JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لإظهار كيف يتحقق فوتوكونفيرسيون الخلية من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى مناطق محددة معربا عن البروتين الفلورسنت، ايوس، في الحيوانات الحية.

Abstract

الأنسجة الحيوانية والنباتية تتكون من السكان متميزة من الخلايا. هذه الخلايا تتفاعل مع مرور الوقت لبناء وصيانة الأنسجة، ويمكن أن يسبب المرض عندما تعطلت. وقد طور العلماء تقنيات ذكية للتحقيق في الخصائص والديناميات الطبيعية من هذه الخلايا داخل أنسجة سليمة بالإعراب عن البروتينات الفلورية في مجموعات فرعية خلايا. ومع ذلك، في بعض الأحيان، تتطلب تجارب أكثر التصور المحدد من الخلايا داخل الأنسجة، أحياناً في طريقة وحيدة الخلية أو السكان من الخلايا. لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لخلايا مفردة ضمن عدد خلايا، وقد استخدمت العلماء فوتوكونفيرسيون خلية واحدة من البروتينات الفلورية. وللتدليل على هذا الأسلوب، نعرض هنا كيفية توجيه الأشعة فوق البنفسجية إلى خلية ايوس-الإعراب عن اهتمامها حالها، تعيش الزرد. ثم أننا صورة تلك الخلايا ايوس+ فوتوكونفيرتيد 24 ساعة في وقت لاحق لتحديد كيف غيروا في الأنسجة. يمكننا وصف تقنيات اثنين: واحد فوتوكونفيرسيون الخلايا وفوتوكونفيرسيونس من سكان خلية. يمكن استخدام هذه التقنيات لتصور التفاعلات خلية خلية، والخلية-مصير والتمايز، والهجرات الخلية، مما يجعل من أسلوب الذي يطبق في العديد من الأسئلة البيولوجية.

Introduction

تتفاعل عدة خلايا متميزة لبناء وصيانة الأنسجة الحيوانية والنباتية المعقدة. غالباً ما تكون هذه الخلايا المقحم وصعوبة التمييز بين الدول المجاورة على مستوى خلية واحدة دون الفحص المجهري عالية الدقة التي تتطلب تثبيت أنسجة. بيد نفهم كيف أن هذه النماذج الأنسجة، والحفاظ على، وتصبح المريضة، لقد كان ضرورية للتحقيق في كيفية وحيدة الخلايا داخل الأنسجة تتفاعل مع مرور الوقت. ومن الناحية المثالية، تتطلب هذه التجارب تسمية الخلايا المفردة داخل أنسجة بطريقة غير الغازية دون الشرط للتثبيت. وقد طور العلماء الآن العديد من التقنيات لإنجاز هذه المهمة1،2،،من34.

اكتشاف والتنفيذ للبروتين قنديل أخضر نيون (بروتينات فلورية خضراء) هو أحد النهج مثيرة يسمح بوصفها خلايا متميزة في بيئة أنسجة1. استخدام المروجين خلية على حدة، من الممكن تحديد مجموعة فرعية خلايا المسماة1وراثيا. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تستخدم التعبير المستحث الفيروسية للتجارة والنقل للتعبير المستخدم المحدد من بروتينات فلورية خضراء3،4. على الرغم من أن مفيدة للغاية، التعبير وساطة الوراثية للتجارة والنقل لا يسمح بالتعبير المستخدم المحدد ضمن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة؛ والفيروسية للتجارة والنقل، على الرغم من أن ميزة، يمكن أن يكون التعبير الغازية. مع ظهور مشتقات التجارة والنقل وتقنيات ذكية مثل برينبوو للتعبير عن البروتينات الفلورية متميزة أكثر قليلة داخل الأنسجة، فقد أصبح من الممكن تصور الخلايا المفردة والتفاعلات فيما بينها في نسيج معقد2، 5-ومع ذلك، هذه النهج تسمية الخلايا بطريقة عشوائية. إذا التجربة المرجوة يتطلب تصور خلية مفردة أو السكان من الخلايا التي يتم تعريفها بالمجرب، لذلك محدودة. مع مثل هذه التجارب، وأنه سيكون من المفيد أن يكون بروتين فلوري أعرب وراثيا التي يمكن التلاعب بها للتمييز، بطريقة وحيدة خلية، فمن الخلايا الفلورسنت وغير الفلورية الأخرى.

لتحقيق هذا الهدف، ووضع تصور لبيولوجيا الخلية من الخلايا المفردة داخل أنسجة حية معقدة، يستخدم المجتمع العلمي فوتوكونفيرسيون خلية مفردة متميزة من البروتينات الفلورية6،،من78. استخدام جينياً الخاضعة للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي (أي eos، كايد، إلخ) بالانتقال من أخضر إلى الأحمر الدولة الفلورسنت عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية (488 نانومتر) الخفيفة، يمكننا أن نميز خلية واحدة من به المسمى فلوريسسينتلي الجيران6،،من78. وهذا النهج يستخدم جهاز يلحق بنا مجهر [كنفوكل] الذي يمكن توجيه الضوء من كدسة ليزر لمنطقة حيود محدودة الفائدة. مع هذا الأسلوب، ونحن أما تسمية الخلايا المفردة أو عدد أكبر من السكان في طريقة المعرفة من قبل المستخدم10،،من911. هذا الأسلوب مينيملي مقارنة بحقن خلية مفردة من الفيروسية بروتينات فلورية خضراء. كدليل على المفهوم، نظهر أننا يمكن فوتوكونفيرت الخلايا المفردة داخل العقدة في الجهاز العصبي المحيطي وعدد أكبر من السكان فوتوكونفيرت مثل الخلايا الموجودة في الجانب البطني الحبل الشوكي9،10، 11،12. أننا ثم تصور هذه فوتوكونفيرتيد خلية السكان 24 ساعة في وقت لاحق إلى التبصر في حركتهم والتمايز أثناء التطوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ووافقت جامعة Notre Dame الرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة جميع الدراسات الحيوانية.

1-إعداد العينات الزرد

  1. ضع ذكر بالغ واحد وواحد تيراغرام الإناث الكبار (بروتين القابلة للتحويل) إلى غرفة التزاوج كل الإجراءات القياسية13. في هذه المخطوطة، استخدم Tg(sox10:eos) الأسماك9 بسبب الوصول ولكن الخطوط الأخرى المعدلة وراثيا مع البروتين فوتوكونفيرتيبلي يمكن استخدامها على قدم المساواة. قم بإعداد غرفة واحدة أو أكثر في حال لم تضع الأسماك. السماح للأسماك بالبقاء في الدائرة بين عشية وضحاها.
  2. في صباح اليوم التالي، جمع البيض في أطباق بتري 100 مم. تسمح البيض الناضجة للاخصاب بعد 24 ساعة (hpf) قبل الفحص.
  3. إذا كانت الحيوانات أعلاه heterozygotes للتحوير، الشاشة 24 هبف الأطباق للأجنة Tg(sox10:eos) + مع 488 نانومتر مصدر الضوء وبروتينات فلورية خضراء تصفية مجموعات في مجهر تشريح. عزل Tg(sox10:eos) + الأجنة والسماح لتنضج إلى 48 هبف.
  4. ديتشوريوناتي الأجنة يدوياً باستخدام إبرة أو الملقط.
  5. إعداد والموجات الدقيقة 5 مل من 0.8% الحل [اغروس] نقطة انصهار منخفضة.
    1. مرة واحدة [اغروس] باردة إلى اللمس، ضع تيراغرام 3-4 أنيسثيتيزيد (sox10:eos) + 48 السمك هبف في وسط زجاج 10 مم-ساترة أسفل طبق بيتري.
    2. إضافة [اغروس] ما يكفي لتغطية سطح ساترة، حوالي 1 مل. استخدام إبرة مسبار لترتيب السمك على الجانبين. يسمح [اغروس] ترسيخ لضمان متصاعدة حيوانات. قد يكون من الضروري باستمرار إعادة ترتيب الزرد حتى أجار يتصلب14. ويأخذ التجميد حوالي 2 دقيقة.
  6. بعد وقد توطد [اغروس] لمدة 2 دقيقة، ببطء إضافة المتوسطة الجنين الذي يحتوي على إستر حامض امينوبنزويك 0.02 في المائة (تريكيني) لطبق حتى هي مغمورة السطح السفلي لاجار وطبق. وهذا ينبغي أن يكون حوالي 3 مل.

2-المجهر التركيب والتحويل قبل التصوير

  1. افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "التصوير الأسماك".
  2. ضع العينة على نطاق [كنفوكل] ويجلب إلى التركيز باستخدام مسار والمقابض التكيف غرامة.
  3. فتح إطار التركيز وتحديد المنطقة المطلوب للفائدة (أي العقد الجذرية الظهرية).
  4. حدد الليزر c488 ضمن القائمة "تعيين عامل التصفية". ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].
  5. تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. يمكن زيادة النطاق أو إنقاصه لاستيعاب لعمق منطقة التصوير. للحبل الشوكي هو قيمة تتراوح بين 35-40 مكدسات عادة كافية [الشكل 5].
  6. تحديد الموقع الحالي [الشكل 5].
  7. انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.

3-خلية واحدة فوتوكونفيرسيون

  1. افتح برنامج [كنفوكل] وحدد windows التقاط والتركيز [الشكل 1]. إطار التقاط نافذة، حدد إعداد التحويل الخاصة بمختبر التصوير تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة علامة التبويب [الشكل 1]. هنا، والإعداد الخاصة بمختبر يسمى "الأسماك يجتذ رقاقة كاملة".
  2. حدد الليزر c488 و c541 تحت قائمة "تعيين عامل التصفية". إذا لم تكن تستخدم نفس البرمجيات المجهر، العثور على القائمة لتحديد أشعة الليزر المختلفة وحدد 488 نانومتر و 541 نانومتر الليزر. ضبط التعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 300 والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2]. يتم تحديد هذه الإعدادات الليزر استناداً إلى إنتاج ما يكفي من الإشارات الفلورسنت دون التسبب في فوتوبليتشينج أو سمية. إذا كان هو تصور سمية أو فوتوبليتشينج، تقليل قوة الليزر أو التعرض.
  3. فتح إطار التركيز، وانقر فوق علامة التبويب photomanipulation في إطار التركيز. ضبط معلمات الليزر تبعاً لذلك. تغيير السلطة المكدس الليزر إلى 2 ومن ثم انقر فوق انتقال. تغيير حجم الكتلة النقطية إلى 1، ثم انقر فوق تعيين. قم بتغيير حجم انقر نقراً مزدوجاً فوق إلى 4. قم بتغيير السطر الليزر إلى v405 [الشكل 3].
  4. فتح إعدادات التقاط متقدمة في إطار الالتقاط. حدد علامة التبويب photomanipulation وتغيير التكرار انقر نقراً مزدوجاً فوق 2. انقر فوق "موافق" [الشكل 4].
  5. حدد علامة التبويب تخطيط س وص في إطار التركيز. الاختيار مزدوج المعلمات الليزر من الخطوة 2 في علامة التبويب photomanipulation [الشكل 3، الشكل 4]. تعيين إعدادات الليزر فوتوكونفيرت خلية الفائدة دون فوتوكونفيرسيون للخلايا المحيطة.
    1. في حالة وجود فوتوكونفيرسيون خلايا المجاورة، تقليل قوة الليزر. إذا لم يحدث فوتوكونفيرسيون خلايا، يمكن زيادة صلاحيات الليزر. على النحو الأمثل، تعيين السلطة الليزر فوتوكونفيرت المنطقة الفائدة والمناطق المحيطة بها وليس فقط.
  6. تحقق من مربع timelapse إطار التقاط نوع. ثم، انقر فوق بدء تشغيل [الشكل 6A].
  7. بمجرد فتح إطار timelapse حية، حدد أداة الدائرة على شريط الأدوات أعلى [الرقم 7]
  8. رسم دائرة في منطقة سينتيرموست في الخلية. الحق فوق دائرة مرسومة وحدد المنطقة فراب، وانتظر لمدة 3 ثوان. المساحة المحددة ينبغي أن تصبح باهتة [الشكل 8]. انقر فوق التوقف عن الالتقاط.
  9. إذا كان التصوير أكثر من الحيوان، والعودة إلى علامة التبويب تخطيط س وص في قائمة التركيز وتحديد موقف 2. ثم، كرر الخطوات 4، 1-4.6.
  10. لتحويل عدد خلايا، اتبع معايير البروتوكول والليزر للخطوات 4، 4، 1-4 باستثناء بدلاً من رسم دائرة اربط منطقة الفائدة، استخدم أداة سطر. رسم خط في منطقة اهتمام واربط المنطقة باستخدام نفس المعلمات المذكورة أعلاه.

4-وظيفة-فوتوكونفيرسيون التصوير

  1. بمجرد كافة النقاط فوتوكونفيرتيد. حدد المكدس الصورة القياسية الخاصة بمختبر الإعداد الموصوفة في بريكوفيرسيون التصوير في الخطوة 3. هذا ويوجد تحت الاستيلاء على إعداد القائمة المنسدلة في علامة التبويب في نافذة التقاط [الشكل 5].
  2. حدد الليزر c488 وضبط التعرض إلى 300ms والليزر الطاقة إلى 5، وتكثيف إلى 75 [الشكل 2].
  3. حدد الليزر c541 وجدت تحت نفس القائمة كالليزر c488. ضبط التعرض إلى 500 مللي والليزر الطاقة إلى 10، وتكثيف إلى 75 [الرقم 9].
  4. تحقق من مربع 3D تحت المقطع التقاط نوع . في المقطع التقاط 3D ، حدد استخدام الموقف الحالي والتحقق من النطاق حول الحالية. في نفس القسم، تعيين النطاق إلى 35، عدد الطائرات إلى 36، وحجم الخطوة 1. عدد النطاق قد زيادة أو إنقاص لاستيعاب عمق التصوير المطلوب [الشكل 5].
  5. إذا كانت هناك نقاط متعددة في علامة التبويب التركيز XY، حدد خيار قائمة متعددة في إطار الالتقاط. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتحديد الموقع الحالي.
  6. انقر فوق ابدأ في الجزء السفلي من إطار التقاط للحصول على الصورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمكن استخدام فوتوكونفيرسيون للبروتينات الفلورية لتسمية خلايا مميزة داخل أنسجة6. وللتدليل على ذلك، استخدمت Tg(sox10:eos) الأسماك9 للتعبير عن البروتين فوتوكونفيرتيبلي Eos تحت تسلسل sox10التنظيمية. كانت الحيوانات Tg(sox10:eos) في 48 هبف شنت أول ومن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في الأنسجة المعقدة، تنظيم أنواع الخلايا متميزة في مجالات محددة. واستخدمت تقنيات مؤخرا إلى تسمية الخلايا الفردية داخل هذه الأنسجة الكبيرة هياكل1،،من23. هنا نظهر اثنين من التقنيات التي يمكن استخدامها كذلك لتصور التفاعلات وحيد الخلية والخل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن نشكر برنارد كوليماكا وأعضاء المختبر سميث لتعليقات مفيدة وتوجيهات الكاشف، سام كونيل وريدفورد برنت من 3i لإيفاد التصوير الأسئلة والدوي ديبورا وتعير كارين ستيوارت كاي للرعاية الزرد. أيده هذا العمل في جامعة نوتردام، أن إليزابيث ومايكل غالاغر الأسرة، ومؤسسة الفريد سلون ص، مركز للبحوث الزرد في جامعة نوتردام ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام سيدة. وأجريت جميع الدراسات الحيوانية امتثالا لجامعة نوتردام IACUC للدكتور سميث كودي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tg(sox10:eos) zebrafish animalsFish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dishVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dishTed Pella Inc.14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)Fluka analyticalA5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filtersZeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion405 nm laser
Slidebook software3i
Methylene blueKordon

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved