تحليل موائع جزيئية خلية واحدة نجحت عصية

Summary

نحن نقدم طريقة لتحليل موائع جزيئية الأنساب الخلية البكتيرية الفردية باستخدام نجحت عصية على سبيل مثال. الأسلوب ويتغلب على أوجه قصور أساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء الدقيقة بالسماح بمراقبة مئات الأجيال الخلية تحت ظروف النمو يمكن السيطرة عليها بشكل محكم وموحدة.

Abstract

التكنولوجيا موائع جزيئية ويتغلب على العديد من القيود المفروضة على الطرق التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية. خلافا لأساليب الثقافة السائبة، ويوفر القرار خلية واحدة والمراقبة طويلة الأوقات التي تمتد مئات من الأجيال؛ بخلاف [اغروس] المستندة إلى منصة الفحص المجهري، أنها ظروف النمو موحد يمكن التحكم بشكل محكم. لأن يعزل التدفق المستمر لمتوسط نمو الخلايا في جهاز موائع جزيئية من اختلافات لا يمكن التنبؤ بها في البيئة الكيميائية المحلية الناجمة عن نمو الخلايا والايض، وتغييرات حقيقية في التعبير الجيني ونمو الخلايا في الاستجابة إلى ويمكن ملاحظة منبهات محددة أكثر ثقة. نجحت عصيات يستخدم هنا كأنواع بكتيرية نموذجية لإثبات "آلة أم"-اكتب أسلوب للتحليل الخلوي. علينا إظهار كيفية بناء ورأسيا جهاز موائع جزيئية وتحميله مع الخلايا وبدء التصوير المجهري وتعريض الخلايا لحافز عن طريق التحول من متوسط النمو واحد إلى آخر. مراسل تستجيب لإجهاد كمثال للكشف عن نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها بهذه الطريقة. أيضا بإيجاز نناقش كذلك تطبيقات هذا الأسلوب لأنواع أخرى من التجارب، مثل تحليل تبوغ الجرثومي.

Introduction

واحدة من أبرز سمات الحياة على الأرض هو مرونة كبيرة ومتنوعة. هدفا مركزياً للبيولوجيا الجزيئية هو فهم المنطق الذي استخدم الخلايا الجينات والبروتينات لتحقيق أقصى قدر من النمو واللياقة البدنية تحت مجموعة متنوعة من الظروف البيئية. العلماء لتحقيق هذا الهدف، يجب أن تكون قادرة على مراقبة ثقة كيف تنمو خلايا فردية، تقسيم، والتعبير عن الجينات تحت مجموعة معينة من الظروف، مشيراً إلى كيفية استجابة الخلايا للتغييرات اللاحقة في البيئة الخاصة بهم. ومع ذلك، الأساليب التحليلية التقليدية في علم الأحياء المجهرية قد القيود التقنية التي تؤثر على أنواع الأسئلة التي يمكن معالجتها. على سبيل المثال، معظم التحليلات المستندة إلى الثقافة كانت مفيدة للغاية على مر السنوات، إلا أنها توفر بيانات مستوى السكان الذي يمكن أن تخفي الاختلافات خلية إلى خلية ذات مغزى أو في سلوك السكان الفرعية أصغر من الخلايا في مجموع السكان فقط. تحليلات خلية واحدة من البكتيريا الحية استناداً إلى الفحص المجهري الخفيفة تكشف عن سلوك خلية واحدة ولكن هي أيضا محدودة من الناحية الفنية. البكتيريا هي عادة معطلة على منصات [اغروس] يتضمن المتوسطة النمو، لكن الخليوي حشود شعبة ونمو رأي مجهرية ويستنزف المغذيات المتاحة بعد دورة الخلية عدد قليل، إلى حد كبير الحد من وقت الملاحظة^{1، 2}. وعلاوة على ذلك، المحلية استنفاد المغذيات وتراكم ما يصاحب ذلك من تركات الأيضي نتيجة لنمو الخلايا تتغير باستمرار البيئة نمو الخلايا المحلية بطرق يصعب قياس أو التنبؤ بها. هذه التغييرات البيئية باستخدام منصات [اغروس] تشكل تحديا للدراسات من السلوكيات حالة ثابتة أو الاستجابات الخلوية لتغييرات معينة في ظروف النمو³.

التكنولوجيا موائع جزيئية، التي يتم تدفق وسيلة سائل بشكل مستمر من خلال أجهزة ميكروفابريكاتيد، ويقدم حلاً لقيود التجريبي الكلاسيكي. جهاز موائع جزيئية يمكن أن تبقى خلايا فردية في موقف للفحص المجهري خلية يعيش بينما تدفق متوسط النمو باستمرار توفر الخلايا مع المواد الغذائية الطازجة ويجرف تركات الأيضي والخلايا الزائدة، مما خلق نمو عالية موحدة البيئة. ظروف النمو المستمر، ويمكن ملاحظة السلوكيات الخلية بمعزل عن التأثير العوامل البيئية، والسماح بطريقة عرض دون عائق من المنطق الداخلي للخلايا. كما يمنع تدفق السائل أصبحت مزدحمة بخلايا الجهاز موائع جزيئية، المراقبة الأنساب خلية واحدة لعشرات أو مئات من الأجيال يصبح ممكناً^4،5. مثل هذه الأوقات المراقبة طويلة تسمح بالكشف عن السلوكيات خلية طويل الأجل أو نادرة وإلا لا يمكن الكشف عنها. أخيرا، سيتم تكوين المتوسطة التي يمكن تغيير التدفقات من خلال الجهاز في السماح للخلايا التي سيحتفل بها كما أنها تستجيب لبداية الإجهاد أو مقدمة أو إزالة مجمع خاص.

وقد يتمتع ميكروفلويديكس بالفعل عدد من التطبيقات الهامة. على سبيل المثال، قد استخدمت في الأنسجة أو الجهاز، أو أجهزة الجسم على رقاقة، التي أنواع متعددة من الخلايا البشرية شارك مثقف لمحاكاة في فيفو شرط⁶؛ لدراسة حركة السلكية في بيئات ميكروستروكتوريد⁷؛ لدراسة التفاعلات بين الأغشية الحيوية البكتيرية (مثلاً، ⁸)؛ و للتغليف والتلاعب بكميات صغيرة من المواد الكيميائية (مثل، ⁹) أو الخلايا. أجهزة موائع جزيئية أصبحت شعبية متزايدة في مجال علم الأحياء الدقيقة (لملاحظات ممتازة، انظر ¹⁰ و ¹¹)، لا سيما وأن سلامتهم البدنية وخصائص تدفق جيدا المتطابقة إلى منافذ الميكروبية الطبيعية¹². على سبيل المثال، ميكروفلويديكس قد تم مؤخرا يستخدمها الأطباء لمثل هذه الأغراض كقياس دقة الخلية النمو وشعبة^13،،من¹⁴¹⁵، تحليل حركة الممرض¹⁶، رصد الاستشعار عن النصاب القانوني¹⁷ و¹⁸من التحولات الفيزيولوجية، والعد للبروتين،¹⁹من بين العديد من الأمثلة الأخرى. الطريقة المعروضة هنا مصممة خصيصا لتحليل الأنساب الخلية البكتيرية الواحدة بدلاً من مجموعات من السلالات أو الأنواع. يستخدم الجهاز موائع جزيئية أثبت هنا تباين واحد "آلة الأم" تصميم⁴، التي تزرع الخلايا أحادية الملف داخل خندق موائع جزيئية مع نهاية مغلقة واحدة وواحدة من نهاية مفتوحة؛ نمو الخلايا وشعبة يدفع الخلايا ذرية من النهاية المفتوحة ويصل إلى تدفق السائل. تحليلاتنا عادة التركيز فقط على الخلية "الأم" التي تقتصر في نهاية مغلقة الخندق. أننا نعتبر هذا الأسلوب النهوض على السابقة الخفيفة على أساس الفحص المجهري خلية واحدة التقنيات التحليلية، مثل تجميد خلية على منصات [اغروس]. بينما نجحت (ب) يستخدم كنموذج هنا، الأسلوب الذي ينطبق أيضا على سائر الأنواع البكتيرية (الإشريكيّة القولونية نموذج مشترك آخر؛ وقد تتطلب بعض الأنواع ذات أحجام مختلفة من الخلية أو مورفولوجيس تصنيع الأجهزة الجديدة مع أبعاد مختلفة). يتطلب استخدام الصحفيين الفلورسنت لتمييز الخلايا وتصور التغييرات في التعبير الجيني استخدام الأنواع وراثيا أصعب؛ تحليلات لنمو الخلايا ومورفولوجيا غير ممكنة حتى بدون علامات مضيئة.

ويستبعد هذا البروتوكول عملية اختﻻق سيد السليكون التصويرية، التي كانت توصف على نطاق واسع في أماكن أخرى باستخدام⁵؛ يمكن أيضا أن تكون درجة الماجستير بسهولة الاستعانة بمصادر خارجية من مرافق ميكروفابريكيشن. ويشمل صب جهاز PDMS من سليكون المقوى ماجستير؛ ارتباط الجهاز بقطعة من الزجاج غطاء؛ تجميع موائع جزيئية مدخل ومخرج السباكة والصمامات قرصه بما في ذلك السماح بتبديل المتوسطة؛ تخميل الجهاز وإعداد الخلايا البكتيرية، وتحميل الجهاز مع الخلايا البكتيرية؛ إرفاق السباكة للجهاز واكويليبراتينج الخلايا؛ وتحميل الجهاز على مجهر الأسفار للتصوير. نظراً لأن العديد من الصور المختلفة اكتساب ومعالجة البرمجيات أدوات يمكن استخدامها لوضع تصور وتحليل البيانات المختلفة لمصلحة^4،5، يتم عرض الصور مثلاً، ولكن لا يتم تضمين أساليب التقاط الصور في هذا البروتوكول.

Protocol

1-PDMS جهاز الصب

1. في بيئة خالية من الغبار، مزيج البوليمر PDMS وعامل التجفيف بنسبة 10:1 وديغا تحت الفراغ لمدة 10 دقيقة على الأقل.
2. ضع سيد سليكون (أو نسخة متماثلة الإيبوكسي أو البولي يوريثان منه) على قطعة من رقائق الألومنيوم دون انقطاع في طبق بتري البوليستيرين. صب خليط PDMS ديجاسيد على سيد بعمق من حوالي 5 مم. ديغا لوحة بيتري لمالا يقل عن 10 دقيقة استخدام دفق الهواء لكسر الفقاعات السطحية لطيف.
   ملاحظة: أبعاد الجهاز مستويين تستخدم ترد في المرفق به ملف CAD⁵ (انظر 1 ملف تكميلي). سيد النسخة متماثلة بلاستيك قد تعدت جزئيا خلال ولﻵﻻت؛ في حالة حدوث ذلك، دفع أسفل النسخة المتماثلة مع قضيب بلاستيك نظيفة.
3. علاج PDMS على الأقل 1 ح في فرن عند 60 درجة مئوية وباردة بدرجة حرارة الغرفة. إزالة رقائق الألومنيوم التي تحتوي على PDMS الرئيسي وشفي من لوحة بيتري. تقشر بعناية رقائق الألومنيوم من الجزء الخلفي من الشريحة الرئيسية، ثم بعناية قشر PDMS من الشريحة الرئيسية.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، PDMS قد يمكن علاجه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. الهشاشة النسبية للماجستير رقاقة السيليكون قد يمكن التغلب عليها باستخدام لاصق الإيبوكسي للسندات بشكل دائم يفر إلى 1/16 بوصة-القرص الألومنيوم سميكة من نفس الحجم ويفر.
4. كما رقاقة تتضمن عادة عدة أجهزة موائع جزيئية مع أبعاد مختلفة بعض الشيء (انظر 1 ملف التكميلية)، قطع جهاز واحد حجم استخدام مشرط نظيفة وحادة.
   ملاحظة: لروتين العمل نجحت باء ، استخدام الأجهزة مع الخنادق 1.0 ميكرومتر-على مستوى الخلية، التي تم وضع علامة مع C أو F في ملف CAD المصاحبة.

2-الجهاز اللكم والترابط

1. الشريط مكان قطعة من مكتب شفافة (انظر الجدول للمواد) على جانب الجهاز لتسليط الضوء على ميزات منقوشة منقوشة. يتم تحديد مداخل ومخارج المنافذ كمناطق دائرية على طرفي نقيض من القنوات فلويديك مرئية (الشكل 1). لتحسين ظهورها عند اللكم الثقوب في الجهاز لدبابيس مدخل ومخرج، علامة على مداخل ومنافذ مع النقاط باستخدام علامة غرامة ذات الرؤوس.
   ملاحظة: لضمان أن دبابيس مدخل ومخرج ليست مزدحمة، كل قناة أخرى هي لكمات، بدءاً بالقناة تحت الرمز الدلالي الأبجدي للجهاز فقط.
2. قلب الجهاز PDMS حيث أن الجانب منقوشة باستمرار، ولكمه من خلال الجهاز للنقاط ملحوظة استخدام لكمه خزعة 0.75 مم؛ تجاهل اللكم.
   ملاحظة: يتم لكمات الأجهزة مع الجانب منقوشة إلى أسفل لأن الحفرة التي تم إنشاؤها بواسطة لكمه خزعة يتم عادة حرقه قليلاً حيث يدخل لكمه البوليمر. اللكم الجهاز في اتجاه معكوس يضمن أن حفرة على الجانب منقوشة لها حدود حادة.
3. استخدام ستيريوميكروسكوبي، ضمان أن الثقوب لكمات تتداخل مع مجالات مدخل ومخرج للجهاز. استخدام الملقط غرامة ذات الرؤوس لإزالة أي أجزاء غريبة من PDMS من الثقوب لكمه.
4. استخدم شريط لاصق لإزالة الغبار من كلا الجانبين بالجهاز ومكان في طبق بتري البوليستيرين نظيفة. إعداد زجاج غطاء 22 ملم × 40 ملم بالتبول مع 100 ٪ كحول الأيزوبروبيل وفرك مع مسح تنظيم؛ الجافة مع تيار الهواء خالية من الغبار أو النيتروجين.
5. ضع الجانب ميزة الجهاز PDMS لكمات حتى جنبا إلى جنب مع الزجاج غطاء تنظيفها في بلازما أكسجين أنظف.
   1. بلازما-علاج الجهاز بالإعدادات التالية: الفراغ، متور 70؛ O ضغط₂ ، متور 200؛ مدة 15 ثانية؛ الطاقة، 30 جورج فورا بعد انتهاء فترة العلاج البلازما، إزالة الجهاز والزجاج غطاء من البلازما أنظف.
   2. عكس PDMS ووضعه في وسط الزجاج غطاء حيث أن اتصالات الجانب منقوشة على الزجاج؛ تأكد من محاذاة قنوات التغذية (تشغيل بين مجالات مدخل ومخرج) مع المحور طويلة من الزجاج غطاء. اضغط لأسفل بلطف جداً التأكد من أن الأختام PDMS ضد الزجاج.
6. خبز الجهاز المجتمعون في فرن على الأقل 1 ح عند 60 درجة مئوية. بعد الخبز، التحقق يدوياً من أن PDMS هو الرهينة للزجاج بواسطة تضغط بلطف على زاوية واحدة من الجهاز.
   ملاحظة: حالما المستعبدين من الجهاز، أنه ينبغي استخدام خلال 24 ساعة، كما ستصبح البوليمر مسعور يتزايد مع تزايد الوقت بعد المعالجة بالبلازما.

3-إعداد السباكة موائع جزيئية

1. قطع أطوال من البوليمر الأنابيب (القطر الداخلي (ID) 0.02 بوصة، القطر الخارجي (OD) 0.06 بوصة) لأطوال مناسبة للوصول إلى من مضخة الحقن إلى جهاز التبديل (إذا استخدمت) والجهاز عندما شنت على المجهر. قطع العديد من أطوال كما توجد ممرات موائع جزيئية.
2. تجميع الوصلات Y للصمامات قرصه (في حالة استخدام) بقطع وربط أطوال 2-سم سيليكون مرنة أنابيب (معرف 0.03 بوصة بوصة 0.065 OD) إلى انتقادات لاذعة العلوي "y" وأطوال 1 سم من أنابيب سيليكون بشوكة أسفل "y".
3. قطع أطوال 10 سم (أو مناسباً) من أنابيب البوليمر؛ قم بتوصيلها في نهاية واحدة لتقاطع التبديل عن طريق إدراج لهم في قطاعات أنابيب سيليكون 1 سم على شوكة أسفل "y". قم بتوصيلها في النهاية الأخرى للابر ز 21 التي تم إزالتها من محولات المحاقن البلاستيكية وبنت حوالي 90 ° حوالي 9 مم من نهاية الإبرة.
4. قم بتوصيل الإبر فجة ز 21 نهاية أحد أجزاء الأنابيب التي سيتم تشغيلها من المحاقن إلى جهاز تبديل بإدخال الإبر في الأنبوب. إدراج الغايات الأخرى لكل طول الأنابيب في قطاعات أنابيب سيليكون على انتقادات لاذعة مدخل من الوصلات Y.
   ملاحظة: استخدم نوعا من جهاز لعقد الصمامات قرصه وتقاطعات في المكان؛ ويمكن إجراء ذلك بسهولة من مربع تلميح ميكروبيبيتي (الشكل 2D).
5. قطع أطوال أنابيب البوليمر حمل النفايات من منفذ الجهاز إلى كوب نفايات. قم بتوصيلها في نهاية واحدة لبنت إبر ز 21 إعداد كما هو موضح أعلاه. الشريط على الطرف الآخر من الأنابيب داخل دورق نفايات.
6. إعداد وحدات التخزين المناسبة للوسائط التي تحتوي على 0.1 مغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA) وشغل بالحجم المطلوب وعدد الحقن. الاتصال المحاقن محملة بجيش صرب البوسنة بالإبر ز 21 استعداد تعلق للمحاقن الأنابيب وتحميل مدخل إلى مضخات الحقن.
   ملاحظة: لنموذجي التجارب تستخدم 5 قنوات للجهاز، كل مع حقنه 20 مل. تجربة التي حولت المتوسطة سيتطلب المصارف 2 من كل 5 المحاقن. هنا، المضخة التي تحتوي على أول بنك يشار مضخة المرحلة 1، ومضخة تحتوي على المصرف الثاني، مع المتوسط بعد رمز التبديل، يشار إلى ضخ المرحلة 2.
7. إزالة الهواء من مدخل السباكة عن طريق تشغيل المضخات حقنه بمعدل تدفق عالية (> 500 ميليلتر/دقيقة)، بدءاً بتوجيه مضخات الحقن عمودياً والتنصت على الحقن إحضار فقاعات الهواء إلى الأعلى. مرة واحدة وقد تم إزالة الهواء من الحقن، ضع المضخة حقنه أفقياً وتدريجيا اضغط أو نفض الغبار خطوط البوليمر من المحاقن تصل عن طريق جهاز التبديل إزاحة وإزالة فقاعات الهواء. كرر هذه العملية للمصرف الثاني من المحاقن (في حالة تبديل وسائط الإعلام).
8. بعد أن تم إزالة فقاعات الهواء، تعيين مضخة الحقن المرحلة 2 (أي، مع المتوسط التي سيتم استخدامها الثانية، بعد رمز التبديل) إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة، ثم توقف التدفق. ضع مقاطع صغيرة الموثق على شرائح أنابيب مرنة في فرع الوصلات Y المناظرة للمرحلة المتوسطة الثانية. الاستمرار في تشغيل المضخة المرحلة-1 حقنه بمعدل تدفق متواضعة (مثلاً، 10 ميليلتر/دقيقة) عن 30 دقيقة على الأقل لتطهير المتوسطة الثانية من أنابيب مدخل المصب من تقاطع Y.

4-خلية ثقافة إعداد

1. ينمو بريكولتوري من سلالة الفائدة في الأجل المتوسط المطلوب بين عشية وضحاها، إلى مرحلة ثابتة. يجب أن يحتوي على السلالة البكتيرية طفرة يجعل الخلايا غير متحركة، حيث أن الخلايا لا تسبح خارج قنوات الجهاز.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، السلالة البكتيرية هي نجحت 3610 المحتوية على الحاج_A233V استبدال (أسباب هذه الطفرة السوط لتكون مباشرة بدلاً من حركية الخلية حلزونية، ومنع)، ف_رسبف-منيونجرين مراسل للإجهاد في الخلية، وتأسيسي ف_{هايبرسبانك}-منيبتوني (أحمر) مراسل تمييز الخلايا. ويستخدم رطل لينوكس المتوسطة في البروتوكول المثال. سلالات نموذجية للتجارب ميكروفلويديكس تحتوي على الصحفيين النسخي فلوري واحد أو أكثر وبروتين فلوري المنتجة مؤثرا، هيولى لتسهيل الكشف الآلي للخلايا. عيوب النمو لم تراع عندما تستخدم لينوكس رطل المتوسطة الغنية، ولكن قد تحول دون النمو ب-نجحت في الحد الأدنى من وسائل الإعلام في ظروف موائع جزيئية لأن يفرز siderophores جرفت بالتدفق في المتوسط. وفي ظل هذه الظروف، قد تكون استعادة النمو بإضافة سترات الصوديوم وكلوريد الحديد إلى المتوسط، كما ذكرت S7₅₀ متوسطة¹¹.
2. صباح اليوم للتجربة، تمييع الخلايا نجحت 01:50 في قارورة 250 مل حيرة التي تحتوي على 25 مل متوسط النمو. تنمو الخلايا ح 5-6 في تهز الثقافة في 37 درجة مئوية كثافة بصرية من أكبر من 1.
   ملاحظة: ثقافة خلية كثيفة الأفضل لأن الخلايا الثابتة-المرحلة باء-نجحت هي أصغر حجماً وأقل الخلايا غالباً ما توجد في سلاسل، وتيسير تحميل الجهاز. الأنواع البكتيرية المختلفة قد تتطلب الشروط المتوسطة أو النمو الأخرى للتحميل الأمثل.
3. استخدام المحاقن مزودة بمرشح حجم مسام 5-ميكرومتر، تصفية حوالي 15 مل ثقافة الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل لإزالة سلاسل خلية نجحت (أنه من غير الضروري كولاي وقد لا يكون ضروريا مع الأنواع الأخرى).
   ملاحظة: يجب إزالة الخلايا قليلة نسبيا؛ ينبغي أن يكون فيلتراتي عكر.
4. الطرد المركزي ثقافة المصفاة لمدة 10 دقيقة في 4,000 س ز في درجة حرارة الغرفة. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في السائل طاف المتبقية المتبقية في الأنبوب، مضيفاً ما يقارب 500 ميليلتر من متوسطة جديدة إذا لزم الأمر لتسهيل بيبيتينج تعليق خلية.

5-جهاز التحميل

1. بلطف ضع فارغة ميكروبيبيتي هلام-تحميل رقيقة ونصائح (انظر الجدول للمواد) في الثقوب منفذ الجهاز موائع جزيئية.
2. استخدام رقيقة هلام-تحميل نصائح مع ميكروبيبيتي P200، تخميل الجهاز عن طريق حقن المتوسطة التي تحتوي على 1 ملغ/مل جيش صرب البوسنة في الثقوب مدخل، التقيد بالنصائح في الثقوب منفذاً لرصد ملء القنوات موائع جزيئية (الشكل 2A). احتضان الجهاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبا.
   ملاحظة: يستخدم جيش صرب البوسنة عادة كحجب أو التخميل عامل التي سوف تربط إلى السطح مسعور من البوليمر PDMS، زيادة في هيدروفيليسيتي والحد من الربط من البروتينات الأخرى أو خلايا (عن طريق خلية الجزيئات السطحية).
3. استخدام رقيقة هلام-تحميل نصائح، تحميل كل قناة مع الخلايا ريسوسبينديد (من القسم 4)، استخدام التلميحات في القناة منفذاً لرصد التقدم المحرز في الخلايا عن طريق الجهاز (الشكل 2).
   ملاحظة: تحميل تيسر إعداد ميكروبيبيتي P200 إلى حجمه الأقصى 200-ميليلتر وثم يسفط وسادة هواء قبل يسفط كمية صغيرة (حوالي نصف حجم المقطع رقيقة من طرف ماصة) من الخلايا. لا يلزم حجم الخلايا حراكه دقيقة، حسب حجم الجهاز PDMS صغيرة بالنسبة إلى ميكروبيبيتي. نحن نعرف من لا الحد الأعلى لكثافة الخلايا ريسوسبينديد، ما دام يمكن بيبيتيد تعليق خلية في الجهاز. كتل الخلايا يمكن أن تسد الجهاز وينبغي تجنب بيبيتينج شامل و/أو خلط دوامة.
4. إزالة بلطف نصائح تحميل لجل من ثقوب المآخذ، عمل واحدة في كل مرة لمنع الأضرار بالجهاز.
5. الطرد المركزي الجهاز في ميكروسينتريفوجي أعلى هيئة في محول دوار مناسبة على 6,000 تقريبا x ز لمدة 10 دقائق (الشكل 2).
   ملاحظة: تم استخدام محول دوار ألومنيوم آلة مخصصة تم تصميمها لتناسب في دوار ميكروسينتريفوجي (الشكل 2)؛ ويمكن استخدام نماذج مختلفة للطرد المركزي مع محولات الدوار المناسبة. ميزة هامة من المحول أنه يوفر القوة الجانبية في اتجاه نهايات مغلقة الخنادق الخلية، مما اضطر الخلايا في القنوات الجانبية.
6. تحقق من تحميل ناجحة تحت المجهر (الشكل 3) ولكن دون تحديد الجهاز إلى الشريحة حامل/المرحلة إدراج.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، 60 س، يستخدم الهدف النفط-الغمر Ph3 نا 1.4 للتحقق في هذه المرحلة وتصوير اللاحقة.

6-جهاز الجمعية، والموازنة، وتصاعد

1. جبل الجهاز المحمل على إدراج مرحلة بعناية قبل تسجيل زجاج الغطاء على جانبي PDMS إلى الجزء السفلي من إدراج مرحلة (أيعكس إدراج مرحلة قبل إرفاق الجهاز). عكس الجمعية إدراج جهاز المرحلة ذلك PDMS هو مواجهة ومكان على سطح لينة، مثل مسح خالية من الغبار (الشكل 2D).
2. ضبط معدل تدفق المضخة حقنه المرحلة 1 إلى 35 ميليلتر/دقيقة تعمل مع حارة واحدة في وقت واحد، إدراج مدخل الإبرة ثم الإبرة منفذاً (أيتشغيل للكأس النفايات؛ الشكل 2E).
3. مسح بعيداً من أي وسيط الزائدة مع مسح نظيفة خالية من الغبار وبصريا فحص الجهاز بحثاً عن الثقوب. فحص الأنابيب منفذ لمظهر الخلايا الزائدة (عادة ما تظهر كمجموعة شريطية عكر) وغضروف المتوسطة، التي سوف تتحرك ببطء نحو الكأس النفايات.
4. السماح للجهاز بتشغيل في الدقيقة 35 ميليلتر لحوالي 15-30 دقيقة، حتى أن جميع الممرات المتصلة هي تصب في الكأس النفايات.
5. تعيين مضخة الحقن المرحلة 1 إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة وتوقف التدفق. إحضار جهاز المضخة وجهاز كامل بالمجهر (هو مساعدة هذه العملية بوضعه على عربة متداول)، وإعادة تشغيل المرحلة-1 جبل تدفق المتوسط في 1.5 ميليلتر/دقيقة بعناية إدراج مرحلة مع الجهاز إلى مجهر مقلوب الأسفار، باستخدام الشريط عند الضرورة لتوجيه مدخل ومخرج الأنابيب.
6. تحديد المواقف المطلوبة على الجهاز للتصوير والبدء في التصوير كما هو مطلوب. ملاحظة أن الخلايا عادة ما تتطلب بضع ساعات (ما يقارب 10 الأجيال) للوصول إلى حالة مستقرة الأسى مرحلة النمو، وقد يتأخر بدء الحصول على الصور كالمطلوب حيث أن التصوير يبدأ بعد فترة الموازنة.
   ملاحظة: نمو الخلايا في المرحلة الأسية حالة ثابتة ينبغي التحقق من خلال تحليل الصور اللاحقة بتعقب مرات انقسام الخلية وضمان أنهم توصلوا إلى قيمة الحد أدنى ثابتة.

7-التبديل بين متوسطة

1. بين جولات متعاقبة من التصوير، توقف تدفق مضخة الحقن المرحلة 1. Unclip بعناية مقاطع الموثق من السيليكون المرحلة 2 الأنابيب، ونقل بعضها إلى أنابيب سيليكون في فرع المرحلة 1 من تقاطع Y. الأمم المتحدة--توقف تدفق المرحلة الثانية المحاقن مضخة (الذي تم تعيينه إلى 1.5 ميليلتر/دقيقة في الخطوة 3، 8) ومواصلة التصوير.
   ملاحظة: عند 1.5 ميكرومتر/دقيقة بطول 10 سم من أنابيب البوليمر المصب من الوصلات Y، يصل المتوسط المرحلة الثانية إلى الجهاز في حوالي 50 دقيقة. يمكن اختبار الوقت للجهاز تجريبيا باستخدام الوسائط التي تحتوي على جزيئات الراسم الفلورسنت.

النتائج

تعتبر الخلية الأولى الناجحة تحميل، حسب تقييم التباين مرحلة الفحص المجهري قبل إرفاق السباكة موائع جزيئية للجهاز، ككل أو ما يقرب من جميع القنوات الجانبية موائع جزيئية تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا البكتيرية ( الشكل 3A). تحميل الأمثل سوف تظهر عدة خلايا في...

Discussion

هذا البروتوكول ميكروفلويديكس يتسم بالمرونة في ذلك العديد من الخطوات التي يمكن تعديلها لتحسين استخدامها مع نوع معين أو سلالة أو لغرض محدد. وفي الواقع، في هذا البروتوكول قمنا بتعديلات على مفهوم "آلة الأم" الأصلي⁴ لتحسين استخدامها مع باء-نجحت. وغالباً ما تشكل الخنادق التي ت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	(240)4019862	This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06"	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD	HelixMark Standard Silicone Tubing	60-795-05	For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G	Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200)	Molecular BioProducts	2155	For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane	Pall Life Sciences	4560	For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1"	McMaster-Carr	75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene	Nordson Medical	Y210-6005	The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon		This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven	VWR	414005-106	for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width	3M		to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	To clean cover glass
Syring pump, 6 channel	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	a brand of dust-free wipes