JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Abstract

רקמה חיה and הצומח מורכב של אוכלוסיות שונות של תאים. תאים אלה אינטראקציה לאורך זמן לבנות ולתחזק את הרקמה והוא יכול לגרום לטטנוס כאשר משובשות. מדענים פיתחו טכניקות חכם כדי לחקור את המאפיינים ואת הדינמיקה הטבעית של תאים אלה בתוך רקמת ללא פגע על ידי הבעת פלורסנט חלבונים בתוך קבוצות משנה של תאים. עם זאת, לעתים, ניסויים דורשים יותר שנבחר ויזואליזציה של תאים בתוך הרקמה, לפעמים על האופן תא בודד או אוכלוסייה-של-תאים. כדי להשיג זאת דמיינו תאים בודדים בתוך אוכלוסייה של תאים, נעזרו מדענים photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט. להפגין טכניקה זו, אנו מציגים כאן כיצד לכוון אור UV לתא Eos-הבעת התעניינות שלם, חי דג זברה. אנחנו מכן תמונה באותם תאים Eos+ photoconverted 24 שעות מאוחר יותר כדי לקבוע איך הם שינו ברקמה. אנו מתארים שתי שיטות: יחיד תא photoconversion ו- photoconversions של אוכלוסיות של התא. שיטות אלה ניתן להמחיש אינטראקציות תא-תא, תא-גורל בידול, ואת נדידת תאים, הפיכתה טכניקה הרלוונטיים בשאלות ביולוגיות רבות.

Introduction

תאים נפרדים מרובים אינטראקציה לבנות ולתחזק מורכבים רקמות. תאים אלה הם לעתים קרובות intercalated, שקשה להבדיל בין שכנים ברמה תא בודד ללא מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הדורשים קיבוע של רקמות. עם זאת, כדי להבין כיצד אלה הטופס רקמות, מתוחזק, ולהיות חולה, זה היה חיוני לחקור איך חד תאים בתוך הרקמה אינטראקציה לאורך זמן. באופן אידיאלי, ניסויים אלה דורשים תיוג של תאים בודדים בתוך רקמה בצורה לא פולשנית ללא הדרישה של קיבעון. כעת, מדענים פיתחו טכניקות רבות כדי להשלים את המשימות1,2,3,4.

לצורך גילוי והיישום של החלבון הניאון מדוזה ירוק (GFP) היה אחד גישה מרגש המותר עבור תיוג של תאים נפרדים ב- הסביבה הרקמה1. באמצעות תאים ספציפיים היזמים, זה אפשרי לבחירת גנטית בתאים המסומנות1. לחלופין, ביטוי מושרה ויראלי של GFP יכול להיות מנוצל עבור המשתמש שנבחר ביטוי של GFP3,4. למרות שימושי למדי, הגנטי בתיווך של GFP אינה מאפשרת המשתמש שנבחר הביטוי בתוך קבוצת משנה של תאים בתוך הרקמה; וניתן ביטוי נגיפי ה-GFP, למרות יתרון, פולשני. עם כניסתו של GFP נגזרים וטכניקות חכם כמו Brainbow לבטא חלבונים פלורסנט ברורים יותר בדלילות בתוך רקמות, זה הפך אפשר לדמיין תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם רקמות מורכבות2, 5. עם זאת, גישות אלה תווית תאים באופן אקראי. אם הניסוי הרצוי דורש ויזואליזציה של תא בודד או אוכלוסיית תאים אשר מוגדרת על ידי הנסיין, הם לכן מוגבל. עם ניסויים כאלה, זה יהיה יתרון יש חלבון פלואורסצנטי ביטוי גנטית אפשר לגרום להם להבחין, באופן תא בודד, זה של תאים אחרים פלורסנט, הלא-פלורסנט.

כדי להשיג מטרה זו, ולהמחיש את ביולוגיה של התא של תאים בודדים בתוך רקמת החיים מורכבים, הקהילה המדעית משתמש photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט ברורים-6,-7,-8. באמצעות גנטית מבוקר הביטוי של photoconvertible חלבון (קרי, eos, קאךה, וכו ') זה המעברים מ ירוקה למצב ניאון אדום כאשר הם נחשפים UV (488 ננומטר) אור, אנחנו. יכולים להבחין תא בודד מן שלה שכותרתו fluorescently השכנים6,7,8. גישה זו מנצל מכשירים המחוברים שלנו מיקרוסקופ קונפוקלי אשר יכולים לכוון את האור מאוסף לייזר לאזור מוגבל עקיפה של עניין. בטכניקה זו, אנו יכולים גם תווית תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות צורה על-ידי המשתמש9,10,11. הטכניקה היא פולשנית בהשוואה לתא בודד זריקות של נגיפי ה-GFP. מהווה הוכחה של המושג, אנחנו מראים שאנחנו יכולים photoconvert תאים בודדים בתוך גנגליון מערכת העצבים ההיקפית, photoconvert אוכלוסיות גדולות יותר כמו תאים ממוקם על הצד הבטני של חוט השדרה9,10, 11,12. אנחנו מכן יכול לדמיין photoconverted תא אוכלוסיות אלה 24 שעות מאוחר יותר כדי לזכות בתובנה שלהם התנועה ובידול במהלך הפיתוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת Notre Dame אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. הכנת דג זברה הדגימה

  1. מקום אחד גבר בוגר אחד למבוגרים נקבה Tg (חלבון להמרה) לתא ההזדווגות לפי נהלי13. כתב יד זה, להשתמש Tg(sox10:eos) דגים9 בגלל גישה אבל קווים הטרנסגניים אחרים עם חלבון photoconvertible יכול לשמש באותה מידה. הגדרת תא אחד או יותר למקרה דגים אל תרים. לאפשר את הדג להישאר בבית הבליעה למשך הלילה.
  2. למחרת בבוקר, לאסוף את הביצים בתוך צלחות פטרי 100 מ מ. לאפשר ביצים להבשיל עד 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לפני ההקרנה.
  3. אם חיות לעיל היו heterozygotes על transgene מסך 24 מנות hpf עבור Tg(sox10:eos) + העוברים עם 488 ננומטר מקור אור ואביזרים GFP לסנן סטים על מיקרוסקופ ויבתר. לבודד Tg(sox10:eos) + עוברי ולאפשר להבשיל ל-48 hpf.
  4. Dechorionate עוברי ידנית עם מחט או פינצטה.
  5. הכנה של מיקרוגל 5 מ של 0.8% פתרון agarose נקודת התכה נמוכה.
    1. לאחר agarose קרירות למגע, מקום 3-4 Tg anesthetized (sox10:eos) + 48 hpf דגים במרכז זכוכית 10 מ מ- coverslip בתחתית צלחת פטרי.
    2. הוסף agarose מספיק כדי לכסות את פני השטח של coverslip, כ 1 מ"ל. שימוש במחט בדיקה לסדר את הדג על הצדדים שלהם. לאפשר agarose לגבש כדי להבטיח הרכבה של בעלי חיים. יתכן צורך ללא הרף לארגן את דג זברה מחדש עד אגר עפור14. התמצקות לוקח כ 2 דקות.
  6. לאחר agarose התחזק למשך 2 דקות, להוסיף לאט העובר בינוני המכיל 0.02% חומצה aminobenzoic אסתר (Tricaine) לדרוש עד מהמשטח התחתון של אגר, מאכל שקוע. זה צריך להיות כ 3 מ.

2. מיקרוסקופ הרכבה והדמיה מראש המרה

  1. פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דגים הדמיה."
  2. במקום הדגימה על היקף קונאפוקלית ולהביא להתמקד באמצעות קורס וידיות התאמת משובח.
  3. פתח את החלון המוקד ואתר האזור הרצוי של הריבית (כלומר השורש העזוב הגרעינים).
  4. בחר את הלייזר c488 תחת תפריט להגדיר מסנן. הגדר את החשיפה 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].
  5. סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. הטווח שניתן עלה או ירד כדי לאכלס העומק של אזור ההדמיה. עבור חוט השדרה ערך בטווח בין 35-40 ערימות היא בדרך כלל מספיק [איור 5].
  6. בחר במיקום הנוכחי [איור 5].
  7. לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.

3. תא בודד Photoconversion

  1. פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דג ablate שבב מלא".
  2. בחר הלייזר c488 ו- c541 תחת תפריט להגדיר מסנן. אם אינך משתמש בתוכנה מיקרוסקופ זהה, למצוא תפריט כדי לבחור לייזרים שונים, בחר 488 ננומטר, לייזרים nm 541. הגדר את חשיפות 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2]. הגדרות אלה לייזר נבחרו על סמך הפקת מספיק אותות פלואורסצנט מבלי לגרום photobleaching או רעילות. אם רעילות או photobleaching הוא מדמיין, להפחית את עוצמת הלייזר או חשיפה.
  3. פתח את החלון המוקד ולחץ על הכרטיסיה photomanipulation בחלון המוקד. להתאים את הפרמטרים לייזר בהתאם. לשנות את עוצמת הלייזר מחסנית ל- 2 ולאחר מכן לחץ על ללכת. לשנות את גודל הבלוק רסטר 1 ולחץ על הגדר. לשנות את גודל פעמיים ל- 4. לשנות את קו לייזר v405 [איור 3].
  4. פתח את קביעות הלכידה מתקדמות בחלון הלכידה. בחר את הכרטיסיה photomanipulation ולשנות את מספר החזרות פעמיים 2. לחץ על אישור [איור 4].
  5. בחר את הכרטיסיה XY בחלון המוקד. בדוק את הפרמטרים לייזר משלב 2 בכרטיסיה ' photomanipulation ' [איור 3, איור 4]. קבע את הגדרות לייזר כדי photoconvert התא של הריבית בלי photoconversion של התאים שמסביב.
    1. אם photoconversion של תאים סמוכים, להפחית את עוצמת הלייזר. אם photoconversion של תאים לא התרחשה, כוחות לייזר יכול להיות מוגברת. בצורה אופטימלית, הגדר עוצמת הלייזר photoconvert רק האזור של עניין לא ובסביבותיו.
  6. סמן את התיבה timelapse תחת ללכוד את סוג. לאחר מכן, לחץ על התחל [איור 6A].
  7. לאחר פתיחת החלון timelapse בשידור חי, בחר בכלי עיגול בסרגל הכלים העליון [איור 7]
  8. לצייר עיגול באזור centermost של התא. קליק ימני המעגל מצוירות, בחר אזור FRAPוהמתן 3 שניות. האזור שנבחר צריך להיות דימר [איור 8]. לחץ על עצור לכידה.
  9. אם הדמיה חיה יותר מפעם אחת, לחזור אל הכרטיסיה XY המוקד תפריט, בחר במיקום 2. . אז, חזור על השלבים 4.1-4.6.
  10. כדי להמיר אוכלוסיה של תאים, בצע את הפרמטרים פרוטוקול ו לייזר עבור שלבים 4.1-4.4 למעט במקום לצייר עיגול FRAP האזור של הריבית, השתמש בכלי שורת. צייר קו על האזור של הריבית, FRAP האזור באמצעות אותם פרמטרים המפורטים לעיל.

4. פוסט-photoconversion הדמיה

  1. לאחר כל נקודות photoconverted. בחר הערימה תמונה רגילה מעבדה ספציפי הגדרת שמתואר precoversion הדמיה שלב 3. זה נמצא תחת התפיסה הגדרת הנפתחת tab בחלון לכידת [איור 5].
  2. בחר את הלייזר c488, להגדיר את החשיפה 300ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].
  3. בחר את הלייזר c541 נמצא תחת התפריט כמו הלייזר c488. הגדר את החשיפה 500 ms, לייזר כוח 10, ולהגדיל ל 75 [איור 9].
  4. סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. המספר טווח עשויה להגדיל או להקטין כדי להתאים את עומק ההדמיה הרצויה [איור 5].
  5. אם ישנן נקודות מרובות בכרטיסיה המוקד XY, בחר באפשרות רשימת רב-נקודתי בחלון הלכידה. אם לא, בחר במיקום הנוכחי.
  6. לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Photoconversion של חלבונים פלורסנט ניתן לסמן תאים נפרדים בתוך רקמת6. כדי להדגים את זה, Tg(sox10:eos) דגים9 שימשו כדי להביע את החלבון photoconvertible Eos תחת רצפי רגולטוריות sox10. החיות Tg(sox10:eos) של 48 hpf היה רכוב קודם ולאחר מכן עם תמונה כדי לזהות כל photoconversion שא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ברקמות מורכבות, סוגי תאים נפרדים לארגן לתחומים ספציפיים. לאחרונה כבר מנוצל טכניקות תווית בתאים בודדים בתוך אלה רקמות גדולות מבנים1,2,3. כאן נדגים שתי טכניקות באופן דומה יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תא בודד אינטראקציות והן תא אינטראקציות הא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ברנרד Kulemaka וחברי המעבדה סמית שלהם הערות מועילות והדרכה ריאגנט, סאם קונל, ברנט רדפורד של 3עכשיו עבור פילדינג הדמיה שאלות, דבורה באנג, קארן הקשבה, קיי סטיוארט לטיפול דג זברה. עבודה זו נתמך על ידי את אוניברסיטת נוטרה דאם, האליזבת, מייקל משפחה, אלפרד פ סלואן קרן, מרכז מחקר דג זברה אוניברסיטת נוטרה, מרכז של תאי גזע, רפואה רגנרטיבית-אוניברסיטת נוטרה דאם. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל נעשו בהתאם אוניברסיטת נוטרה דאם IACUC ד ר קודי סמית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tg(sox10:eos) zebrafish animalsFish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dishVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dishTed Pella Inc.14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)Fluka analyticalA5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filtersZeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion405 nm laser
Slidebook software3i
Methylene blueKordon

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

133photoconversion

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved