Анализ одной ячейки Microfluidic Сенная палочка

Мы представляем метод для анализа microfluidic индивидуальных бактериальных клеток линий с помощью Сенная палочка в качестве примера. Этот метод преодолевает недостатки традиционных аналитических методов в микробиологии, позволяя наблюдения сотни поколений клеток в условиях роста плотно контролируемым и единообразной.

Аннотация

Microfluidic технология преодолевает многие ограничения традиционных аналитических методов в микробиологии. В отличие от методов массовой культуры он предлагает резолюции одноклеточных и длительного наблюдения раз охватывающих сотни поколений; в отличие от агарозы микроскопии основанные на площадку он имеет условия форма роста, которые могут быть жестко контролируется. Потому что непрерывный поток роста средних изолирует клетки в microfluidic устройство от непредсказуемых колебаний в местной химической среде, вызванных рост клеток и метаболизм, подлинные изменения в экспрессии генов и рост клеток в ответ на конкретные стимулы могут наблюдаться более уверенно. Сенная палочка используется здесь как модель бактериального вида продемонстрировать машину «мать»-метод для клеточного анализа типа. Мы покажем, как построить и отвес microfluidic устройства, загрузить его с клетками, инициировать микроскопических изображений и разоблачить клетки на раздражитель путем переключения от одного роста среднего в другой. Стресс отзывчивым репортер используется в качестве примера для выявления типа данных, которые могут быть получены этим методом. Мы также кратко обсудить применение этого метода для другие виды экспериментов, например анализ Бактериальное заспорение.

Введение

Одна из самых ярких особенностей жизни на земле является его большой устойчивостью и разнообразие. Центральная цель молекулярной биологии — понять логику, в которой клетки используют генов и белков для максимизации их роста и фитнес под широкий спектр условий окружающей среды. Для достижения этой цели, ученые должны уметь уверенно наблюдать как отдельные клетки растут, разделить и выразить свои гены под заданный набор условий, отметив, как клетки отвечают на последующие изменения в их среде. Однако традиционные аналитических методов в микробиологии имеют технические ограничения, которые влияют на типы вопросов, которые могут быть решены. К примеру массовых анализов на основе культуры были весьма полезны с годами, но они предлагают только уровень населения данные, которые могут маскировать значимых в ячейке вариации или поведения меньше суб популяции клеток в общей численности населения. Одноклеточных анализ живых бактерий, основанные на световой микроскопии раскрыть поведение одной ячейки, но также технически ограничены. Бактерии обычно иммобилизованных на агарозы колодки, содержащие среднего роста, но мобильный рост и деление толпы микроскопические видом и истощает имеющиеся питательных веществ после нескольких циклов клеток, существенно ограничивая время наблюдения¹^, ². Кроме того местные истощение питательных веществ и сопутствующей накопление метаболических побочных продуктов из-за роста клеток, постоянно меняется окружающей среды рост местной ячейки способами, которые трудно измерить или предсказать. Такие экологические изменения, используя агарозы колодки представляют собой вызов для исследования поведения стационарном или клеточных реакций на конкретные изменения в условиях роста³.

Microfluidic технология, в которой жидкой среде постоянно текла через microfabricated устройства, предлагает решение для классических экспериментальных ограничений. Microfluidic устройство может держать отдельные ячейки в положении для микроскопии клеток, в то время как поток среднего роста постоянно обеспечивает клетки с свежих питательных веществ и смывает метаболических побочных продуктов и избыток клетки, создавая тем самым весьма форма роста окружающей среды. В условиях постоянного роста поведение клеток может наблюдаться в отрыве от влияния экологических факторов, позволяющих беспрепятственный вид внутренней логики клеток. Как потока жидкости microfluidic устройство предотвращает становится переполненном с клетками, наблюдение за одну ячейку линий для десятки или сотни поколений становится возможным⁴^,⁵. Такие длинные наблюдения раз разрешить обнаружение иначе обнаружить долгосрочный или редкие клеток поведения. И наконец состав среды, которая протекает через устройства могут быть изменены на будет, позволяя клетки, чтобы наблюдать, как они реагируют к возникновению стресса или введения или удаления конкретного соединения.

Микрофлюидика уже пользуется ряд важных приложений. Например он был использован в ткани, орган или орган на чипе устройств, в которых различные типы клеток человека совместно культивируемых для имитации в естественных условиях состояние⁶; для изучения движения нематод в microstructured средах⁷; для изучения взаимодействия между бактериальных биопленок (например, ⁸); и для инкапсуляции и манипуляции крошечные количества клеток или химических веществ (например, ⁹). Microfluidic приборы также становятся все более популярными в области микробиологии (для отличные отзывы, см. ¹⁰ и ¹¹), особенно в их физической и реологические свойства хорошо соответствует¹²природных микробных ниш. К примеру микрофлюидика недавно работал, микробиологов для таких целей, как точно измеряя клеток рост и деление¹³^,¹⁴^,¹⁵, анализируя возбудителя движения¹⁶, мониторинг кворума зондирования¹⁷ и¹⁸физиологических переходы и для белка подсчета¹⁹, среди многих других примеров. Представленные здесь метод разработан специально для анализа линий одного бактериальной клетки, вместо того, чтобы комбинации штаммов или видов. Microfluidic устройство, продемонстрировали здесь использует один из вариантов «мать машина» Дизайн⁴, в котором клетки выращивают одного файла в окопе microfluidic с одним закрытым концом и один открытый конец; деление и рост клеток толкает потомства клетки и из открытого конца в поток жидкости. Наш анализ обычно сосредоточиться только на ячейку «мать», которая ограничивается на закрытом конце траншеи. Мы рассматриваем этот метод как выдвижение более предыдущих света на основе микроскопии одноклеточных аналитических методов, таких как иммобилизация клеток на агарозы колодки. Хотя B. subtilis используется в качестве модели здесь, метод применим также для других видов бактериальных (кишечная палочка -это еще одна распространенная модель; некоторые виды размеров различных ячеек или морфологии потребуется изготовление новых устройств с различными размерами). Использование флуоресцентных репортеров в ознаменование клетки и визуализировать изменения в экспрессии генов требует использования генетически шансов справиться с возникающими видов; Однако анализ роста клеток и морфология возможны даже без флуоресцентных маркеров.

Настоящий Протокол исключает процесс изготовления кремниевых мастер, с помощью фотолитографии, которая была подробно описана в других⁵; мастера также может быть легко аутсорсинг от микротехнологий зал. Она включает в себя формования PDMS устройства из армированного кремния мастер; Склеивание устройства на кусок стекла; Сборка microfluidic входе и выходе сантехники, включая щепотку клапанов разрешить средний коммутации; пассивация устройства, подготовке бактериальной клетки и загрузки устройства с бактериальной клетки; установка сантехники на устройство и equilibrating клетки; и загрузка устройства на микроскопом флуоресценции для воображения. Потому что многие приобретения различных изображений и обработки программного обеспечения, инструменты можно использовать для визуализации и анализа данных интерес⁴^,⁵, пример изображения отображаются, но методы захвата изображения не включаются в этот протокол.

протокол

1. PDMS устройство литья

В среде, свободной от пыли смешать PDMS полимера и отвердителя в соотношении 10:1 и Дега под вакуумом для по крайней мере 10 мин.
Поместите образец кремния (или эпоксидные и полиуретановые реплики) на кусок непрерывной алюминиевой фольги в полистирольные плиты Петри. Залейте дегазацию PDMS смесь мастер на глубину от примерно 5 мм. Дега Петри пластина для по крайней мере 10 минут использования нежный поток воздуха, чтобы сломать поверхности пузырьков.
Примечание: Размеры используемого устройства двухуровневой предоставляются в сопровождении CAD файла⁵ (см. дополнительный файл 1). Мастер пластиковые реплики может частично плавать во время дегазации; Если это произойдет, нажмите вниз реплики с чистый пластиковый аппликатор.
Вылечить PDMS по крайней мере 1 часа в духовке при температуре 60 ° C и остыть до комнатной температуры. Удаление алюминиевой фольги, содержащий Мастер и вылечить PDMS от пластины и Петри. Осторожно отделите алюминиевой фольги из задней части мастера, затем тщательно чистить PDMS от мастера.
Примечание: в качестве альтернативы, PDMS может быть излечен на ночь при комнатной температуре. Относительная уязвимость мастер кремниевой пластины могут быть преодолены с помощью эпоксидный клей окончательно облигаций пластин в 1/16 дюйма-алюминия толщиной диск такого же размера, как пластины.
Как пластины обычно включает в себя несколько microfluidic приборы с немного различных размеров (см. дополнительный файл 1), отрезать одно устройство размером с помощью чистой, острый скальпель.
Примечание: Для рутинной работы B. subtilis , используйте устройства с 1.0-мкм ширины ячейки траншеи, которые помечены с помощью C или F в сопутствующем файле CAD.

2. устройство перфорации и склеивание

Место кусок полупрозрачного управления ленты (см. Таблицу материалы) над рисунком стороне устройства для повышения видимости функции рисунком. Входные и выходные порты определяются как круговой области на противоположных концах видимой аэрогидродинамических каналов (рис. 1). Для улучшения их видимости при пробивки отверстий в устройства на входе и выходе булавки, Марк впуски и выпуски с точками с помощью острым концом маркера.
Примечание: Для обеспечения что впускных и выпускных булавки не переполнены, каждый канал пробита, начиная с каналом под Алфавитный указатель для устройства.
Флип PDMS устройство так что узорной сторона вниз и пробить устройства отмеченные точки с помощью биопсии 0,75 мм удар; отказаться от штамповки.
Примечание: Устройства являются кулаками с узорной стороной вниз, потому что отверстие, порожденных биопсии удар обычно слегка расклешенные где удар входит полимер. Пробивая устройства в Перевернутый ориентации гарантирует, что отверстие на стороне узорной имеет острые границы.
С помощью стереомикроскопом, убедитесь, что перфорированные отверстия совпадают с областями входного и выходного устройства. Использование штраф наконечником пинцеты для удаления любых посторонних фрагменты PDMS из перфорированных отверстий.
Используйте клейкую ленту для удаления пыли с обеих сторон устройства и место в чистой пенополистирольные плиты Петри. Подготовка стекла Обложка 22 x 40 мм смачивания с 100% изопропиловый спирт и трения салфеткой чистых помещений; сухие с потоком пыли воздуха или азота.
Поместите кулаками PDMS устройства функция стороной вверх вместе с очищаемой покровным стеклом в плазме кислород чище.
1. Плазма лечить устройства со следующими параметрами: вакуум, 70 mTorr; O₂ давление, 200 mTorr; продолжительность, 15 s; мощность, 30 Вт сразу же по окончании периода лечения плазмы, удалите устройство и крышка стекла из плазмы чище.
2. Инвертировать PDMS и поместите его на центр крышки стекла, так что узорной сторона контактов стекла; Убедитесь, что кормления каналов (бег между входным и выходным) выровнены с длинной оси покровным стеклом. Нажмите вниз очень осторожно, для обеспечения того, чтобы PDMS уплотнения против стекла.
Выпекать собрал устройство в духовке для по крайней мере 1 час при температуре 60 ° C. После выпечки, вручную проверьте, что PDMS наклеивания на стекло, осторожно нажав на одном углу устройства.
Примечание: После того, как устройство тычковой, его следует использовать в течение 24 часов, как полимер будет становиться все более гидрофобных с увеличением времени после плазменной обработки.

3. Microfluidic сантехника подготовка

Вырежьте длины полимерных труб (внутренний диаметр (ID) 0.02 дюймов, внешнего диаметра (OD) 0,06 дюйма) для соответствующей длины, чтобы добраться из шприцевый насос переключения аппарата (если используется) и устройства при монтаже на микроскопе. Вырежьте столько длины как есть microfluidic полос.
Соберите Y узлов для щепотку клапанов (при использовании), резки и присоединение 2-см длины гибкие Силиконовая трубка (0.03 дюймов ID, 0,065 дюйма OD) топ колкостями «Y» и 1-см длины Силиконовая трубка к нижней Барб «Y».
Вырезать 10 см (или необходимости) длины полимерных труб; Соедините их в один конец до перекрестка переключатель, вставив их в 1 см силиконовые трубки сегментов на нижней Барб «Y». Соедините их в другой конец иглы 21G, которые были удалены из их Пластиковый шприц адаптеров и Бент приблизительно 90 ° примерно 9 мм от конца иглы.
21G тупым иглы соединить один конец трубки сегментов, которые будут выполняться из шприцы для переключения аппарата путем вставки иглы в трубку. Вставьте другие концы каждой длины трубки силиконовые трубки сегментов на входе колкостями Y узлов.
Примечание: Используйте какой-то аппарат провести щепотку клапанов и развязок на месте; Это можно легко сделать из ящика наконечник микропипеткой (Рисунок 2D).
Вырежьте длины полимерных труб для перевозки отходов от розетки устройства для отходов стакан. Соедините их в один конец для изогнутой иглы 21G, подготовленных как описано выше. Лента на другой конец трубки в отходов стакан.
Подготовить соответствующие объемы средств массовой информации, содержащие 0,1 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и заполнить требуемый размер и количество шприцев. Соединить BSA-загружен шприцы подготовлены 21G иглы, прикрепленных к впускной трубы и нагрузки шприцы в шприц насосов.
Примечание: для типичных экспериментов используются 5 каналов устройства, каждый с 20 мл шприц. Эксперимент, в котором включено средство потребует 2 банки 5 шприцев. Здесь насос, содержащий первый банк называется фаза-1 насос, и насос, содержащий второй банк, с пост переключатель среднего, называется фаза-2 насоса.
Удалите воздух из входе сантехника, запустив шприц насосов на высокий расход потока (> 500 мкл/мин), начала ориентироваться насосы шприц вертикально и выстукивать шприцы довести пузырьков воздуха в верхней. После очистки воздуха от шприцы место шприцевый насос горизонтально и постепенно коснитесь или проведите линии полимеров от шприцы вверх через выключатель аппарат выбить и удалить пузырьки воздуха. Повторите этот процесс для второго банка шприцы (если переключение средств массовой информации).
После того, как удаляются пузырьки воздуха, установить фазы-2 шприцевый насос (т.е., со средой, которая будет использоваться второй, после переключения) до 1,5 мкл/мин, затем приостановить поток. Место небольшой зажимы на сегменты гибкие шланги на ветке Y узлов, соответствующий на втором этапе среднего. Продолжать работать фазы-1 шприцевый насос со скоростью скромный потока (например, 10 мкл/мин) для по крайней мере 30 минут, чтобы удалить второй средней из впускной трубы вниз по течению от перекрестка Y.

4. Подготовка клетки культуры

Растут preculture штамма интерес в требуемой среде на ночь, для неподвижной фазой. Бактериальный штамм должен содержать мутации, которая делает клетки неподвижным, так что клетки не плавать из каналов устройства.
Примечание: В настоящем Протоколе, бактериальный штамм является B. subtilis 3610 содержащий ведьма_A233V замещения (Эта мутация приводит жгутика прямо, чем винтовой, предотвращая клеток моторику), P_rsbV- mNeonGreen Репортер для клетки стресс и учредительных репортер P_hyperspank- mNeptune (красный) для выделения ячеек. LB Леннокс средних используется в протоколе пример. Типичный штаммов для экспериментов микрофлюидика содержат один или более флуоресцентные transcriptional репортеров и конститутивно производства, цитоплазматических флуоресцентный белок для облегчения автоматического обнаружения клеток. Рост дефекты были не наблюдаемые когда богатые среднего LB Леннокс был использован, но B. subtilis рост минимальной СМИ может тормозится microfluidic условиях, потому что выделяется siderophores вымываются, средний поток. При таких обстоятельствах рост может быть восстановлена путем добавления цитрат натрия и хлорида железа на носитель, как сообщалось на S7₅₀ средних¹¹.
В первой половине дня эксперимента, разбавляют клетки B. subtilis 1:50 в недоумение колбу 250 мл, содержащих 25 мл среднего роста. Рост клеток для 5-6 ч в тряску культуры при 37 ° C для оптической плотности более чем на 1.
Примечание: Плотной клеточной культуры предпочтительнее, потому что стационарной фазы B. subtilis клетки являются меньше и менее часто встречаются в ячейке цепи, облегчения загрузки устройства. Различных видов бактерий может потребовать других средних или роста условий для оптимальной загрузки.
С помощью шприца с фильтром поры 5 мкм, фильтр примерно 15 мл культуры клеток в 15 мл конические для удаления цепочки B. subtilis ячейки (это ненужным для е. coli и не может быть необходимым с другими видами).
Примечание: Относительно немногие клетки должны быть удалены; Фильтрат должно быть мутной.
Центрифуга для отфильтрованных культуры за 10 мин на 4000 x g при комнатной температуре. Слить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в остаточных супернатанта жидкости, оставшиеся в трубе, добавляя около 500 мкл свежей среды при необходимости для облегчения закупорить суспензию клеток.

5. устройство загрузки

Осторожно поместите пустой тонкой микропипеткой гель загрузки советы (см. Таблицу материалы) в розетке отверстия microfluidic устройства.
Используя тонкие гель загрузки советы с Р200 микропипеткой, пассивации устройства путем инъекций носитель содержит 1 мг/мл BSA в впускного отверстия, наблюдения за советы в выходе отверстия для контроля заполнения microfluidic каналов (рис. 2A). Инкубируйте устройства при комнатной температуре примерно 5 минут.
Примечание: BSA обычно используется как на блокирование или пассивации агент, который будет привязан к гидрофобной поверхности PDMS полимера, увеличивая его гидрофильность и уменьшая привязку других белков или клеток (через клетки поверхности молекулы).
Используя тонкие Советы гель загрузки, загрузите каждый канал с ресуспензированы клеток (раздел 4), используя советы в канале розетки для мониторинга хода клетки через устройство (рис. 2B).
Примечание: Загрузка облегчается, установив микропипеткой Р200 ее максимум 200 мкл тома и затем аспирационных воздушной подушке перед аспирационных небольшого количества клеток (примерно половина объема шлифов кончика пипетки). Объем ресуспензированы клеток не нужно быть точным, как объем PDMS устройства мал по сравнению с микропипеткой. Мы знаем, не верхний предел плотности ресуспензированы клеток, поскольку суспензию клеток может быть накапаны в устройство. Скопления клеток может засорить устройство и следует избегать тщательно закупорить и/или вихревого смешивания.
Аккуратно удалите советы гель загрузки из розетки отверстий, работает один момент для предотвращения повреждения устройства.
Центрифуга устройство настольное microcentrifuge в переходник соответствующей ротора на приблизительно 6000 x g 10 минут (рис. 2 c).
Примечание: Адаптер обычай обработанной алюминиевой ротор, который был разработан для вписываются в microcentrifuge ротора (рис. 2 c) был использован; различные центрифуги модели могут быть использованы с адаптерами соответствующих ротора. Важной особенностью адаптер является, что она обеспечивает боковое усилие в направлении закрытые концы траншеи клеток, тем самым заставляя клетки в боковые каналы.
Проверка успешной загрузки под микроскопом (рис. 3), но без проставления устройство на слайд держатель/этап вставки.
Примечание: В настоящем Протоколе, 60 X, 1.4 цель нефти погружение NA Ph3 используется для обоих проверки на данном этапе и для последующей обработки изображений.

6. устройство Ассамблея, уравновешивания и монтаж

Тщательно смонтировать загруженные устройства на стадии Вставка лентой покровным стеклом по обе стороны PDMS в нижней части стадии вставки (т.е., инвертировать вставить этап перед установкой устройства). Инвертировать Ассамблеи Вставка устройство этап, так что PDMS вверх и место на мягкую поверхность, например беспылевой очистки (Рисунок 2D).
Отрегулируйте скорость потока фазы-1 шприц насоса 35 мкл/мин работает с одной полосой движения в то время, вставьте входе иглой, а затем выход иглы (т.е., под управлением отходов стакан; Рисунок 2E).
Оботрите прочь любое превышение среднего салфеткой чистой пыли и Осмотрите прибор на предмет утечек. Изучите выходе трубы для появления избыточного клеток (обычно появляется как мутная полоса) и средних мениска, который будет медленно двигаться в сторону отходов стакан.
Разрешение устройства для запуска в 35 мкл/мин примерно 15-30 мин, до тех пор, пока все подключенные дорожки впадающих в отходов стакан.
Установите фазы-1 шприцевый насос 1,5 мкл/мин и приостановки потока. Весь аппарат насосом и устройством микроскопа (этот процесс помог, поместив его все на тележку подвижного) и возобновлению фазы-1 средний поток на 1,5 мкл/мин тщательно смонтировать сцену вставка с устройством на Перевернутый флуоресцентным микроскопом, используя лента, необходимые для маршрутизации на входе и выходе трубопровода.
Найдите нужное положение устройства для обработки изображений и начать изображений нужным. Обратите внимание, что клетки обычно требуется несколько часов (приблизительно 10 поколений), чтобы достичь устойчивого состояния экспоненциальной фазе роста, и начала захвата изображений может быть отложено, как желательно, чтобы изображения начинается после периода уравновешивания.
Примечание: Установившегося рост клеток в экспоненциальной фазе должны проверяться в ходе анализа последующих изображений путем отслеживания раз деление клеток и обеспечения того, что они достигли минимальное значение постоянного.

7. Средний переключения

Между раундов изображений приостановите поток фазы-1 шприцевой насос. Аккуратно отсоедините зажимы от фазы-2 силиконовые трубки, перемещение каждой Силиконовая трубка на стадии-1 филиал перекрестка Y. ООН приостановить поток фазы-2 шприца насоса (который был установлен до 1,5 мкл/мин на шаге 3.8) и продолжить изображений.
Примечание: В 1,5 мкм/мин с длиной 10 см полимерных труб вниз по течению Y развязок, второй этап среднего достигает устройства в приблизительно 50 мин. Время на устройстве могут быть проверены эмпирически, с использованием средств массовой информации, которые содержат частицы флуоресцентные трассирующими.

Результаты

Успешных первоначальных клеток, загрузки, как оцениваются фазово контрастной микроскопии перед присоединением microfluidic Сантехнические устройства, будут рассматриваться как имеющие все или почти все microfluidic боковые каналы, содержащие один или несколько бактериальных ?...

Обсуждение

Этот протокол микрофлюидика является гибким, что многие из шагов могут быть изменены для оптимизации ее использования с отдельных видов или деформации или для конкретной цели. Действительно в этом протоколе мы внесли изменения в оригинальной концепции «мать машина»⁴ для ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект финансировался национальных институтов здравоохранения под GM018568. Этот протокол был проведен в части в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Большое спасибо из-за Норман Томас и лорд Натан за их работу в зачатие и изготовления мастер шаблон, используемый для устройства, показанные здесь и в здании оригинальной версии аппарата. Мы также поблагодарить Johan Паулссон за его ценные совместные консультации и поблагодарить членов его лаборатории за их советы и дальнейшее совершенствование бактериальных microfluidic приборы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	(240)4019862	This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch	World Precision Instruments	504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass	VWR	48393 172
Plasma Etch PE-50	Plasma Etch Inc.	PE-50	Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06"	Saint-Gobain PPL Corp.	AAD04103	For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD	HelixMark Standard Silicone Tubing	60-795-05	For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G	Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200)	Molecular BioProducts	2155	For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane	Pall Life Sciences	4560	For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1"	McMaster-Carr	75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene	Nordson Medical	Y210-6005	The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope	Nikon		This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox	Sigma-Aldrich	L3022
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610	Bacillus Genetic Stock Center	3A1	wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven	VWR	414005-106	for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit	3M	2216 B/A	may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width	3M		to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800N	listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	To clean cover glass
Syring pump, 6 channel	New Era Pump Systems Inc.	NE-1600
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	a brand of dust-free wipes