Sola célula Photoconversion en pez cebra intacto de la vida

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para mostrar cómo photoconversion celular se logra a través de la exposición Ultravioleta a áreas específicas que expresan la proteína fluorescente, Eos, en animales vivos.

Resumen

Tejido animal y vegetal se compone de distintas poblaciones de células. Estas células interactúan en el tiempo para construir y mantener los tejidos y pueden causar enfermedad cuando interrumpió. Los científicos han desarrollado técnicas inteligentes para investigar las características y dinámica natural de estas células dentro del tejido intacto por expresión de proteínas fluorescentes en subconjuntos de células. Sin embargo, a veces, los experimentos requieren más seleccionado visualización de células dentro del tejido, a veces en la forma unicelular o población de células. Para lograr esto y visualizar las células dentro de una población de células, los científicos han utilizado sola célula photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demostrar esta técnica, aquí mostramos cómo a la luz UV a una celda de Eos-expresión de interés en un intacto, vive de zebrafish. Entonces a la imagen de esas células de Eos⁺ photoconverted 24 h más tarde para determinar cómo ha cambiado en el tejido. Se describen dos técnicas: solo celular photoconversion y photoconversions de las poblaciones de la célula. Estas técnicas pueden utilizarse para visualizar las interacciones célula-célula, destino celular y diferenciación y migraciones celulares, lo que es una técnica que es aplicable en muchas de las preguntas biológicas.

Introducción

Varias celdas distintas interactúan para construir y mantener los tejidos animales y vegetales complejos. Estas células son a menudo intercalados y difíciles de distinguir de los vecinos a un nivel unicelular sin microscopía de alta resolución que requieren fijación del tejido. Sin embargo, para entender cómo estas forman los tejidos, se mantiene y se convierten en enfermos, ha sido esencial para investigar cómo solo las células dentro del tejido están interactuando con el tiempo. Idealmente, estos experimentos requieren el etiquetado de células individuales dentro de un tejido de una manera no invasiva sin necesidad de fijación. Los científicos ahora han desarrollado numerosas técnicas para lograr esta tarea^1,2,3,4.

El descubrimiento y la aplicación de la proteína fluorescente de Medusa verde (GFP) es un enfoque interesante que permitió para el etiquetado de distintas células en un tejido medio ambiente¹. Utilizando promotores específicos de la célula, es posible seleccionar genéticamente un subconjunto de las células que llevan la etiqueta¹. Alternativamente, viral inducido expresión de GFP puede ser utilizado para la expresión seleccionada por el usuario de GFP^3,4. Aunque muy útil, expresión génica mediada de GFP no permite expresión seleccionada por el usuario dentro de un subconjunto de las células en el tejido; y viral expresión de GFP, aunque ventajosa, puede ser invasivo. Con la llegada de los derivados GFP y técnicas inteligentes como Brainbow para expresar distintas proteínas fluorescentes más escasamente en los tejidos, es posible visualizar las células y las interacciones entre ellos en el complejo tejido^{2, 5}. sin embargo, estos enfoques etiqueta de células al azar. Si el experimento deseado requiere la visualización de una sola célula o población de células que se define por el experimentador, por lo tanto son limitados. Con tales experimentos, sería ventajoso tener una proteína fluorescente genéticamente expresa que puede ser manipulada para distinguir, en forma unicelular, de otras células fluorescentes y no fluorescentes.

Para alcanzar esta meta y visualizar la biología celular de las células en un tejido complejo de la vida, la comunidad científica utiliza photoconversion unicelular de diferentes proteínas fluorescentes^6,7,8. Utilizando genéticamente controlada expresión de una proteína photoconvertible (es decir, eos, kaede, etc.) que las transiciones de un verde a rojo estado fluorescente cuando se exponen a los rayos UV (488 nm) luz, podemos distinguir una sola célula de su fluorescencia marcada vecinos^6,7,8. Este enfoque utiliza un aparato conectado a nuestro microscopio confocal que puede dirigir la luz de una pila de láser a una región limitada de la difracción de interés. Con esta técnica, o bien podemos etiquetar las células o poblaciones más grandes en una manera definida por el usuario^9,10,11. La técnica es mínimamente invasiva en comparación con las inyecciones de célula de GFP viral. Como una prueba de concepto, demostramos que podemos photoconvert las células dentro de un ganglio en el sistema nervioso periférico y photoconvert poblaciones más grandes como células situadas en el lado ventral de la médula espinal^{9,10, 11,12}. Entonces podemos visualizar estas poblaciones de células de la photoconverted 24 h más tarde para ganar la penetración en su movimiento y diferenciación durante el desarrollo.

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Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Universidad de Notre Dame Animal cuidado institucional y Comité de uso.

1. preparación de la muestra de pez cebra

1. Coloque un macho adulto y una Tg femenino adulto (proteína convertible) en una cámara de acoplamiento por procedimientos estándar¹³. En este manuscrito, utilice Tg(sox10:eos) de pescado⁹ por acceso pero otras líneas transgénicas con proteínas de photoconvertible puede ser utilizado igualmente. Configurar más de una cámara en caso de que no ponga el pescado. Permita que el pescado permanezca en la cámara durante la noche.
2. A la mañana siguiente, recoger los huevos en cajas Petri de 100 mm. Permiten huevos madurar a la fertilización después de 24 h (hpf) antes de la proyección.
3. Si arriba los animales eran heterocigotos para el transgen, platos de pantalla 24 hpf embriones Tg(sox10:eos) + con una fuente de luz nm y GFP 488 filtran de conjuntos en un microscopio de disección. Aislar Tg(sox10:eos) + embriones y dejar para madurar hasta 48 hpf.
4. Dechorionate embriones manualmente con una aguja o unas pinzas.
5. Preparar y microondas 5 mL de solución de agarosa de punto de bajo punto de fusión de 0,8%.
   1. Una vez que la agarosa es fría al tacto, lugar Tg anestesiados de 3-4 (sox10:eos) + 48 peces hpf en el centro de un cubreobjetos de cristal 10 mm plato de Petri de fondo.
   2. Añadir suficiente agarosa para cubrir la superficie del cubreobjetos, aproximadamente 1 mL. Utilice una aguja de punta de prueba para arreglar pescado en sus lados. Permita que la agarosa se solidifique para asegurar el montaje de los animales. Puede ser necesario reorganizar continuamente el pez cebra hasta que el agar solidifica¹⁴. Solidificación tarda aproximadamente 2 minutos.
6. Después de la agarosa ha solidificado por 2 min, lentamente agregar medio embrión que contiene 0.02% éster del ácido paraaminobenzoico (Metanosulfonato) a plato hasta que la superficie del fondo del agar y plato quede sumergida. Este debe ser aprox. 3mL.

2. microscopio montaje y proyección de imagen de conversión previa

1. Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "proyección de imagen de peces".
2. Coloque el espécimen en ámbito confocal y enfocar con el curso y las perillas de ajuste fino.
3. Abra la ventana de foco y localizar la región deseada de interés (es decir, los ganglios de raíz dorsal).
4. Seleccione el láser c488 bajo el menú filtro. Ajustar la exposición a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].
5. Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. La gama puede aumentarse o disminuirse para acomodar la profundidad de la zona de proyección de imagen. Para la médula espinal un valor entre 35-40 pilas normalmente es suficiente [figura 5].
6. Seleccione la ubicación actual [figura 5].
7. Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.

3. single-cell Photoconversion

1. Confocal software abierto y seleccione las ventanas de captura y enfoque [figura 1]. Debajo de la ventana de captura, seleccione conversión específica de laboratorio de imagen bajo la captura ajuste desplegable pestaña [figura 1]. Aquí, el ajuste del laboratorio específico se llama "Pescado ablar chip completo".
2. Seleccione el láser c488 y c541 bajo el menú filtro. Si no utiliza el mismo software del microscopio, encontrar el menú para seleccionar diferentes láseres y seleccione el 488 nm y láseres de 541 nm. Establecer las exposiciones a 300 m, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2]. Estos ajustes del láser son seleccionados basado en la producción de suficiente señal fluorescente sin causar fotoblanqueo o toxicidad. Si se visualiza la toxicidad o el fotoblanqueo, reducir la potencia del láser o la exposición.
3. Abra la ventana de foco y haga clic en la ficha de Fotomanipulación en la ventana de foco. Ajustar los parámetros del láser en consecuencia. Cambiar la potencia de la pila de láser a 2 y a continuación, haga clic en ir. Cambiar el tamaño de bloque de trama 1 y haga clic en establecer. Cambiar el tamaño de doble clic 4. Cambia la línea láser a v405 [figura 3].
4. Abra la configuración avanzada de la captura en la ventana de captura. Seleccione la ficha de Fotomanipulación y cambiar las repeticiones haga doble clic en 2. Haga clic en aceptar [figura 4].
5. Seleccione la ficha XY en la ventana de foco. Verifique los parámetros del láser del paso 2 en la ficha de Fotomanipulación [figura 3, figura 4]. Configuración de láser para photoconvert la célula de interés sin photoconversion de las células circundantes.
   1. Si hay photoconversion de las células adyacentes, reducir la potencia del láser. Si no se produce photoconversion de las células, se pueden aumentar potencias láser. Ajuste óptimo, energía del laser a photoconvert sólo la región de interés y alrededores no.
6. Marque la casilla de timelapse con tipo de captura. A continuación, haga clic en Inicio [figura 6A].
7. Una vez que el timelapse en la ventana, seleccione la herramienta de círculo en la barra de herramientas superior [figura 7]
8. Dibuja un círculo en la región más central de la célula. Haga clic con el botón derecho del círculo dibujado, seleccione región FRAPy espere 3 segundos. El área seleccionada debe convertirse en regulador [figura 8]. Haga clic en Detener captura.
9. Si la proyección de imagen más de un animal, volver a la ficha XY en el menú de enfoque y posición seleccione 2. A continuación, repita los pasos 4.1-4.6.
10. Para convertir a una población de células, siga los parámetros de protocolo y láser para pasos 4.1-4.4 excepto en lugar de dibujar un círculo para FRAP la región de interés, utilice la herramienta de línea. Trace una línea en la región de interés y FRAP la región utilizando los mismos parámetros mencionados anteriormente.

4. post-photoconversion la proyección de imagen

1. Una vez que todos los puntos son photoconverted. Seleccionar la pila de imagen estándar de laboratorio específica ajuste descrito en el paso 3 la proyección de imagen de precoversion. Esto se encuentra bajo la captura ajuste desplegable pestaña en la ventana de captura [figura 5].
2. Seleccione el láser c488 y ajustar la exposición a 300ms, laser de potencia a 5 e intensificar a 75 [figura 2].
3. Seleccione el c541 láser en el mismo menú que el láser c488. Ajustar la exposición a 500 ms, laser de potencia de 10 e intensificar a 75 [figura 9].
4. Marque la casilla 3D en la sección tipo de captura . En la sección 3D de captura , seleccione posición actual y Compruebe la gama alrededor de corriente. En la misma sección, establecer el rango a 35, el número de aviones a 36 y el tamaño de paso 1. El número de rango puede aumentar o disminuir para acomodar la profundidad de imagen deseada [figura 5].
5. Si hay múltiples puntos en la ficha de atención XY, seleccione la opción lista multipunto en la ventana de captura. Si no, seleccione la ubicación actual.
6. Haga clic en Inicio en la parte inferior de la ventana de captura para adquirir imagen.

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Resultados

Photoconversion de proteínas fluorescentes puede utilizarse para etiquetar las distintas células dentro de un tejido⁶. Para demostrar esto, Tg(sox10:eos) pescado⁹ fueron utilizados para expresar la proteína photoconvertible Eos en las secuencias reguladoras de sox10. Los animales Tg(sox10:eos) en 48 hpf fueron montados primero y luego reflejada para detectar cualquier photoconversion no específicos que puede ha...

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Discusión

En tejidos complejos, distintos tipos de células se organizan en dominios específicos. Recientemente se han utilizado técnicas a las células individuales de la etiqueta dentro de estos tejido grandes estructuras^1,2,3. Aquí muestran dos técnicas que pueden utilizarse igualmente para visualizar las interacciones de la célula y las interacciones de población de células dentro de tejidos complejos. La ventaja de la técnica...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon