas 4.1-2 e avance para o passo 4.3 para recolher os ovos.
2. Como curiosamente observou que repetiu coleção hipoclorito pode salientar a população subjugada, dividir as populações por colhendo ovos de propagação antes de submeter a população remanescente para tratamentos de hipoclorito, então esse múltiplo gerações da população não são repetidamente submetidas a tratamento da solução de hipoclorito.

7. instalação de placas de 96 poços de ensaio

1. Permitir que as placas de ensaio (preparadas na etapa 3.3) para atingir a temperatura. Em seguida, em um fluxo laminar, adicione 5 µ l de concentrado OP50 (preparado no passo 2.2) a cada poço. Como antes, use um dispensador de 8 canais automatizados.
2. Adicione 10 µ l de suspensão de L1 a cada poço usando um dispensador de 8 canais automatizados. Isto produzirá sobre vermes média 10 por alvéolo, uma vez que eles estão presentes na suspensão em 1 L1 por µ l. Para promover a distribuição igual de L1s do chorume, dispense L1s de uma garrafa redonda mídia ativamente misturada com um moderadamente lentamente girando barra de agitação.
3. Cubra o prato com tampa, lotes de caixa de placas e incubar a 25 ° C por 2 dias.

8. tratamento 1 ^st dia adultos de c. elegans com produtos químicos

1. Remover placas de biblioteca química do freezer e deixe chapas atingir a temperatura ambiente antes de prosseguir.
   Nota: Placas biblioteca química descritos aqui são 96 bem as placas contendo compostos distintos em cada poço, todos os que estão na mesma concentração e dissolvidos em DMSO. Essas bibliotecas não utilizam as colunas externas, e então cada placa tem um máximo de 80 substâncias químicas distintas. O protocolo descrito aqui, a concentração de biblioteca é 10mm. É importante considerar os efeitos de solventes na fenótipos. Enquanto este estudo telas na concentração de 0,5% DMSO, este nível nunca foi ultrapassado nestes ensaios de vida útil e em ensaios de baixa taxa de transferência, onde é mais provável que escolher uma concentração de solução-mãe composto. Este protocolo não excede 0,25%, que é um nível em que modificações de expectativa de vida não ocorrem¹⁶, pelo menos da estirpe de N2.
2. Agite suavemente o prato em 60 rpm num agitador microplacas para 1 min imediatamente antes da utilização.
3. Usando um automatizado líquido 96 poços manipulador, transferência 0,75 µ l do composto (ou DMSO) da placa de biblioteca para a placa de ensaio. A profundidade da pipeta durante a entrega de líquido para a placa de ensaio é controlada cuidadosamente, tal que as pontas de pipeta do manipulador de líquido estão entregando o volume 0,75 µ l para o µ l ~ 15 de líquido na superfície do ágar (com vermes e OP50 concentrado de passos 7.1 -2) e não perfurar a superfície do agar no poço. Não utilize pipetas multicanal de manual 8 ou 12 exceto em telas muito pequenas (< 10 placas), como eles podem aumentar o erro e muitas vezes resultar em perfuração da superfície do agar, que compromete o ensaio.
4. Prepare-se placas de controlo negativo biblioteca química com DMSO (dimetil sulfóxido), assumindo que a biblioteca que está sendo testada usa DMSO como solvente. Fazer 1 placa de controlo negativo para cada 5 teste de placas, até 10 placas de controlo negativo. Se possível, também fazer uma placa de controle positivo (PN1¹ a 20 mM, para uma concentração final de 0,1 mM, é eficaz para este fim; ver seção resultados representante). Não adicione produtos químicos (teste ou controle) para as 2 colunas exteriores das placas, como eles são particularmente suscetíveis a dessecação.

9. culturas de secagem

1. Para remover o líquido da superfície do agar, secar as placas no fluxo laminar para 4-8 h. É fundamental que estas placas são secadas completamente mas não tornar-se desidratado. Como algumas placas levará mais tempo para secar do que outros, acompanhar de perto todas as chapas e remover quando estão secos. Confirme a secagem por inspeção visual cuidadosa dos poços individuais da placa.
   Nota: Dependendo de fatores que incluem a taxa de escape do gabinete, o tempo que isso leva deve ser empiricamente determinado. Essa etapa de secagem pode levar cerca de 4-8 h para um armário cheio.
2. Selo de placas com película transparente e, em seguida, colocar as tampas de chapa.
3. Girar as placas de 96 poços de ensaio para 45 s a 1.000 x g.
4. Armazenar as placas invertidas a 25 ° C.

10. culturas de C. Elegans de Pontuação para a longevidade

1. Monitorar placas de controlo negativo até > 95% de mortalidade é observada. Verifica placas semanalmente para as duas primeiras semanas e diariamente depois disso. Caenorhabditis coortes da mesma espécie e estirpe podem exibir lifespans significativamente diferentes julgamento¹⁷.
   Nota: Para o ensaio de vida útil aqui descrito, com TJ1060 animais, cultivados em 25 ° C, 95% de mortalidade nessas populações ocorreu de adulto dia 16-20.
2. Quando os poços de controlo negativo são considerados ter chegado a > 95% mark, spin para baixo todas as placas de 96 poços de ensaio para 45 s em uma centrífuga de mesa com uma microplaca adaptado do rotor (250 x g durante 45 s a 20 ° C).
3. Marca todos os poços nas placas de controle. Isto é feito contando e registrando o número de animais vivos e mortos em cada poço. Vermes mortos podem ser diferenciadas de vermes vivos por sua completa falta de movimento. Provoca movimento em vermes vivos, largando a placa bem 96 de aproximadamente 7 cm na superfície de microscópio de dissecação ao olhar através da ocular para qualquer resposta evocada. Vermes mortos não vão responder, e companheiros de laboratório nas proximidades não podem apreciar o ruído repetitivo.
4. Para as placas de teste, contagem e registro somente poços contendo vermes vivos. Quando uma minhoca ao vivo é observada, conte todos os animais vivos e mortos, naquele poço, juntamente com a posição bem e placa.
   Nota: Muitas vezes é útil marcar novamente as placas depois de > 99% de controlo negativo vermes estão mortos. Em telas de grande escala, isso pode ser o melhor ponto para fazer o marcador inicial. Em ambos os casos, Pontuação/re-score como descrito acima

11. re-testes compostos

1. Ao testar apenas um pequeno número de compostos do candidato (< 320 compostos), como com um re-teste ou uma tela do candidato (ver resultados representativos), restringir o ensaio aos 32 centrais poços em um esforço para minimizar os efeitos possíveis da placa. Isso deixa os 2 poços mais próximo à borda da placa não tratada, mas ainda contendo ágar, comida e vermes.

Resultados

Vamos começar examinando resultados representativos de empregar este protocolo para ensaios de vida útil de 96 poços. No primeiro exemplo, o método foi usado para a tela com êxito através de 30.000 produtos químicos para identificar os produtos químicos que estendem a vida útil de c. elegans e também inclui os resultados a partir da tela de acompanhamento re-teste de melhor desempenho de produtos químicos utilizando o mesmo protocolo. Estes resultados foram descritas anteriormente¹. O segundo exemplo usa o mesmo protocolo em uma tela menor escala de compostos de candidato.

Tela em grande escala e re-teste: A tela em grande escala 30.000 compostos de teste foi realizada em dose única, em duplicado. Cada produto químico, portanto, foi testado em dois poços, com uma população animal total esperado de 20. Para realizar isto, três conjuntos discretos de 10.000 compostos (em duplicado) foram exibidos durante um período de ~ 3 meses para cobrir os todo 30.000 compostos. Isto foi feito em parte, para garantir uma quantidade gerenciável de manual de pontuação no final do ensaio e exigido um total de 260 das placas em cada um dos conjuntos de ensaio de 96 poços. Em placas de biblioteca conservada em estoque, apenas 80 poços continham composto; um replicar de 10.000 compostos faz 125 placas de ensaio. Este estudo utilizou 2 repetições com 10 placas de controlo negativo em cada conjunto. Para aumentar a taxa de transferência, placas foram marcadas quando populações controle negativo foram avaliadas para ter experimentado ~ 99% de mortalidade. Teste todos os poços foram examinados em seguida para vermes vivos.

Produtos químicos em poços com um verme vivo eram chamados de sucessos. Produtos químicos em poços contendo mais de 1 verme vivo também foram hits chamadas e além disso todos os vermes esses poços (vivos e mortos) foram contados gerar uma simples Pontuação (Pontuação viva por cento; o número de vermes vivos dividido pelo número de vermes mortos). Cada produto químico na biblioteca poderia portanto ser chamado um sucesso duas vezes e os sucessos poderiam, mas talvez não, têm resultados associados a eles. 512 produtos químicos distintos foram chamados hits (pelo menos uma vez) no ecrã do 30.000 compostos. A tela foi realizada com a intenção de identificar efeitos de pro-longevidade (reprodutíveis) potentes e/ou robustos. Essas duas propriedades diferentes podem ter efeitos distintos. Produtos químicos potentes poderiam aumentar drasticamente a expectativa de vida, caso em que esperamos que uma porcentagem alta de worms para estar vivo no poço desse químico. Para produtos químicos robustos, ambas as réplicas deveria ter vermes vivos. A lista foi classificada com base nestes critérios. 179 dos produtos químicos rendeu altas pontuações vivas por cento, ou foram atingidos em ambas as réplicas e, portanto, foram escolhidos para o re-teste. A maioria dos restantes produtos químicos que foram chamados hits, mas não selecionados para o re-teste, continha apenas um único verme vivo em um dos poços de replicar.

Re-teste dos hits foi realizada, semelhante à tela principal, exceto com 3 repetições (população animal total esperada, de 30) e cuidadosa quantificação da expectativa de vida dos animais nas placas de controle não tratado. Estas mudanças foram adicionadas para auxiliar na comparação dos poços de teste e controle. 179 dos hits químicas foram reordenados, diluído a 10 mM e mudou-se para 96 placas bem. Só os interiores 24 poços foram utilizados para o ensaio de re-teste (versões atuais do presente protocolo teria usado os interiores 32 poços conforme descrito na seção de protocolo para telas de re-teste) e os compostos foram re-testados em triplicado com seis placas de ensaio de controlo negativo tratadas com solvente DMSO. Uma placa de controlo negativo foi marcada periodicamente pela sobrevivência total (Figura 1A). Quando aproximadamente 95% dos animais controle estivesse morto, todas as placas foram completamente marcadas (todos tratados e vermes mortos foram contados).

Para chamar sucessos dos resultados da re-teste, um corte foi feito para o placar vivo porcentagem médio dos controlo negativo + 2 desvios-padrão (SD). Para o teste de poços, em média por cento vivo (no momento de marcar um gol) escores foram calculados calculando o placar vivo percentual de três repetições para cada poço. Para este teste específico, golo de vivo porcentagem média dos poços de controle negativo foram calculados como a média das três repetições para 48 poços (2 conjuntos de placas de controlo negativo três vias). O SD costumava chamar de sucessos do conjunto química re-teste foi que o SD através do controlo negativo 48 em média por cento vivas partituras. Usando esta estratégia, este estudo encontrou 57 hits da biblioteca re-teste de 179 compostos, demonstrando que um total de 32% dos produtos químicos re-teste deu positivo (Figura 1B). Binning das pontuações vivas por cento em média para os poços de controle e teste negativos indicado que os poços de teste superaram os poços de controle (Figura 1C).

Tela do candidato: Telas de pequena escala podem ser realizadas de maneira semelhante para o reteste descrito acima. Aqui, descrevemos os resultados de uma tela de candidato com 139 compostos. Estes candidatos foram montados como estruturas susceptíveis de promover a longevidade. Para esta tela, foram realizadas 5 repetições das placas de teste em duas diferentes doses (50 µM e 100 µM). Além disso, usamos 8 placas de controlo negativo, com um prato único controle positivo (PN1) contendo duas doses diferentes; 50 µM e 100 µM.

Placas de controlo negativo foram monitoradas até ~ 90% dos animais foram mortos. Naquela época, poços foram marcados pela contagem de vermes vivos e mortos em todos os poços de controle e de teste de poços que continha vermes ao vivo. Os por cento vivos na hora de marcar um gol foram usados para calcular a média partituras vivas por cento para cada poço. Para os controles negativos, 32 poços tinham por cento vivas partituras de 8 repetições. Para os controles positivos, havia 4 pontuações bem médias de 4 repetições para cada dose. Sucessos foram chamados para poços com uma pontuação média de vivo por cento que era maior do que a média por cento controlo negativo vivo pontuação + 2 SD Este corte deixou 14 sucessos a partir da tela de candidatos e excluídos todos os poços de controle negativo. Esse corte também incluiu todos os do controlo positivo poços tratados em 100 µM e 50% dos controles positivos trataram em 50 µM. Estes resultados são apresentados aqui como guardado em média por cento vivas Partituras para ambos a 50 µM(Figura 2)e as telas de teste 100 µM (Figura 2B).

Finalmente, todas as placas foram re-marcou em um ponto do tempo final, que correspondeu a um tempo quando maior que 99% do controle negativo tratados animais foram mortos. Os resultados indicaram que os poços de controle positivo até agora out-realizada poços controle e teste negativos (Figura 2C). Enquanto os poços de teste foram um pouco melhores do que os controles negativos. Este último resultado é tendenciosa pela indicação que muitos dos poços apareceram a apresentam toxicidade em relação ao tratamento controle (tabela 1), desse modo, confundir esta interpretação simples. Isso era de se esperar, uma vez que a biblioteca do candidato foi uma verdadeira tela de substâncias químicas com atividade biológica desconhecida em c. elegans, enquanto a tela re-teste foi essencialmente pré-selecionados para compostos que não eram tóxicos. Desde que esta tela principal foi para compostos que alongou a expectativa de vida, significativamente produtos químicos tóxicos não devem ter sido no re-teste conjunto.

Figura 1 : Representante resulta de uma alta taxa de transferência a tela e re-teste
Curva de sobrevivência do (A) de uma placa de controlo negativo representante usada no ensaio de re-teste. Esta curva foi construída a partir de marcando todos os vermes vivos e mortos em 24 poços utilizados neste ensaio 4 vezes ao longo dos 18 dias do ensaio. No dia 18 de idade adulta, controles foram avaliados para ter ~ 5% de sobrevivência e todos os testes de controle e placas depois foram também marcou. (B) tabela Resumindo os resultados da tela e re-teste. (C) Binning de poços em média por cento vivo pontuações para condições de controle e teste de tela re-teste. Para controles, pontuações são de 48 poços cada uma consistindo da média de 3 repetições. Resultados do teste são 179 poços cada uma consistindo a pontuação média de três repetições. Figura 1 é reproduzida de uma anterior publicação¹. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Representante resulta de uma tela de candidatos
(A) Binning dos resultados a partir da tela de candidato de 50 µM. Os 139 resultados de teste bem representam o placar vivo por cento em média de 5 repetições. Os 32 resultados negativos de controle consistem em partituras de vivas por cento em média de 8 repetições. 4 resultados positivos de controle consistem em partituras de vivas por cento em média de 4 repetições (total 16 poços contendo PN1 em 50 µM). (B) Binning dos resultados a partir da tela de candidato de 100 µM. Tudo o que é o mesmo (A), exceto que o teste de poços e controles positivos foram tratados em concentrações de 100 µM. As mesmas placas de controlo negativo são mostradas em ambos (A e B). (C) representante resulta da re-marcando as placas em um ponto relativamente extremas de tempo atrasado. Controles positivos dramaticamente superaram todos os outros, se apenas representando o por cento de poços com vermes vivos neste ponto do tempo, que é tendencioso contra poços de teste, conforme descrito no texto principal e a tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Binning das pontuações vivas por cento em média
Golo de agrupados	Todos mortos (0)	1-10	11-20	21-30	31-40	> 41
Re-teste
n º de (-) controle	16	31	1	0	0	0
n º de poços de teste (50 µm)	46	69	50	8	3	3
Tela do candidato
n º de (-) controle	0	11	21	0	0	0
n º de (+) controlar (50 µm)	0	0	2	2	0	0
n º de (+) de controle (100µM)	0	0	0	0	2	2
n º de poços de teste (50 µm)	94	22	21	2	0	0
n º de poços de teste (100µM)	86	25	21	6	1	0

Tabela 1: Representante resulta de binning telas diferentes
Aqui nós apresentamos o binning das pontuações vivas por cento em média de duas telas (candidato e re-teste). Na tela do re-teste, o pico é semelhante ao controle negativo com os re-testes superando o controle negativo drasticamente à direita lado (longa vida) da tabela. Isto indica a presença de vários pro-longevidade compostos presentes no conjunto de re-teste. Na tela do candidato, vemos que o pico é na categoria de todos os mortos, enquanto há também um sinal evidente do lado direito da mesa. Isto indica a presença de compostos de pro-longevidade no conjunto de candidatos, mas também indica a presença de toxicidade significativa entre o conjunto de candidatos de compostos.

Discussão

Aqui descrevemos um método simples para cultivo de c. elegans em placas de 96 poços. Descrevemos essas culturas para uso na análise química e ensaios de vida útil, mas eles podem ser usados para vários tipos de ensaios. Enquanto as condições de cultura multi bem para rastreio química anteriormente foram relatados⁸, incluindo análise de expectativa de vida¹⁰, o ensaio descrito aqui difere de várias maneiras. O ensaio de expectativa de vida descrito aqui utiliza placas de 96 poços, baseia-se na estéril mutantes (em vez de esterilização química), usa as condições de cultura de ágar, usa líquido simples manipulação para mover vermes e manualmente é marcado no ponto de extremidade. As diferentes abordagens utilizadas neste ensaio podem ser de ajuda para investigadores à procura de métodos que incluem estas condições de pré-selecção.

Elementos cruciais para este protocolo centro principalmente na qualidade das placas produzidas para o ensaio. Primeiro, quando fazendo placas é imperativo que a superfície do agar é livre de borbulhas e outras imperfeições. Estas variações na superfície do agar quase sempre levam a construção de galerias e perda do poço. Em segundo lugar, esse protocolo depende secando líquidos depositados durante as fases de instalação e drogado. É fundamental que estes líquidos são completamente removidos, mas o ágar não tornar-se seco. Curiosamente, parece que os vermes em poços que não são completamente seco (natação em líquido) viver mais que poços devidamente secados, enquanto o ressecamento das placas leva à dessecação e rachamento do ágar, que leva ao verme burrowing e perda. Outro elemento crucial do presente protocolo é manutenção de condições estéreis. Como com qualquer ensaio de vida útil, há muito trabalho envolvido com a configuração da placa, e muitas oportunidades e tempo existem para arruinar a contaminação para se estabelecer e crescer com as placas de ensaio.

Enquanto o ensaio de expectativa de vida descrito aqui é útil para o rastreio de compostos em c. elegans, que se limita a determinado origens genéticas, como ele se baseia em uma estirpe sensível (ts) estéril de temperatura; usamos TJ1060, que tem penetrância alta esterilidade. Isso restringe as disponível para a seleção de cepas com este método. Alternativa se aproxima incluindo cruzando ts mutações estéril para o plano de fundo desejado ou usando a esterilização química. Nós não tentamos esterilização química com este ensaio, mas deve ser possível. Obstáculos potenciais incluem colocação o esterilizador nos vermes na fase correta e na dose adequada. O protocolo descrito aqui usa um líquido dispensador que é rápido, mas não aparece para dispensar adultos eficazmente. Então, esses vermes desenvolvem nas placas e, portanto, devem ser tratadas com a esterilização química nas placas. Determinar a dose ótima e o tempo seria importantes para o sucesso. Estratégias alternativas incluem o uso de um método de distribuição que pode mover-se adultos. No passado, nós encontramos que máquinas capazes de identificar e classificar os adultos são geralmente muito mais lentas do que os manipuladores de líquido simples, que podem dispensar lamas homogéneas de larva suspenso.

Em geral, usamos este método rapidamente produtos químicos tela e tratamentos para grandes efeitos positivos sobre a expectativa de vida. O método é particularmente eficaz quando utilizado com doses múltiplas, alta replicar os números e fechar o monitoramento dos controles negativos que são sempre mantidos e intercaladas entre as placas de teste. Controles positivos também são úteis quando projetando e implementando as telas descritas neste manuscrito. No entanto, para ser um positivo eficaz, o controle precisa ser bastante potente e/ou altamente robusto. Quando a tela foi originalmente implantada, um composto suficientemente potente e robusto não pôde ser identificado. Atualmente, existem muitos relatos na literatura 'envelhecimento' dos prováveis candidatos para controles positivos útil nas telas descritas aqui. Conforme descrito na seção de tela candidato da seção resultados esperados este manuscrito e na Figura 2 e tabela 1, o composto PN1 é um eficaz controlo positivo para esta tela. Nós confirmamos geralmente positivas correspondências a partir de telas com ensaios de vida útil padrão em placas de cultura de 3 mm.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth Miller Granules	VWR
Unispense	Wheaton Science Products		automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370	Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser	Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick	Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker	Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital	IKA Works, inc.
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler	Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor	Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes	we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film	USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R	Eppendorf